畜 牧 兽 医 学 报 卷 / ///0(// / / /'8 / /( (/ /( / ' (( 7 0 ( /0 /0 // / ( / " '8 " '8 '" '8" '8 / / % ( / " '8%/ //& ' 3" 0( / / " '8 ' /-3/' %- / // // '

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1 畜牧兽医学报 猪日本乙型脑炎病毒 7 复制子载体的构建及外源基因表达分析 王晓杜 赵凡凡 代 兵 邵东华 蒋春英 周 圻 马志永 浙江农林大学动物科技学院 临安 中国农业科学院上海兽医研究所 上海 摘 要 猪日本乙型脑炎病毒 '8 是引起以母猪流产为主要特征的繁殖障碍性疾病病原之一 笔者拟构建 '8 的 ;" 型复制子载体 并利用该载体表达外源基因 以 '8 毒株 " 为基础 去除病毒结构蛋白基因 和部分 基因而保留全部非结构蛋白和非编码区序列 插入 %9;8" 和丁肝病毒核酶序列构建复制子表达载体 " '8 实时定量 -3 间接免疫荧光 6/ / ( 方法检测 '8 自身蛋白 表达 验证复制子的自主复制能力 在 " '8 的结构蛋白 基因下游插入 ' 基因 猪流感病毒的 和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的 基因构建重组复制子 " '8 ' " '8 " '8 和 % 基因缺失载体 " '8% 该复制子载体转染 & 荧光显微镜直接观察 ' %- 表达 6/ / ( 方法检测外源蛋白质 %-- " 表达情况 结果表明 随着转染时间延长 复制子转染细胞内 的表达逐渐增加 表明所构建的 '8 复制子表达载体具有自主复制能力 ' 3" 转录水平和 ' %- 蛋白质荧光信号随着转染时间的延长逐渐增加 并且荧光信号可持续 以上 携带猪流感病毒的 和猪繁殖与呼吸综合征病毒的 基因的复制子载体转染 & 细胞后 " 和 - 能有效表达 说明复制子具有表达外源蛋白质的能力 该复制子表达载体的成功构建 为深入研究 '8 各蛋白质的功能 各蛋白质与细胞内蛋白质相互作用关系以及基于复制子载体的疫苗开发等提供了技术平台 关键词 乙型脑炎病毒 复制子 表达载体 " - 中图分类号 文献标志码 " 文章编号 %7 & ' ''% ''%0 ' ( 6" " % ;"& ( " ; ( "( 9" ( &07' ( - /( "((& ( / 0 '8 / ( // ( / ///;" 0///(( &/ '8"E0 ///(( / ( E 0 //-3 / / /// (( ( E(" '8// / %9;8" ;87 E// // / / / /// %// / / ( / 收稿日期 基金项目 浙江省自然科学基金 > 浙江省十二五重点学科动物营养与饲料科学 浙江农林大学发展基金 %3 作者简介 王晓杜 男 湖北红安人 副教授 博士 主要从事人畜共患病病毒分子生物学研究 '( 通信作者 周 圻 '7E 马志永 ' 7 (0

2 畜 牧 兽 医 学 报 卷 / ///0(// / / /'8 / /( (/ /( / ' (( 7 0 ( /0 /0 // / ( / " '8 " '8 '" '8" '8 / / % ( / " '8%/ //& ' 3" 0( / / " '8 ' /-3/' %- / // // ' %- (/ " 7 0 -/0 /0//(/" -/ 6/ / ( ///" - &'8( " '8 / / '8( / 0 / / // / / 0/ ;"0 ( '8 0/" - 病毒复制子指完全或部分去除病毒结构蛋白基因 保留与复制相关的非结构蛋白基因的病毒亚基因组 该亚基因组具有自主复制并表达病毒自身非结构蛋白及插入的外源蛋白质的能力 但是不包装出具有感染性的病毒粒子 病毒复制子不仅是研究病毒基因结构与功能技术平台 