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1 中国生物工程杂志! "# 过表达转基因小鼠质粒构建及其功能验证 马 纪 # 孙奋勇 张 越 # # 洪 岸 暨南大学生物工程研究所 广州 %& 上海市第十人民医院 上海 ' 广东省生物工程药物重点实验室 广州 %& # 基因工程药物国家工程研究中心 广州 %& 摘要 目的 比较两种 ($ 转基因小鼠过表达载体构建方法 为建立 ($ 过表达转基因小鼠奠定基础 方法 )( 扩增长约!*+ 的 +, $ ($ 的序列 分别定向克隆到 +(-./ $ 01) 载体 01) 基因上游内含子或下游 ( 区域 两种质粒分别转染! 细胞 $)( 检测 ($ 和 01) 的表达水平 并观察 01) 绿色荧光 ($,, +,, 是将个 ($ 成熟序列的反义序列串联克隆至 + 23 载体 4, ( 中 然后分别与 种 ($ 过表达质粒载体共转染! 细胞 最后检测荧光素酶活性来鉴定 ($ 调控功能 结果 种构建方法的 ($ 表达水平都明显增高 而只有插入到 01) 基因 ( 的质粒表达 01) 功能正常 结论 构建,(5. 过表达载体时,(5. 位于报告基因 ( 区域不会影响,(5. 和报告基因的功能 构建的两种 ($ 过表达质粒载体都可应用到转基因小鼠研究中 而将 ($ 插入到 01) 下游的方法则更利于 ($ 的表达 关键词 ($ 过表达 6,, +,, 转基因小鼠中图分类号 '",(5. (5. 是由约 " 7 # 个核苷酸组成的内源的 保守的 非编码的小分子 (5. 它广泛存在于动植物 微生物体内 可通过序列互补模式结合到靶基因的 ( 或者开放阅读框来降解靶基因的 (5. 或抑制蛋白翻译 从而调控靶基因的表达水平 $# 近几年研究表明,(5. 参与发育控制 细胞增殖分化 细胞凋亡 免疫反应 肿瘤发生等多种病理生理过程 并且这些 (5. 可能起肿瘤抑制基因或癌基因的作用 %$' 在众多的,(5. 中 ($ 是肝脏特异表达的,(5. 占肝脏总,(5. 的 '8 在心脏中也有少量表达 " ($ 是肝细胞特异分化的标记 随着胚胎发育表达水平逐渐升高! 在肝细胞癌中 ($ 的表达受到抑制 其表达越低细胞的迁移能力越强 且 ($ 低表达的原发性肿瘤预后不良 文献报道 ($ 是肿瘤抑制,(5. 过表达 ($ 可以抑收稿日期 $#$ % 修回日期 $&$' 国家自然科学基金 "'% # 国家自然科学基金重大研究计划培育项目!!!% 资助项目 通讯作者 电子信箱 制其靶基因./.9' 功能 从而抑制肝细胞癌的转移 而且 ($ 调控其靶基因 0 的表达 从而影响 +% 蛋白的稳定性及转录活性 ($ 在调控线粒体的代谢方面也有重要作用 ($ 下调会影 响肝脏的重要功能和肝癌患者恢复 ($ 随胚胎的发育分化表达水平逐渐增高 而在肝细胞癌中又表现为表达被抑制 这预示 ($ 有着促进细胞分化的功能 因此 希望通过构建 ($ 转基因动物过表达载体研究肝细胞特异 ($ 在胚胎发育中的作用来全面揭示 ($ 更多的功能 以期将来为肝癌的检测 治疗及预后找到新的方法 材料与方法 材 料 +(-./$01) 转基因动物表达载体 :;; + 23 ), 大肠杆菌 / % +4 :;, 质粒抽提试剂盒 氨苄青霉素 6 # /5. :.)/5 : ( 3( 引物有上海生工合成,

