858 刘晓军, 等. 前列腺特异抗原 3 慢病毒表达载体的构建与包装的表达后可影响其增殖 [2-3], 但 PCA3 的过表达对前列腺癌细胞是否有作用还尚未研究本文通过 PCR 扩增 PCA3, 然后克隆到真核表达载体 pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp 中, 目的是构建重组质粒,

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峙罗
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1 中国癌症杂志 2013 年第 23 卷第 11 期 CHINA ONCOLOGY 2013 Vol.23 No 前列腺特异抗原 3 慢病毒表达载体的构建与包装刘晓军 1 王娜 2 姚旭东 1 曹达龙 1 1. 复旦大学附属肿瘤医院泌尿外科, 复旦大学上海医学院肿瘤学系, 上海 ; 2. 复旦大学附属肿瘤医院肿瘤研究所, 复旦大学上海医学院肿瘤学系, 上海 [ 摘要 ] 背景与目的 : 前列腺癌抗原 3(prostate cancer antigen 3,PCA3) 作为一种长链非编码 RNA(lncRNA) 已被证实在前列腺癌中高度特异性表达, 暗示其可能在前列腺癌中发挥重要作用, 为深入研究, 我们将完整的 PCA3 基因转入真核表达载体, 并构建慢病毒包装系统方法 : 从前列腺癌细胞株 LNCaP 细胞中提取总 RNA, 运用重叠延伸方法扩增到 PCA3 基因, 测序正确后定向接入真核表达载体 pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp, 酶切鉴定并测序正确后进行慢病毒包装和滴度测定结果 : 经 PCR 鉴定及测序,PCA3 表达质粒序列与 Gene Bank 序列进行 Blast 比对分析, 同源性为 99.8%,PCA3 慢病毒滴度测定为结论:PCA3 成功插入真核表达载体并完成了慢病毒包装, 为深入研究 PCA3 基因在前列腺细胞中的作用奠定了基础, 进而为探索前列腺癌的治疗提供了新的途径 [ 关键词 ] 前列腺癌 ; 前列腺癌抗原 3; 真核表达载体 ; 慢病毒 DOI: /j.issn 中图分类号 :R 文献标志码 :A 文章编号 : (2013) Construction of eukaryotic expression vector and package of lentivirus vector encoding prostate cancer antigen 3 LIU Xiao-jun 1, WANG Na 2, YAO Xu-dong 1, CAO Da-long 1 (1.Department of Urology, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College Fudan University, Shanghai , China; 2.Department of Cancer Institute, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College Fudan University, Shanghai , China) Correspondence to: YAO Xu-dong yaoxudong67@sina.com [Abstract] Background and purpose: The increased of specific expression of prostate cancer antigen 3 (PCA3), as one of long non-coding RNA, has been observed in prostate cancer, indicating that PCA3 may contribute to the development of prostate cancer. To further study its roles in prostate cancer, we construct a lentivirus expression vector carrying the whole PCA3. Methods: PCA3 was amplified from prostate cancer cell line LNCaP by reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). After the sequence was proved to be correct, we recombined the pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp-pca3. After transformation into E.coli cells, the candidate clones were identified by PCR amplifying, restricting enzyme digestion analysis and DNA sequencing, and the viral titer was determined. Results: Through the Blast analysis software, we compared the results of PCA3 sequence amplified by PCR with GeneBank sequence, finding that the homology is 99.8%. The lentivirus vector was constructed successfully, and the virus in the supernatant reached a titer of 2*108. Conclusion: The successful construction of the lentivirus vector encoding PCA3 not only lays the foundation for the further research into the effect of PCA3 gene on the prostate cancer but also provides a new therapy for advanced prostate cancer. [Key words] Prostate cancer; Prostate cancer antigen 3; Eukaryotic expression vector; Lentivirus 前列腺癌基因 3(prostate cancer gene 3, PCA3) 是 1999 年被发现的一种长链非编码 RNA [1] 由于 PCA3 在前列腺癌中的表达具有特异性, 它也被用于前列腺癌的早期诊断已有研究发现, 干扰 PCA3 在前列腺癌细胞株 LNCap 中基金项目 : 国家自然科学基金 (No: ); 上海市科学技术委员会上海市自然科学基金 (No:11ZR ); 上海市科学技术委员会上海市医学引导类项目 (No:114119a4200) 通信作者 : 姚旭东 yaoxudong67@sina.com