也是表达外源蛋白 质及研发疫苗的新型手段 目前报道已经构建成功的复制子有甲病毒 小 3" 病毒 黄病毒 冠状病毒等 3" 病毒的复制子 其中研究最为成熟的是甲病毒复制子 已作为真核表达载体研制成功 并且进行商业化生产 虽然以甲病毒复制子为基础的新型疫苗能较好的产生免疫力 保护动物免受感 染 然而甲病毒复制子对细胞毒性较强而导致细胞很快发生凋亡 所以其不能持续表达外源蛋白质 黄病毒复制子能克服上述缺点 主要表现在以下几个方面 由于黄病毒复制子细胞毒性很小 能在细胞内复制数十天 另外黄病毒属病毒的 3" 聚合酶保真性较高而保证黄病毒属病毒复制子作为疫苗载体时免疫原性较稳定 黄病毒属病毒复制子的 3" 相对较小 便于遗传操作 因此 黄病毒属病毒复制子的研究将在基础研究和疫苗开发研究方面极具价值 猪日本乙型脑炎病毒 / 0 '8 是黄病毒科 '& 黄病毒属 ' ( 重要的成员之一 同属病毒还包括黄热病毒 0 0>%8 蜱传脑炎病毒 / 4/ 0&'8 和登革热病毒 ;(0;'8 等 '8 病毒粒子直 径约 病毒基因组为单股正链 3" 长约 4 包含一大的开放阅读框 合成一条长的肽链 在细胞内蛋白酶的作用下 合成病毒的结构蛋白 基质蛋白 9 囊膜蛋白 ' 和 个非结构蛋白 " & "& '8 基因组 端有 型帽子结构 " 端不携带多聚腺苷酸尾 基因组 和 末端核苷酸都可形成高度保守的二级结构 其与病毒的复制 密切相关 % % 基因编码的复制酶复合体对病毒基因组复制和蛋白质翻译是必须的 作者通过改造本课题组前期构建的 '8 弱毒株 " 感染性克隆 去除其部分结构基因 及 构建以 98 为启动子的 '8 复制子载体 " '8 插入外源基因 验证该载体具有自主复制能力和外源蛋白质表达效果 为开发新型疫苗和研究 '8 的复制机制提供技术基础 材料与方法 材料与仪器 含有 '8 疫苗株 " 的基因片段质粒 '8 由作者实验室提供 质粒 &/ ;"' %- 低拷贝质粒 " > 由作者实验室保存 小鼠抗 '8 多克隆抗体由作者实验室制备 主要试剂 3-3 试剂盒 03 酶 限制性内切酶购自 3 公司 / % 羊抗小鼠 (3- 羊抗小鼠酶 ( 各种血清和细胞培养用培养基购自 0/( 公司 质粒提取试剂盒

3 期 王晓杜等 猪日本乙型脑炎病毒 ;" 复制子载体的构建及外源基因表达分析 ;" 片段胶回收试剂盒 ;" 片段快速纯化试剂盒购自 ( 公司 常规试剂为国产分析纯 含 启动子的 复制子载体 '3 的构建 '8 复制子载体 " '8 缺失载体 " '8% 的结构如图 构建方法如下 以低拷贝质粒 "> 为骨架 引入新的酶切位点 &3 99 将 98 启动子插入新引入的酶切位点 & 3 间 之后分别将 '8 结构蛋白 基因 %9 ;8" 插入 3 和 酶切位点间 命名该质粒为 "98%" 再以 '8 为模板 用 % 及 3 扩增 '8 非结构蛋白 用 % 及 333 采用延伸 -3 方法获得 ;837 融合片段 将 个片段保存于 备用 利用 9 和 9 将 ; 837 连接到 &/ 上并命名为 &;837 以 % 和 9 为酶切位点将 " 连接到 & ;837 连接产物鉴定正确后经 9 和 9 双酶切再连接到 "98%" 上 将其命名为 "'8 最后利用 和 9 将 连接到 "'8 上 将最终的复制子载体命名为 " '8 为了证明 " '8 的自主复制能力 利用突变 -3 的方法 使得 " '8 的 % 基因缺失 构建 " '8% 质粒 扩增相关序列引物见表 表 扩增引物序列 %% ' 引物 - 核苷酸序列 / E 用途 " / 98% 983 "" "" "" """ " " " " 98/ %"% %"3 %"3 %"3 """ "" " """"" """ 3( %;98" " """" """" """ "" """ " "" % 3 % """" " "" " """ """ "" " " """""" " """"" " "" "" " " """ ;837 -"% " " -"3 " " "" " " -" ' %-% """ "" ' %- ' %-3 "" "" "% "3 -% -3 """ "" "" " """"" """ """ "" """ " " """ " - 字母下划线表示是限制性内切酶的位点 用途中的数字为其在 '8" 基因组中的碱基位置 /// // / / //( '8 /" / 转染 " 3 细胞 利用 " '8 质粒 将质粒 ( 转染 & 细胞 具体方法参照 / 说明书 通过方阵试验确定质粒与脂质体用量的最佳比值

4 畜 牧 兽 医 学 报 卷 之后将质粒染至 孔板单层 & 细胞 以 " > 空质粒为阴性对照 含 ( 报告基因复制子的构建及表达检测 以 ' %- 为模板 设计合成两条引物 ' %-%3 表 -3 扩增获得 ' 基因 利用 和 双酶切与 " '8"'8 相连接并命名为 " '8 ' "'8 ' 测序验证后 / 转染 & 同时以空载体 "> 为阴性对照 并在转染后 开始 每隔 在荧光显微镜下观察荧光变化 &3& 检测复制子中 ( 的转录能力 重组载体 " '8' %-"'8' %- 分别转染 & 细胞 转染后 收取细胞样品提取 3" 经 ; 消化后取 ( 总 3" 进行反转录 -3 反应 荧光定量 -3 检测 ' 基因片段引物序列 %"" " "" """"" 3" "" " """ 对每个样品设定 次重复 以 作为内参基因 相对定量方法计算其 3" 量的相对转录量 - 和 检测复制子非结构蛋白的表达 将细胞传代于放置盖玻片的 细胞培养 皿中 细胞长至 时转染 " '8 质粒 ( 分别于转染后 收取相应时间点的盖玻片 阴性对照和阳性对照 收取 %" 操作过程 细胞片经甲醇 冷丙酮 固定 -& 洗涤 次 &" 封闭 -& 清洗 次 每次 用 稀释的小鼠抗 '8 多抗 孵育 -& 洗 次 每次 用 稀释的 % 羊抗小鼠 ( 为二抗 孵育 & 洗 次 每次 ;"- 室温染色 & 清洗 次之后用封片剂将盖玻片固定于载玻片上 荧光显微镜观察 用 / 转染 " '8" '8% 图 ">" '8 " '8 质粒至 内 & 细胞中 以感染 '8 细胞为阳性对照 正常细胞为阴性对照 收取细胞样品 离心沉淀细胞 裂解液和超声破碎提取细胞总蛋白质 &" 法测蛋白质浓度 取 ( 总蛋白质进行 ;-" ' 电泳 之后将蛋白质电转至 膜进行 6/ / ( 将 膜在小鼠抗 '8 稀释 多抗中 孵育过夜 & 洗 次 每次 羊抗小鼠 3- 酶标记的二抗 稀释 室温孵育 & 洗 次 每次 ' 试剂盒进行显影 并把显出来的胶片进行计算机扫描 保存和编辑图片 98 人巨细胞病毒启动子序列 丁肝病毒核酶序列 -" 牛生长激素基因的多聚腺苷酸序列 %9;8" 口蹄疫病毒 " 蛋白质序列 虚线框内表示基因序列被敲除 98 /(0/ E ;8 7 E ;837-"& "%9;8" %//0" /E / ( E// 图 复制子及相关载体结构示意 - % % '

5 期 王晓杜等 猪日本乙型脑炎病毒 ;" 复制子载体的构建及外源基因表达分析 结 果 复制子相关载体 '3'3 '3 3' '3 3( '33( '3 3 和 '3 3' 和 的构建 将 98 启动子 ;837 -" 终止子等元件引入质粒 "> 中 在课题组此前构建的 '8 感染性克隆的基础上 去除 '8 结构蛋白 9 和 ' 构建了保留全部非结构蛋白的 '8 复制子载体 " '8 图 为方便后续试验的对照 再通过 -3 方法缺失掉 % 羧基端部分基因序列而构建的质粒 " '8 图 在 "'8 和 " '8 复制子的基础上 利用 和 酶切位点 引入 ' 基因 构建 " '8' %- "'8' %- " '8" " '8 - 质粒 在 " '8 的基础上 插入 基因构建 " '8" " '8 - 质粒 以上构建的质粒均通过酶切 测序鉴定无误后进行下一步试验 