中国畜牧兽医! " # 蓝舌病病毒衣壳蛋白 ( ( 0( 酵母双杂交诱饵质粒的构建及鉴定张继凯孙恩成杨涛徐青元吕爽王海秀张沁吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室哈尔滨摘要蓝舌病病毒!"#$ %"#&'" 的

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柬过张廖
4 years ago
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1 中国畜牧兽医! " # 蓝舌病病毒衣壳蛋白 ( ( 0( 酵母双杂交诱饵质粒的构建及鉴定张继凯孙恩成杨涛徐青元吕爽王海秀张沁吴东来中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部兽医公共卫生重点开放实验室哈尔滨摘要蓝舌病病毒!"#$ %"#&'" 的结构主要由层衣壳蛋白组成其中 - - 蛋白构成了的外层衣壳 - 蛋白构成了的中间衣壳最内层衣壳则由 - 蛋白构成 - - 及 - 蛋白在侵染宿主细胞的过程中起着非常重要的作用为了研究与宿主细胞相互作用的分子机制本研究将的基因分别克隆到 9 载体中成功构建了 9-9- 与 9- 个诱饵质粒且通过自激活和毒性验证证明所构建的个质粒均无自激活作用对酵母细胞无毒性作用本研究为今后利用酵母双杂交筛选蛋白中与宿主细胞相互作用的蛋白做好了铺垫为深入研究与宿主细胞的相互作用奠定了基础关键词蓝舌病病毒诱饵质粒自激活作用毒性作用中图分类号. / 文献标识码, 文章编号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收稿日期基金项目国家自然科学基金中国博士后科学基金国家科技支撑计划,+ 公益性行业农业科研专项新型重大动物疫苗与诊断试剂创制及生产工艺创新,,, 中央级公益性科研院所基本科研业务费 / 作者简介张继凯 00 男山东泰安人硕士生研究方向分子病毒学与分子免疫学 *1!/01 通信作者吴东来 0 黑龙江哈尔滨人研究员博士生导师研究方向分子病毒学与分子免疫学 *1!! " &'

2 中国畜牧兽医卷蓝舌病!"#$ %"# 是由蓝舌病病毒!"#$ %"#&'" 引起的经媒介昆虫如库蠓伊蚊等传播的一种反刍动物类疾病各种家养和野生的反刍动物均可感染其中绵羊的易感性最高的临床症状主要有高热过度流涎舌头发绀及口鼻和胃肠黏膜发生溃疡性炎症鉴于所造成的重大经济损失及全球性分布等特点已被世界动物卫生组织 * 列为法定通报性疾病属于呼肠孤病毒科 #&' # 环状病毒属 '&'" 病毒粒子呈二十面体对称其基因组包含个分子质量不同的双链, 片段约为 0 9 这些核酸片段分别编码 - - 种结构蛋白及种非结构蛋白共种蛋白其中 - - 蛋白构成了病毒粒子的外层衣壳 - 构成了中间衣壳内层衣壳由 - 蛋白构成内部包裹着种具有酶活性的次要结构蛋白及个双链, 组成的基因组非结构蛋白不参与病毒粒子的组成但在病毒复制感染及释放等过程中起着重要作用 - 蛋白由 % 基因 0 9 左右编码以三聚体的形式存在 - 蛋白是主要的型特异性抗原是决定血清型的关键抗原 - 蛋白是由 " 基因 0 9 编码也以三聚体形式存在该蛋白较保守是的另一个型特异性抗原它与 - 共同决定的血清型 - 蛋白是由基因 9 编码的它高度保守是的主要核心粒子含有群特异性抗原决定簇目前感染宿主细胞的具体过程和机制并不十分清楚本试验分别构建了酵母双杂交系统中个诱饵质粒 9-9- 与 9- 并验证其自激活和毒性作用以期为今后利用绵羊肾细胞的 +, 文库筛选互作蛋白及阐明的致病机理提供了物质材料并为进一步研究与宿主细胞的相互作用奠定基础材料与方法, 材料 - - 及 - 的模板质粒均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室构建并保存诱饵载体 9 空捕获载体 9,+ 酵母菌株 2!,"'#, 各种酵母培养基及 #$1#' #$ ' 8'1 $ $#1 试剂盒均购自 )! $# 公司大肠杆菌 9 感受态细胞购自天根生物有限公司 (#& 限制性内切酶及 +, 聚合酶." 连接酶等均购自宝生物工程大连有限公司其他试剂均为国产分析纯培养酵母所用的平板 +++ '9(#".+ 2, + '9 (#",# 2!,"'#,.+ + '9(#",# 均按说明书配制, 方法引物设计与合成利用 -'1#'-'#1#' 软件设计基因扩增所用的引物序列见表引物均由哈尔滨博仕生物技术有限公司合成表 $%$%0$% 基因扩增引物 %-*!!#!$*!- ' $%$%0 $ $%$ ' 扩增基因引物名称序列 < < 限制性内切酶,19!8#%# # -'1#'1# #="## # $' $ # ;1# -,,,),,), )), ) (#& - )),),),) ), ), ) - ),,),,,,),,) (#& - ),) ),, ), ),,,, -,,),,),), ) )),, (#& -, ),)),),),,)) ) 下划线处碱基为引物序列的酶切位点 #'! #9'1#' #="##'#'# $' $ # ;1# "$ % $# 与基因的扩增以实验室构建好并保存的 -- 及 - 个质粒为模板利用合成的特异性引物进行 -) 扩增 -) 反应体系 ( 质粒模板