2 858 刘晓军, 等. 前列腺特异抗原 3 慢病毒表达载体的构建与包装的表达后可影响其增殖 [2-3], 但 PCA3 的过表达对前列腺癌细胞是否有作用还尚未研究本文通过 PCR 扩增 PCA3, 然后克隆到真核表达载体 pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp 中, 目的是构建重组质粒, 用于后续研究 PCA3 在前列腺癌的增殖和侵袭中的作用 1 材料和方法 1.1 材料前列腺癌 LnCap 细胞株 DU145 细胞株 PC3 细胞株 TRIzol 试剂由本实验室保存 ; 大肠杆菌 DH5α 慢病毒载体质粒 pcdh-cmv-mcs- EF1-copGFP 慢病毒包装系统病毒生产细胞系 293T 细胞由胡维国教授惠赠寡核苷酸引物由上海生工公司合成, 逆转录试剂盒高保真 PCR 试剂盒限制性内切酶 BamHⅠ NotⅠ 凝胶纯化回收试剂盒均购自日本 Takara 公司, 质粒小抽试剂盒购自 Tiangen 公司, 其他试剂均为国产或进口分析纯试剂 1.2 方法引物设计与合成根据 GenBank 的人 PCA3 基因的序列 ( 序列号 :NR_ ) 设计合成引物, 因 PCA3 含 bp, 较难扩增, 而且为了保证序列的准确性, 本研究设计了 3 对引物, 扩増出 3 个片段命名为 P1 P2 P3, 其长度分别为 bp, 各片段间互相重叠, 重叠片段为 79 及 60 bp, 便于以后的搭接引物序列 : 第 1 片段 P1 上游引物 F1:5 -ATAGGATCCAGAAGAA ATAGCAAGTGCCGAGAA-3, 下游引物 R1:5 -ATAGCGGCCTTTACGTTCTGGGA TACATGT-3 ; 第 2 片段 P2 上游引物 F2: 5 -GACTAAGTCCTTTATCCCTCCCC-3, 下游引物 R2: 5 -GGACTATCCATGAACAC AAAGAGGG-3 ; 第 3 片段 P3 上游引物 F3:5 GC TCAGGTGCTTTCACTAATGTCTC-3, 下游引物 R3:5 -CGCGGATCCCTTTACGTTCTGGGA TACATGTGCAG-3,F1 R3 引物两端分别加上 NotⅠ BamHⅠ 酶切位点 RNA 提取及 PCR 扩增采用 TRIzol 法从 PCA3 高表达的前列腺癌细胞株 LnCap 中提取总 RNA 取 4 μl 的 RNA 用逆转录试剂盒逆转录成 cdna, 然后取 1 μl 用高保真酶扩增 PCA3 反应体系 20 μl:5 buffer 4 μl,dntp 2 μl,f1/r1( 或 F2/R2 或 F3/R3): 0.5/0.5 μl,cdna:1 μl,hs DNA 聚合酶 : 0.2 μl,ddh 2 O:11.8 μl 扩増出 3 个片段 PCR 扩增条件 :94 3 min, s,60 15 s, min,72 10 min,30 个循环扩增后以 1 % 的琼脂糖凝胶电泳, 回收目的片段然后送测序, 测序结果与 GenBank 中 PCA3 序列对比, 发现序列基本吻合重叠延伸反应体系 20 μl:5 buffer 4 μl,dntp 2 μl,f2/r2:0.5/0.25 μl 及 F3/R3: 0.25/0.5 μl, 模板 P2 P3 各 1 μl,hs DNA 聚合酶 :0.2 μl,ddh 2 O: 10.3 μl PCR 扩增条件 :94 3 min,98 10 s,60 15 s, min,72 10 min, 30 个循环扩增后 1% 的琼脂糖凝胶电泳后, 回收目的片段将连接好的后 2 个片段与第 1 个片段连接, 反应体系 20 μl:5 buffer 4 μl, dntp 2 μl,f1/r3:0.5/0.5 μl, 模板 P1 P2-P3 各 1 μl,hs DNA 聚合酶 :0.2 μl,ddh 2 O: 10.8 μl PCR 扩增条件 :94 3 min, s,60 15 s,72 4 min,72 10 min, 30 个循环扩增后 1% 的琼脂糖凝胶电泳后, 回收目的片段并送测序重组质粒的构建和鉴定用 NotⅠ BamHⅠ 分别双酶切 pcdh-cmv- MCS-EF1-copGFP PCR 胶回收产物 PCA3 分子过夜, 然后琼脂糖凝胶电泳检测, 切胶后回收酶切片段将回收的质粒及目的片段以 1 3( 摩尔比 ) 进行连接, 连接体系 10 μl,16 过夜连接后转化大肠杆菌 DH5α 并培养, 涂布于含氨苄青霉素的 LB 选择平板,37 培养箱过夜挑取白色克隆菌落, 使用载体多克隆位点两端的引物 (F1 R3) 进行 PCR 扩增 PCR 扩增条件 :