2 ! 马 纪等 ($ 过表达转基因小鼠质粒构建及其功能验证! 为 :;, 产品 逆转录试剂为 ), 产品 6 *, 为 * 产品 双荧光报告检测试剂盒为 ), 产品! 细胞株为本所保存 过表达载体的构建从 ( 数据上搜索找到 ($ +,,, 序 列 设计两对引物 表 分别用于 01) 基因上游, 区域和 01) 基因下游 ( 区域的克隆 )( 后扩增片段被插入到 +(-./ $01) 表达载体并转化至 / % 感受态大肠杆菌 重组质粒分别命名为 )*, $ ($ $01) 和 )*, $01)$ ($ 表 用于构建 过表达质粒的引物序列!" #$% "%!#& "&!' % #%! # # ), ($ $+*, $, $1 ($ $+*, $,$( ($ $+*, $01)$1 ($ $+*, $01)$( ),,6 % $ $ % $ $ % $ $ % $ $ #!#% % & 载体构建 从 ( 数据上搜索找到 ($ 成熟序列设计引物 表 )( 扩增后将片段插入到 + 23 载体海肾荧光素酶 ( 区域 然后转化至 / % 感受态大肠杆菌 重组质粒命名为 ($,, +,, 表 用于构建 #!#% % & 的引物序列!" #$% "%!#& "&!' #!#% % & # # ), ($,, +,,1 ($,, +,,( ),,6 % $ $ % $ $ 重组载体鉴定将含有重组体的大肠杆菌 / % 在含 & 氨苄青霉素的 平板上 ' 过夜培养 挑取平板上的阳性克隆菌落 接种至 % 含有 & 氨苄青霉素的 培养基中 ' ", 培养 质粒抽提后进行酶切鉴定 选择阳性质粒送交北京华大公司测序 ( 细胞培养和转染! 细胞株在 /929<8 胎牛血清培养基 %8 - ' 孵箱培养 转染前一天消化细胞按 % = # 个 密度接种在 # 孔板或 & 孔板中 待细胞汇合度达到 "8 7!8 进行转染 转染 % 后更换为 /929<8 胎牛血清培养基 & 孔板转染时 质粒为 % 孔 脂质体为 % 孔 # 孔板转染时 ($ 过表达载体和 ($,, +,, 载体各 >% 孔 脂质体为 % 孔 具体转染操作根据 +4 脂质体转染说明书进行 ) 实时荧光定量 * 检测质粒转染后 和 +, 基因表达水平的变化收集转染后 # 的! 细胞 用, 法抽提总 (5. 并用 /5 : 处理 然后用 ), 公司逆转录试剂进行 /5. 合成 /5. 逆转录反应体系为 反应条 件为 ' # % ' % 实时荧光定量 )( 反应体系为 反应条件为!%!% % & % ' =# ($ 的 $)( 检测采用茎环方法 逆转录引物为带有茎环结构的 ($ 特异引物 逆转录和 $)( 引物序列见表 ),, 表 - * 和逆转录引物序列!" #$% - *! # &!#" &%! ),,6 01)$1 % $ $ 01)$( % $ $ "6,(5.1 % $ $ "6,(5.( % $ $ ($ ( % $ $ &$1 % $ $ &$( % $ $ ($ 1 (5.$(. 统计学处理 % $ $ % $ $ 采用 2 分析软件进行配对 检验?>% 为差异显著?> 为差异非常显著 有统计学意义

3 > 5>! 结 果 过表达和 #!#% % & 克隆方案 ($ 过表达采用两种方案 图 一是将!*+ 的 +,$ ($ 克隆至 +(-./ 载体 (-6. +, 的, 中 即 酶切位点 二是将!*+ 的 +,$ ($ 克隆至 +(-./ 载体 01) 基因下游 ( 区 即 ( 和 酶切位点,, +,, 是将个 ($ 成熟序列的反义序列串联重复后直接插入到 + 23 载体 和 酶切位点中 图 经 单酶切后 和 % 琼脂糖电泳所显示的条带为!*+ 图 初步证明 +, $ ($ 片段已插入到载体中 测序分析证明重组体 中含有 +, $ ($ 为正向插入且无碱基突变及丢失 +(-./ $01)$ ($ " 个单克隆质粒 $" 经 ( 和 双酶切后 " 个重组体均显示!