图 展示了部分质粒构建示意 - 验证复制子非结构蛋白的表达情况 将 " '8 转染至 & 细胞 分别在 取出盖玻片 以小鼠抗 抗体为一抗 进行 %" 检测 试验结果表明 时大多数细胞已经表达 '8 的 蛋白 图 " 病毒蛋白质位于细胞质 随着时间的延长 荧光的亮度有所增加 图 " 说明 '8 复制子具有自主复制能力 阳性对照组 '8 感染 几乎全部细胞都有较强的荧光信号 图 ; 而阴性对照组 转染 " '8 质粒 细胞内无荧光信号 图 ' 该结果表明 " '8 复制子具有自我复制能力 / 检测复制子 '3 的非结构蛋白表达 载体 " '8" '8 分别转染 & 同时设置阳性 '8 感染 阴性对照组 空白的 & 细胞 转染 后收取细胞样品进行 6/ / ( / 作为蛋白质样品上样量对照 结果表明 转染 后 " '8 复制子载体还能表达 '8 蛋白 图 而对照的 " '8 质粒转染的细胞中 由于 '8 复制的重要酶 的缺失 复制子的亚基因组复 制能力受阻 也就无法进行表达 该试验进一步证明复制子 " '8 具有自我复制能力 ' 复制子表达报告基因 ( 复制子载体 " '8 和带有报告基因 ' 的 " '8' %- 质粒各 ( 依据转染试剂盒说明书上的方法 利用 / 将质粒转染进 & 细胞 转染后每隔 将转染样品置荧光显微镜下观察一次 连续观察 结果显示 转染 后即出现绿色荧光 该荧光可持续 左右 图 并且荧光亮度逐渐增加 但是由于细胞培养时间的延长 期间发现部分阳性细胞变圆死亡现象 该试验说明复制子载体 " '8 具有表达外源基因的能力 &3& 验证 复制子表达外源基因的能力 '8 复制子 " '8 ' 和 "'8 ' 转染 & 细胞 和 后 收集细胞提取细胞 3"3-3 合成 ;"3 /-3 检测样品中的 ' 和 转录水平 结果显示 '8 复制子转录 ' 的 3" 量随着转染时间的延长呈逐渐增长趋势 ' 3" 转录量在不同时间相对于阴性对照分别上升 倍 倍 倍 和 倍 而阴性对照组 " '8 ' 中 3" 的转录量几乎没有变化 图 该试验进一步说明复制子载体 " '8 具有表达外源基因的能力 基于 复制子 '3 的外源基因 和 表达检测 为了验证 '8 复制子表达外源基因的能力 携带猪繁殖与呼吸综合征病毒的 基因载体 " '8 和猪流感病毒 基因载体 " '8 分别转染 & 细胞 设定转染 " '8 质粒样品为阳性对照 设定转染 " '8% " '8% " '8% 质粒样品作为每一组的阴性对照 分别利用小鼠抗 - 和 " 抗体进行检测 小鼠抗 '8 抗体作为 '8 复制子的复制能力指示 / 作为蛋白质样品上样量对照 结果表明 - 和 " 都能在 & 细胞内表达 '8 复制子也能进行自主复制 图 该试验证明复制子载体 " '8 可以作为新型疫苗载体工具 开展多价疫苗的研究

6 %% 畜牧兽医学报 卷 4' \9V 转染 0> 样品' 8' \9V 转染 (> 样品' 6' \9V 转 染 0> 样 品' Y'阳 性 对 照 " \9V 感 染 细 胞 (>' 9'阴性对照"转染 S\9V 4' 3;K \9V; K -0>' 8' 3;K \9V; K -(>' 6' 3;K \9V; -0>' - Y' E H " \9V "8C[ 0% ; (>' 9'D@; H " K K S\9V 图 间接免疫荧光检测 _N[ 复制子载体非结构蛋白的表达" %"\ E ' 0 ( ( 3 (( ( 9 0>@ 7>; (6 9 ( 9K _N[>@(0-667 ;D ( 7 ( %'阴性对照' 0'转染 '转染 '阳性对照" \9V 感染细胞 \9V 样品' \9VD3 样品' %' D@; H ' 0' 6 M ;- "M > \9V' ' 6 M ;- "M > \9VD3' ' E \9V "8C[ 0% H " 图 S (> (;检测非结构蛋白 UC 表达量 E ' 0 ( ( 9 ( 3 (( (>@ S (> (; ;D \9V9N7E 质 粒 后 %0> 46'转染 (> (" 的 荧 光' \9V 质粒 Y'阴性对照"转染 46' 8C[ 0% ;- - M > \9V9N7E; ; - %0 >( >( "'Y'D@; H K " 8C[ 0% ;- -M > \9V 图 % 复制子 9K 在 J4 细胞的表达" % "\ E %N9 ( 3 NHEB9 (>@_N[ 7>; (6 ;D 9 ( 9K _N[@36(J4 %"\ 7-6 ( ( " \9V;D9> 质 粒 样 品' 表 示 转 染 表 示 转 染 ( S\9V;D9> 质 粒 样 品'两 组 分 别 在 转 染 0 后收集样品 0 /> B> -" ; " / -" ; " S\9V;D9>' ;K M@ JKM "; K ;- -0 ( 0 /> 图 8-6BK8 检测复制子在细胞内 8U 量的变化 E O (;3(; (67( 9 ( 8U( ;D >@8-6BK8

7 期 王晓杜等 猪日本乙型脑炎病毒 ;" 复制子载体的构建及外源基因表达分析 复制子保留了结构蛋白 全基因序列 并在 基因序列的后面添加口蹄疫病毒的 " 蛋白基因序列 %9;8" 其作用是利于细胞内的蛋白激酶将有效地分开结构蛋白 和后面多克隆位点插入的 外源蛋白质 本研究的复制子还保留 ' 蛋白基因羧基端 个碱基 这段序列的存在保证了 '8 " '8% 样本 " '8 样本 " '8% 样本 " '8 样本 " '8% 样本 " '8 样本 " '8% " '8 " '8% " '8 " '8% " '8 图 携带外源基因 和 复制子在 " 3 细胞中的表达 - ' " 3 ( ' / 讨 论 病毒复制子作为能自主复制的病毒亚基因组 是研究病毒复制机制及研发新型核酸疫苗的理想工具 目前病毒复制子存在两种形式 ;" 型复制子和 3" 型复制子 目前已经构建成功的多个黄病毒都是 3" 复制子 如 68 >%8 ( '8 虽然 3" 复制子能成功进行体外复制 但是它具有操作繁琐 不稳定等缺点 但是 仍有部分构建的复制子应用到疫苗研究 ;" 复制子采用 98 启动子和 & " 尾巴作为转录元件 无需进行体外转录 可直接转染细胞进行表达 并且能作为 ;" 疫苗直接进行免疫动物 在疫苗研究方面具有良好的应用前景 等将病毒复制子成功应用到甲病毒快速检测中 这为病毒复制子应用拓展了新的思路 '8 病毒为单股正链 3" 病毒 其复制特点为非结构蛋白 组装成复制相关酶 可以完成病毒亚 基因组的复制 因此本研究利用该特点构建能自主复制的 '8 复制子 本研究中作者以 '8 弱毒株 " 感染性克隆为基础 构建了 '8 的 ;" 型复制子表达载体 选用 98 为启动子 &" 为终止子以保证复制子亚基因组的转录起始和终止 亚基因组中去除结构蛋白基因 9 和 ' 避免病毒粒子的包装 降低生物安全风险 由于有文献报道结构蛋白 的完整性会对病 毒的复制产生一定的影响 因此本研究构建 '8 蛋白的正确剪切和加工 同时也有利于病毒复制酶的正确切割和组合 为使 '8 复制子亚基因组的 端呈天然病毒 3" 状态 在 '8 3 后端添加丁肝病毒核酶 ;837 识别序列 保证 '8 复制子 3" 的 3 的正确性 有利于相关酶的识别 从而保证复制子亚基因组的复制 在本研究中 为了验证该复制子载体自主复制能力 利用 蛋白作为指示 间接免疫荧光和 6/ / ( 检测 转染后 表达逐渐增加 因为 蛋白是 '8 关键的复制 酶 将其缺失后病毒无法进行自主复制 蛋白基因缺失组 " '8 无法检测到 的表达 同时本研究也利用 3 /-3 检测了 '8 复制子的 3" 转录情况 结果也说明随着转染时间延长 复制子组 的 3" 转录水平逐渐增加 数据没有显示 以上结果说明 '8 复制子 " '8 具有自主复制能力 '8 复制子具有持续表达外源蛋白质 ' %- 能力 并可以一直持续到 以后 图 国内外学 