3 期张继凯等蓝舌病病毒衣壳蛋白酵母双杂交诱饵质粒的构建及鉴定 ( 上下游引物各 (- 混合液 (., % 8#!$+, -!1#'# 高保真酶 (C. #$ "8#' ( 加补至 (-) 反应条件 0/? 预变性 0/? 变性? 退火? 延伸个循环? 延伸 1 将 -) 产物进行 > 琼脂糖凝胶电泳检测 - - 与 - 诱饵质粒的构建将经电泳鉴定正确的 -) 产物利用, 酶进行酶切去除质粒 +, 模板酶切体系 (, 酶 (C "8#' (-) 产物 ( (? 温箱中酶切然后利用 -) )!#"9 $ 进行 -) 纯化纯化后的产物利用 (#& 和进行双酶切诱饵载体 9 也要进行同样的酶切处理酶切体系 ((#& ( (C "8#' (-) 纯化产物 9( (? 温箱中酶切酶切后进行连接连接体系 (." 连接酶 (C #$"8#' ( 酶切后的目的片段 ( 酶切后的 9 载体 (? 连接 1 连接后马上进行转化将连接好的质粒在冰上冷却 1 加入 ( 大肠杆菌 9 感受态细胞冰浴 1 然后? 热应激 0 冰上再冷却 1 之后加入 ( ( 培养液? 摇菌取 ( 的菌液涂在卡那霉素抗性 9 载体具有卡那霉素抗性的 ( 琼脂平板? 温箱培养挑取大小适中的菌落培养然后利用小提试剂盒提取质粒经双酶切鉴定正确后送哈尔滨博仕生物技术有限公司测序将测序正确的质粒分别命名为 9-9- 和 9- 诱饵质粒转化酵母菌株按照 #$1#' #$ ' 8'1 $ $#1 试剂盒说明书制备酵母感受态细胞将保种的酵母菌株! 划线接种于 -+, 平板上? 温育左右此步可暂停平板密封保存后可与? 保存个月挑取 11 大小的乳白色菌落接种于含 1( -+, 液体培养基的 1( 离心管可建立管选取生长最快的一管进行感受态细胞的制备?'1 摇菌 / 取 ( 至装有 1( -+, 的 1( 锥形瓶摇菌至 1 值为 '1 室温离心 1 收集细胞 1( 新鲜 -+, 重悬? 摇菌至 1 值达将菌液分装至两个 1( 无菌离心管 '1 室温离心 1 弃上清菌体用 1( 无菌水重悬 '1 室温离心 1 弃上清菌体用 1(C *(, 重悬将菌体转移至个 1( 无菌离心管高速离心弃上清 (C *(, 重悬此时方可用于质粒 +, 的转化酵母感受态细胞制备完成后将质粒转化酵母菌中具体方法在 *- 管中加入 ( % ( 待转化的质粒然后加入 ( % ( #$1#') ''#'+, 0? 水浴 1 迅速冰上冷却使用前再重复操作次 ( 酵母感受态细胞及新鲜制备的 > -* (,( 混匀? 孵育 1 每隔 1 混匀次每管 *- 管加入 (+ 混匀? 水浴 1 每隔 1 轻轻混匀次 '1 离心弃上清沉淀用 (0> )! 重悬取 ( 重悬菌液均匀涂抹在酵母培养基平板? 倒置培养待酵母菌长出诱饵质粒的自激活作用和毒性作用检测将诱饵质粒与空捕获载体 9,+ 共转化到酵母感受态细胞中进行自激活检测即将 9-9,+9-9,+9-9,+ 组质粒分别共转化至酵母菌感受态细胞中还应设置个对照试验组个阳性对照 99,+ 个阴性对照 9 ( 19,+ 和个空载体对照 9 9,+ 均转化到酵母感受态细胞中每一组均用种培养基检测 ,? 倒置培养判定标准阴性对照组只在 ++ 平板上生长不在.+ 和.+ 2, 平板上生长阳性对照组在 , 种平板上全部生长且在.+ 2, 平板上菌落变蓝色如果诱饵质粒和空捕获载体 9,+ 共转化组转化结果和阴性对照组相符则说明诱饵质粒没有激活报告基因否则则说明有相关报告基因的激活诱饵质粒毒性作用检测如果诱饵质粒和空捕获载体 9,+ 共转化组和空载体对照组相比在 ++ 平板上菌落生长数量和大小没有明显差异则说明诱饵质粒没有毒性作用否则则有毒性作用