中国癌症杂志 2013 年第 23 卷第 11 期 859 94 3 min,98 10 s,60 15 s,72 4 min,72 10 min,30 个循环, 检测载体多克隆位点是否有插入目的基因片段检测为阳性菌落培养后用小抽试剂盒提质粒, 以提取的质粒为模板进行 PCR, 同时将质粒进行 NotⅠ BamHⅠ 双酶切,1% 凝胶电泳鉴定, 将酶切后和 PCR 的产物送

3 中国癌症杂志 2013 年第 23 卷第 11 期 min,98 10 s,60 15 s,72 4 min,72 10 min,30 个循环, 检测载体多克隆位点是否有插入目的基因片段检测为阳性菌落培养后用小抽试剂盒提质粒, 以提取的质粒为模板进行 PCR, 同时将质粒进行 NotⅠ BamHⅠ 双酶切,1% 凝胶电泳鉴定, 将酶切后和 PCR 的产物送 Invitrogen 公司测序, 测序引物为 3 对引物慢病毒包装及病毒滴度测定慢病毒包装 : 用 DMEM 培养基培养 293T 细胞, 感染前 1 天接种到 6 孔板中, 使融合度达到 70%~80% 取出 2 个干净的 1.5 ml EP 管, 各加入 500 μl Opti-MEM 培养液, 将慢病毒包装系统中两种质粒按一定比例与慢病毒载体混合加入其中 1 个 EP 管, 另外 1 个 EP 管加入 Lipofectamine TM 2000,3 种质粒的质量与 Lipofectamine TM 2000 体积比为 1 1( 含空载质粒的病毒的包装同上相同 ) 混合均匀后静置 5 min, 然后将 2 管混合, 静置 30 min 后将此复合物加入无血清培养液的 293T 细胞中, 培养 6 h 后弃上清液, 加入含 10% 胎牛血清的培养基继续培养 24 h 后荧光显微镜观察,48 h 后收取上清液,72 h 后再收集 1 次, 于 4 条件下 g 离心 20 min, 然后使用 0.22 μm 滤器过滤, 分装于 1.5 ml EP 管中, 冻存于 -80 备用采用逐孔稀释滴度测定法将纯化过的病毒液倍比稀释后感染 293T 细胞,48 h 荧光显微镜观察荧光 ; 用完全培养基按照 10 倍稀释, 最后得到稀释病毒上清的体积均为 100 μl 72 h 后荧光显微镜下观察前列腺癌细胞的培养及感染 RPMI-1640 培养基培养前列腺癌细胞 DU145 及 PC3 细胞株, 细胞消化后按 /ml 铺在 6 孔板中, 融合度达到 70%~80% 吸除培养液, 换新鲜培养液, 加入 30 μl 的浓缩病毒, 混匀后放入恒温箱 24 h 后更换普通培养液,72 h 后荧光显微镜观察细胞感染效率 RT-PCR 检测 PCA3 mrna 的表达用 TRIzol 法提取慢病毒感染 DU145 及 PC3 细胞的总 RNA, 经反转录试剂盒合成 cdna PCA3RT-PCR 检测前引物为 :5 -AGAAGAAATAGC AAGTGCCGAGAAG-3, 后引物为 : 5 -GTGTGGCCTCAGATGGTAAAGTC-3, β-actin 作为内参, 使用 TaKaRa 的 RT-PCR 试剂盒进行实时荧光定量 PCR 1.3 统计学处理采用 SPSS 11.0 统计学软件进行分析, 计量资料以 x±s 表示, 样本均数比较采用单因素方差分析 (One-way ANOVA),P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 目的基因 PCA3 PCR 扩增产物电泳结果从 LnCaP 细胞中提取的总 RNA 反转录成 cdna, 以此为模板分别扩增 P1 P2 P3, 然后 P2 P3 搭接, 后再与 P1 进行重叠延伸反应扩出全长扩增产物在 1% 琼脂糖凝胶中进行电泳, 显示在 bp 处有扩增条带, 片段大小与预期相符, 表明目的基因克隆成功 ( 图 1) 图 1 PCA3 重叠延伸 PCR 扩增产物琼脂糖凝胶电泳图 Fig. 1 Agarose gel electrophoresis results of PCR products of PCA3 PCA3: Prostate cancer antigen 3; M: DNA marker; 1 PCR amplification products of PCA3 (3 735 bp).