者有相似的研究结果 但是本研究所构建的复制子为 ;" 型复制子 98 为启动子 & " 为终止子 具有来源简单 质粒来自大肠杆菌 操作方便 不需要体外转录和 3" 的纯化 表达外源蛋白质稳定 - 和 " 等其他病毒蛋白质也能表达 图 该特点将有利于研究开发多联疫苗 也为研究 '8 复制机制提供新的工具 结 论 基于 '8 的 " 毒株成功构建 ;" 型复制子载体 各种不同方法证明该复制子 " '8 具有自主复制能力 在该复制子中插入外源基因 ' 都能在细胞中表达 并且表达持续时间可达到 以上 证明该复制子具有较强表达外源蛋白质能力 本研究构建的复制子将为研究 '8 各病毒基因和蛋白质功能及复制子多价疫苗研究奠定了基础和提供新的工具

8 畜 牧 兽 医 学 报 卷 参考文献 & 8"3"8 " > > " "/ ( 0/(( // ;" 0 0/ 李世华 李晓峰 秦鄂德 等 昆津病毒复制子 一种新型病毒载体 生物工程学报 % ' ; / 0 000/( 8";'3 8'' 3 >"" " 9 '3 9 " / / ( / ((/0 余云舟 俞炜源 黄病毒属病毒复制子载体研究进展 生物技术通报 > > > 6 >3 0 / 3" 3 0/000 汤德元 王 凤 马 萍 等 乙型脑炎病毒贵州分离株 基因原核表达及其免疫原性的研究 畜牧兽医学报 " ; >6" %9" - // 4/ ( / '( / 07 // 3 L M' ;"&"3 / / 0 (/ / (" - >'3 9 9 // / 7 / (>4 / 6/ 0 ' -" "3 3 / / / > " "6'"6"> ' ( /00 // / 黄 莺 邵 炜 贾丽丽 等 日本脑炎病毒 '8 复制子表达载体的构建及其鉴定 病毒学报 " >" 6 " /// / ( 0/ / 0( 杨 鹏 新型 '8 复制子载体的构建及表达炭疽 -" 的 '8 复制型 ;" 载体的免疫原性研究 ; 北京 中国人民解放军军事医学科学院 >" -// /'8 0 / /( / '8 /0 ;"0/(-" ( ( ; & (" 9 / 9 " % %> ; /" ;" 6/ 0/ &( " > >" - /3 / 00 / &( -9" -3&'3 " 3 9> " " 03" // 00/ / / / 0 ( / / 0 >" / 0 %/'0 / 0 / ( /% ' /(/( 66" /3/ / 0 / /( /0 / ( - 9" " 8%3 8- // 7 / 000 /0 / ; '> 9 ' '' / "0 ( /0/// 0" / / // /( "" 4 E -'33 " " &'' 9 ; 0 ( /(3"// / 0 EE / / / / / % &(/( > %"'&'% ' /// / 7 / 3"/3" /0/ / / 0 / 编辑 白永平

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中 国 畜 牧 兽 医 卷 绵羊肺炎支原体 #)/ 是引起绵羊和山羊呼吸道疾病的一种重要 病原菌 该病原菌感染动物机体后 还可引起其他病原菌的继发感染 给养羊业造成巨大的经济损 失 支原体是介于病毒与细菌之间的一种微生物 对培养条件要求严苛 目前 的培养仍是一大难题 严重影响了人们对其病原特性 致 中国畜牧兽医! " # 绵羊肺炎支原体 1 蛋白 端与 端的表达及其免疫学特性研究 麻昌姣 郑佳琪 黄海碧 王晓晖 白 帆 郝永清 内蒙古农业大学兽医学院微生物与免疫实验室 呼和浩特 摘 要 为分析绵羊肺炎支原体 "#) 膜表面脂蛋白 ( 的免疫学特性 本研究分别扩增 ( 蛋白 / 端与 端的基因 并通过重叠延伸 + 将 端基因序列中的 0 3B ( 定点突变为同义密码子 将扩增的基因片段分别插入到

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