中国畜牧兽医卷结果与分析,$%$%0$% 基因扩增及序列分析基因经 -) 扩增后经 > 琼脂糖凝胶电泳分别在 / 9 左右可见清晰的条带图与预期片段大小相符测序结果显示个基因片段仅包含大小分别为 /// 9 分别编码 0 0 个氨基酸和 9 图

8$ 9'" $8 %# # 图 ($%0$% 基因扩增电泳图!,-*!!#!$ $%0 $ $%$ ' (, 诱饵质粒的构建个重组诱饵质粒 9-9- 9- 均使用 (#& 双酶切经 A> 琼脂糖凝胶电泳结果均显示有两条清晰条带大小分别为和 / 和及 +( +, ' #' 9-9- 和 9- 的双酶切产物 +(+, ' #' +"!

' *9 +( *9 +( 0 $ *9 +(, 诱饵质粒自激活作用检测诱饵质粒 9-9,+9-9,+9-9,+ 共转化组转化后在 ++ 培养基上均见到白色酵母菌落生长在.+.+ 2, 培养基上均无菌落生长阳性对照组 99,+ 在 ++ 和.+ 培养基上可见白色菌落生长在.

4 中国畜牧兽医卷结果与分析,$%$%0$% 基因扩增及序列分析基因经 -) 扩增后经 > 琼脂糖凝胶电泳分别在 / 9 左右可见清晰的条带图与预期片段大小相符测序结果显示个基因片段仅包含大小分别为 /// 9 分别编码 0 0 个氨基酸和 9 图将重组质粒送哈尔滨博仕生物技术有限公司测序结果表明这个重组质粒均构建正确图 ($% 基因扩增电泳图!,-*!!#!$ $%$ ( 基因扩增产物 +(+, ' #' 基因扩增产物,19!8$ 9'" $8%# # +(+, ' #',19!8$ 9'" $8 %# # 图 ($%0$% 基因扩增电泳图!,-*!!#!$ $%0 $ $%$ ' (, 诱饵质粒的构建个重组诱饵质粒均使用 (#& 双酶切经 A> 琼脂糖凝胶电泳结果均显示有两条清晰条带大小分别为和 / 和及 +( +, ' #' 9-9- 和 9- 的双酶切产物 +(+, ' #' +"!## ;1#%# $ 9'" $ '# 9# $&#! 图诱饵质粒 *9 +( *9 +( 0 和 *9 +( 的双酶切鉴定电泳图!,$"&-!'#!$!$#!!#!$!#*'-! ' *9 +( *9 +( 0 $ *9 +(, 诱饵质粒自激活作用检测诱饵质粒 9-9,+9-9,+9-9,+ 共转化组转化后在 ++ 培养基上均见到白色酵母菌落生长在.+.+ 2, 培养基上均无菌落生长阳性对照组 99,+ 在 ++ 和.+ 培养基上可见白色菌落生长在.+ 2, 培养基上见到蓝色菌落生长阴性对照组 9 ( 19,+ 空载体对照组 9 9,+ 均在 ++ 培养基上可见白色菌落生长在.+.+ 2, 培养基上均无菌落生长图结果表明所构建的个诱饵质粒在酵母双杂交系统中均无自激活作用, 诱饵质粒的毒性作用检测与空载体对照组 9 9,+ 相比诱饵质粒 9-9,+9-9,+9-9,+ 共转化组在 ++ 培养基上菌落的大小和数量均无明显差异图结果表明所构建的个诱饵质粒对酵母细胞无毒性作用