4 860 刘晓军, 等. 前列腺特异抗原 3 慢病毒表达载体的构建与包装 2.2 慢病毒载体 pcdh-cmv-mcs-ef1- copgfp-pca3 测序及双酶切鉴定将扩出的 PCA3 片段回收后, 插入载体中, 然后将重组质粒转化大肠杆菌 DH5α, 进行菌液 PCR,1% 琼脂糖凝胶电泳, 可见大小约 bp 的 1 条清晰的目的条带, 与预计片段相符合 ( 图 2) 将质粒载体送测序, 测序结果显示表达克隆中插入的目的基因序列与 GenBank 中 PCA3 基因的序列 ( 序列号 :NR_ ) 基本相符, 大小为 bp, 表明慢病毒载体 pcdh- CMV-MCS-EF1-copGFP-PCA3 构建成功从此阳性克隆株中提取重组质粒, 经 NotⅠ BamHⅠ 双酶切后可见 2 个片段, 即约 bp 的慢病毒载体 pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp 片段与 bp 的目的基因片段, 说明重组质粒大小及插入方向正确, 重组载体构建成功 ( 图 3) 2.3 慢病毒感染前列腺癌细胞后荧光表达经过病毒滴度测定, 将空载体慢病毒或 PCA3 过表达慢病毒分别感染前列腺癌细胞株 DU145 及 PC3 细胞, 细胞感染 72 h 后, 使用荧光显微镜观察, 可观察到绿色荧光, 感染效率达 90% 以上 ( 图 4) 2.4 RT-PCR 检测慢病毒感染前列腺癌细胞株后 PCA3 mrna 的表达病毒感染细胞株 96h 后收取两组细胞的 RNA, 利用反转录试剂盒反转录成 cdna, 后进行 real-time PCR 检测 PCA3 mrna 的表达, 相对于空载体感染组,PCA3 过表达慢病毒组的 PCA3 mrna 表达水平上升 (P<0.05), 表明 PCA3 过表达成功 ( 图 5) 图 2 目的基因 PCA3 重组克隆 PCR 鉴定结果 Fig. 2 PCR identification results of recombinant lentivirus- PCA3 PCA3: Prostate cancer antigen 3; M: DNA marker; 1: Recombinant lentivirus-pca3 digested by Not1 and BamH1 (PCA3 PCR amplification products being bp). 图 3 pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp-pca3 双酶切鉴定图 Fig. 3 Double digestion identification results of pcdh-cmv- MCS-EF1-copGFP-PCA3 M: DNA marker; 1: Double digestion (NotⅠ and BamHⅠ) for recombinant of pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp-pca3; 2: pcdh- CMV-MCS-EF1-copGFP-PCA3.

和正常前列腺组织的mRNA表达谱时发现的它位于第9号染色体上(9q21-22) 是一种长链非编码RNA(lncRNA) 报道称多种类型的ncRNA 通过对染色质进行修饰 DNA的甲基化 RNA 剪接与编辑转录及转录后基因的沉默增强基因表达等各种途径参与基因调节 4-5 图5 RT-PCR

5 861 中国癌症杂志 2013年第23卷第11期图4 Fig. 4 荧光显微镜观察慢病毒对前列腺癌细胞株的感染效率 GFP expression in lentivirus infected prostate cancer cells 3 讨论前列腺癌基因3(PCA3)由Bussemakers等 1 于1999年应用差异显示分析比较前列腺癌组织和正常前列腺组织的mRNA表达谱时发现的它位于第9号染色体上(9q21-22) 是一种长链非编码RNA(lncRNA) 报道称多种类型的ncRNA 通过对染色质进行修饰 DNA的甲基化 RNA 剪接与编辑转录及转录后基因的沉默增强基因表达等各种途径参与基因调节 4-5 图5 RT-PCR 检测过表达PCA3基因后前列腺癌细胞株PCA3 mrna结果 Fig. 5 Overexpression of PCA3 mrna in prostate cancer cells with real time-pcr Vector: Empty vector group (pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp); PCA3: pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp -PCA3 group; *: P<0.05, n=3, x±s. 在许多生物体内人们还发现了类mRNA样的长 ncrnas 对于它们的功能的研究是较为热门的领域而PCA3在前列腺癌中的作用尤为备受关注 Bussemakers等 1 在56个前列腺癌切除样本