*+ 条带 初步证明 +, $ ($ 片段已插入载体中 图 # 测序证明重组体 # 和 & 插入片段的碱基序列完整且无突变及丢失 ($,, +,, 构建时的插入片段为 '*+ 左右 若采双酶切鉴定则可能存在片段较小不易被检测到的问题 因此在 )( 的上游引物 % 端引入 酶切位点 + 23 载体不含此酶切位点 在酶切鉴定时通过质粒是否线性化来判断片段是否插入 实验共挑取 ' 个菌落 质粒抽提并 酶切后发现 % & 和 ' 均被线性化 说明片段已成功插入 图 % 测序结果证实重组体 %& 和 ' 中插入片段的无碱基的突变 丢失 并且插入方向正确 图 /01 质粒图谱及 过表达方案示意图,' /01 #! & #" ' %$ % #%! /01 +, 重组质粒 单酶切结果,' "& % % ## # &%$ /01 +, "%!!& # # ' #& 7& 7 & 9/ 图 #* * 质粒图谱及 #!#% % & 构建示意图,' #* * #! & "%!#& "&%! #" ' %$ #!#% % & 重组质粒鉴定结果 +(-./ $ ($ $01)& 个单克隆质粒 $& 图 /01 +, 重组质粒 和 双酶切结果,' "& % % ## # &%$ /01 +, "%!!& # # ' #&! 7" 7 " 9/ 和 +, 基因 21 表达水平的变化 将 +(-./ $01) +(-./ $ ($ $01) 和 +(-./ $01)$ ($ 个重组质粒分别转染!

4 ! 马 纪等 ($ 过表达转基因小鼠质粒构建及其功能验证 图 ( #* * #!#% % & 重组质粒 单酶切结果,'( "& % % ## # &%$ #* * #!#% % & "%!!& # # ' #& 7' 7 ' 9 细胞 # 后收样抽提总 (5. 逆转录后进行 01) 和 ($ 表达水平检测 如图 & 显示 +(-./ $01) +(-./ $ ($ $01) 和 +(-./ $01)$ ($ 个质粒转染后 01) 表达水平明显高于空白对照 9-3 其中 +(-./ $01) 和 +(-./ $ ($ $ 01) 与对照相比差异显著?>% 而 +(-./ $ 01)$ ($ 与对照相比差异非常显著?> 成熟 ($ 表达水平检测如图 ' 所示 +(-./ $ 01) 质粒载体 ($ 相对表达水平为 > A> +(-./ $ ($ $01) 和 +(-./ $01)$ ($ 的 ($ 相对表达量为 >! A>! 和 >"" A>& 两种过表达质粒转染后 ($ 表达水平都明显高于空载体对照组 分别为空载组的 ">! 倍和 %>' 倍左右且差异非常显著?> 此结果说明 +(-./ $ ($ $01) 和 +(-./ $01)$ ($ 质粒转染! 后都能正常转录 01) 和 ($ 图. 质粒转染后 3 细胞中 表达水平,'. #%! %$ &! &!#$ "& 3 "! +, 功能检测 考虑到,(5. 成熟过程有可能影响 01) 的 (5. 稳定性 从而抑制 01) 的功能 因此通过荧光显微镜观察 +(-./ $ ($ $01) 和 +(-./ $01)$ ($ 质粒转染! 细胞后是否存在绿色荧光 以判断哪种过表达方案不会影响 01) 的正常功能 实验设置 # 组 分别为 +(-./ $ ($ $01)+(-./ $ 01)$ ($ 空载体对照 +(-./ $01) 和阳性质粒对照 +0 $01) 图 " 相同的细胞融合度情况下 具有绿色荧光的细胞数由多到少依次为 +0 $01) +(-./ $01) +(-./ $01)$ ($ +(-./ $ ($ $01) 实验最终说明 +(-./ $01)$ ($ 转染后不仅 $)( 能够检测到 01) 和 ($ 的高表 图 ) 质粒转染后 3 细胞中 +, 21 水平,') #%! %$+,! &!#$ "& 3 " # 图 4 荧光显微镜观察 +, 表达,'4 #%!%$+, & "& $ % #"!" " %#"%