5 !% 期张继凯等$蓝舌病病毒衣壳蛋白 =E0) =E1) =E/ 酵母双杂交诱饵质粒的构建及鉴定图 %! 诱饵质粒的自激活作用和毒性作用检测 ; %!O, 262 =9. = N /, T / 26/6: 2V, =+/ B. / 9E : 9 JD 82 )*

6 中国畜牧兽医卷讨论在侵染宿主细胞的过程中外层的衣壳蛋白 - - 首先与宿主细胞表面的糖蛋白及相应受体结合从而与靶细胞相互作用但研究发现的核心颗粒也可以通过 - 蛋白三聚体与细胞表面糖蛋白及受体结合然后通过网格细胞介导的内吞作用内化进入胞内体在胞内体中病毒脱去最外层衣壳蛋白 - 之后 - 蛋白在酸化作用下与核内体的膜发生融合然后将具有转录活性的核心颗粒释放到胞浆中在等酶蛋白的作用下转录出个不同大小片段的双链, 然后翻译成相应的蛋白并组装成完整的病毒粒子最后通过由蛋白介导的出芽方式或细胞裂解方式释放出细胞由此可见蛋白与蛋白的相互作用在病毒生命周期中发挥着重要作用尤其是蛋白与侵染宿主细胞的过程息息相关但目前具体的感染机理和过程还不甚清楚因此研究与宿主的相互作用对于揭示其致病机理病毒侵染复制释放及其在宿主细胞内引起的信号传导和新型药物的开发具有极其重要的意义酵母双杂交技术是目前研究蛋白相互作用的常用方法之一该技术可以发现新蛋白之间的相互作用确定蛋白相互作用的区域从而为研究各蛋白的生物学功能及蛋白之间相互作用的分子机制奠定基 / 础其中该技术最主要的应用就是从宿主细胞的 +, 文库中筛选出未知的能与病毒蛋白相互作用 0 的特定蛋白该技术利用了转录激活因子! 所具有的互相独立的 +, 结合结构域 + 和转录激活结构域,+ 将诱饵基因构建在含有 + 的质粒载体上宿主细胞的 +, 文库片段捕获基因构建在含有,+ 质粒载体上酵母细胞中共同表达通过检测报告基因表达产物的情况来确定捕获蛋白和诱饵蛋白之间是否存在相互作用本试验基于蛋白在感染宿主细胞的过程中所起的重要作用利用实验室所保存的质粒模板成功构建了个诱饵质粒且将诱饵质粒转化入酵母感受态细胞中经验证所构建的个诱饵质粒均无自激活作用和毒性作用为进一步筛选与其相互作用的宿主细胞靶蛋白并研究其在病毒感染和致病性方面所起的重要作用以及为今后利用酵母双杂交系统筛选相关蛋白及深入研究的侵染机制奠定了基础参考文献林汉亮冉多良王文蓝舌病研究进展 6 新疆畜牧业 / #'$#-- '% '+,% 1# $8 $ #%# 1# #%1# $ 8!"#$ %"#&'" $9#$ $ #9'$#$ ### 6&&0/ #! "#$ 68 ''$,*#$!+#$# $ 8 8"'$ '&'"$'" $"'!9'$#6 %& + #0 '; ' -!"#$ %"#&'" # $' $ #!6 * & //0/ #'$#--+9' #6 #$!!"#$ %"#& '" '#9!$ 1!# "! ' $" $"'!!% 6!! '; 7'! ) -, 9 9'$# 8 # &#!9#!"#$ %"#&'" #: $1#1 ' #8" $&$ 6 &###4 #'$#--+9' #6#!"#$ %"#&'"'#,!#$''9$ 1# 6 # 0 / 汪园园郝文波罗树红酵母双杂交系统在痘病毒与宿主相互作用中的研究进展 6 中国人畜共患病学报宋博翠陈志宝万家余等酵母双杂交技术筛选朊蛋白 -'- 互作蛋白 6 中国畜牧兽医 / #!%, &#!%# #$ $#1$#$# $9' $# 9'$#$#'$ 6 )! 0/0 责任编辑吴艳

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