6 862 刘晓军, 等. 前列腺特异抗原 3 慢病毒表达载体的构建与包装中发现, 有 95% 的样本其 PCA3 在癌性组织相对于临近的非癌性组织来说是过度表达的使用 RNA 印迹分析来自同一对象的正常前列腺组织和良性前列腺增生 (BPH) 组织发现其几乎不表达 PCA3 用敏感的实时定量反转录聚合酶链反应 (qrt-pcr) 分析正常前列腺组织和 BPH 组织中的 PCA3 显示也仅有较低水平的表达, 然而在前列腺癌组织中 PCA3 表达水平较非恶性组织平均上调近 60 倍此外, 在其他组织和肿瘤中未发现 PCA3 [1,6] 初步的研究显示,PCA3 在前列腺癌中过表达, 对于发现前列腺癌是一个潜在的标志物然而对于 PCA3 的功能研究鲜有报道, 本课题组曾经以前列腺癌细胞株 LNCaP 为研究对象, 采用针对 PCA3 的特异干扰 RNA 转染前列腺癌细胞结果发现,PCA3 sirna 转染 48 h 后能显著抑制 LNCaP 细胞中 PCA3 的表达水平 ; 运用 CCK-8 试剂盒检测发现, 细胞增殖能力在 PCA3 sirna 干扰组显著低于阴性对照组, 即在前列腺癌中细胞增殖是 PCA3 的调控效应之一 ; 克隆形成实验显示, 干扰 PCA3 的表达能够显著减弱 LNCaP 细胞的克隆形成 [2] 为了进一步研究 PCA3 在前列腺癌细胞株中的作用, 我们构建了 PCA3 过表达病毒载体 pcdh-cmv-mcs-ef1- copgfp-pca3, 为后期研究 PCA3 的功能及其与前列腺癌细胞的作用奠定了实验基础目前基因转染途径很多, 而慢病毒是较为有效的一种, 它具有毒力低感染效率高容纳外源性基因片段大等特点 PCA3 因分子片段较大, 为 bp, 我们选择慢病毒使其能将目的基因整合到靶细胞染色体中, 并得以长期稳定的表达该基因, 因此是目前较为理想的基因治疗载体系统 [7] 综上所述, 通过对重组体的酶切鉴定及测序, 结果表明成功构建了含有 PCA3 基因的慢病毒载体, 为进一步深入研究 PCA3 基因在前列腺中的作用机制, 进而为探索安全高效的治疗途径奠定了重要基础 [ 参考文献 ] [1] BUSSEMAKERS M J, VAN BOKHOVEN A, VERHAEGH G W, et al. DD3: a new prostate-specific gene, highly overexpressed in prostate cancer [J]. Cancer Res, 1999, 59(23): [2] 曹达龙, 叶定伟, 姚旭东, 等. 前列腺癌特异抗原 3 对前列腺癌 LNCaP 细胞增殖的影响 [J]. 中国癌症杂志, 2012, 22(2): [3] FERREIRA L B, PALUMBO A, DE MELLO K D, et al. PCA3 noncoding RNA is involved in the control of prostate-cancer cell survival and modulates androgen receptor signaling [J]. BMC Cancer, 2012, 12: 507. [4] SZELL M, BATA-CSORGO Z, KEMENY L. The enigmatic world of mrna like ncrnas: their role in human evolution and in human diseases [J]. Semin Cancer Biol, 2008, 18(2): [5] TURNER A M, MORRIS K V. Controlling transcription with noncoding RNAs in mammalian cells [J]. Biotechniques, 2010, 48(6): ix-xvi. [6] DE KOK J B, VERHAEGH G W, ROELOFS R W, et al. DD3 (PCA3), A very sensitive and specific marker to detect prostate tumors [J]. Cancer Res, 2002(62): [7] SAKUMA T, BARRY M A, IKEDA Y. Lentiviral vectors: basic to translational [J]. Biochem J, 2012, 443(3): ( 收稿日期 : 修回日期 : )

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