5 > 5>! 达 而且荧光显微镜观察到 01) 功能正常 ( #!#% % & 检测 功能 个串联重复的 ($ 反义序列被克隆到 + 23 载体中海肾荧光素酶基因 ( 区域 若过表达载体转录的 ($ 具有调控功能 则会与,, +,, 载体上的 ($ 反义序列结合 引发 (5. 的降解 从而使得海肾荧光素酶活性降低 + 23 载体上另外一个报告基因 荧火虫荧光素酶 则作为内参存在 ($ 过表达载体和,, +,, 载体共转! 细胞 # 后 对 种荧光素酶活性进行检测 然后将荧光值进行比值分析 1 ( 越高表示海肾荧光素酶活性被抑制越明显 即外源 ($ 调控活性越强 结果如图! 所示 +(-./ $01)$ ($ 和 ($,, +,, 共转染后 1 ( 活性明显升高 为空载体对照组的 倍左右差异显著?>% 而 +(-./ $ ($ $ 01) 转染组则没有明显变化 结果说明 +(-./ $ 01)$ ($ 质粒表达的 ($ 具有,(5. 的调控活性 图 3 过表达质粒和 #!#% % & 质粒共转染 3 后荧光素酶活性检测,'35 "$ # #!3 " #"%&!#$ "& 6& % #%! # #! #!#% % & # # 讨 论,(5. (5. 是具有调控活性的小分子 (5. 参与发育控制 细胞增殖分化 细胞凋亡 免疫反应 肿瘤发生等多种病理生理过程 并且这些 (5. 可能起肿瘤抑制基因或癌基因的作用 目前常用于,(5. 功能研究的方法是瞬时转染,(5. 或者,(5.*, $4$4 和 $ 4$4 这种瞬时转染小分子的方法虽然操作简单 转染效率相对较高 但却不适合长期稳定研究,(5. 的功能 只能用于体外瞬时的细胞学实验 如果要深入研究,(5. 在胚胎发育方面的功能则必须要构建,(5. 稳定过表达或敲减的转基因小鼠 在构建 ($ 过表达的转基因小鼠重组质粒时设计了两种克隆方案 图 图 即带有侧翼序列的 +, $ ($ 插入到 01) 基因的上游内含子区或者下游 ( 区 方案一的设计来源于众多,(5. 过表达策略 #$% 也符合,(5. 多座落与, 或, 区域的特征 & 而方案二则是常用的 (5. 构建方案 因,(5. 成熟与 (5. 剪接过程类似 所以也有部分文献选用此方法进行,(5. 克隆 '$" 在转基因动物制备中 01) 作为筛选标记十分重要 考虑到,(5. 在成熟过程中要经过转录本剪切 所以为了避免 01) (5. 被剪接导致功能不正常 采用两种构建方法目的在于通过 01) 和 ($ 表达水平及功能的检测来确定哪种 ($ 过表达方案更适合后续的转基因动物实验 通过荧光显微镜观察 ($ 过表达质粒转染! 细胞后 01) 的功能是否正常时 发现 +0 $01) 阳性质粒转染荧光细胞占 %8 左右 说明转染效率相对较高 但是 +(-./ $01) 质粒转染后荧光细胞数少于 +0 $01) 转染组 分析认为 +0 $01) 为 9@ 启动子 +(-./ 是小鼠 (-6. & 启动子 尽管小鼠 (-6. & 启动子在哺乳动物细胞都能进行转录 但其活性在人胚肾上皮细胞! 中还是低于 9@ 启动 +(-./ $01)$ ($ 质粒转染后也有荧光信号 但具有荧光的细胞少于空载体对照组 说明 ($ 克隆到 01) ( 区域后 01) 功能正常 但 ($ 的成熟可能部分影响 01) 的功能 而 +(-./ $ ($ $ 01) 质粒转染后 01) 几乎不能被检测到 说明 ($ 克隆到 01) 上游 (-6. & 启动子, 区域后 尽管 01) (5. 水平高表达但其功能严重被影响 在评价 ($ 过表达后的调控活性时采用了构建的,(5.6,, +,, 的方法 这种方法不但可以检测,(5. 是否具有调控作用 而且如果更换为稳定过表达的质粒载体后此方法还可以用来长期封闭,(5. 功能 即目前多篇文献提到的

6 ! 马 纪等 ($ 过表达转基因小鼠质粒构建及其功能验证 ( + 法! 研究通过两种方法构建了 ($ 过表达的转基因动物质粒载体 并通过 $)( 荧光显微镜观察和双荧光报告系统酶活检测等实验验证了过表达的 ($ 报告基因 01) 的 (5. 表达水平及生物功能 为后续的 ($ 过表达转基因小鼠的制备奠定基础 同时 研究还比较了两种,(5. 过表达载体构建方案 发现把带有侧翼序列的 +, $ ( 插入到报告基因 01) 下游 ( 的位置时 无论 01) 和 ($ 的 (5. 表达水平还是生物功能都优于插入到 01) 基因上游的, 中 在后续的 ($ 转基因小鼠制备时 采用得是 +(-./ $01)$ ($ 质粒载体 参考文献 0., 9 9,(5. 6,, 5( ;, &&"%'$"&& 0, ( 1**,9, 9 9,(5.2 +, 1,, 9 9 & %"$%"' B C ), + 4,$(5. ), 9, - & %#&&%&$&& $6 9. D ),E,(, 4, (5. /, * (5. (5. 0 / ; & %%%$% # %, / 1 E 5E ,(5.$ #* 9,(5.$#,, 4+% +,, 4 ), 4,. $ + 0,,( ' &'" "# $"# " & D. 3, ; E. 9 3 E 3 6 9,(5.$.++ 1, 0 *,( %&%#&!$& ' 6, 0, B,. : 6 0, (5. 6 ' '%" & '&$" " D5 2 9,E / 9,$ 9 ;,$ + 4,(5. ), 4,, (5. 9 /,.4.., +,,. $ (5. # &$! 0,, 9,. ($ ), 4, ( 4,(5. ;, D, 4 + "#"# &#"$&%&,,, ($ 2 +, ;,,, 6 ++, 4 + ) ),+, -! "# % &$% & ).,(5.$, 6 ++,,9,(5. ( :, ,, +! #! % %'$%" 1,,10,, 9($ 0 :, 9 +%. ;.4 /, * 6 ; 4 +,,(! &!#%'&$%'&',, D B E D9,(5.$,, 4, *,E +,, 9 6 #&# # 5., - 2. :, 921 $ + 2, /, 9 $ , 4,(5. ), ' # % "##$ "#! % 9 2 ), E / $ ( $ +, * 9,(5.$, " " $! & 0,@. 6, 9, 9.; ( 9,(5., ), * +, (!! #"$#! ', / 9,.@ 5 2,(5. ( 6 ++,, 2 +, + 2* 6* 0, 4, 59 & %%"%$%! " B C ($!,.2 +, +,, (!%"$%! 2*,9 6 5 D( 6,+ ). 9,(5.6,, +,, + ; :*, 46 ( ' #!' $' &

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