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讲贺
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1 第 33 卷第 8 期西南大学学报 ( 自然科学版 ) 2011 年 8 月 Vol.33 No.8 JournalofSouthwestUniversity (NaturalScienceEdition) Auġ 2011 文章编号 : (2011) 小鼠 CHD5 基因 sirna 重组腺 1 病毒载体的构建及鉴定陈妮 1, 左国伟 2, 潘玥 1, 赖国旗 1,3, 杨根岭 1, 向廷秀 4, 韩建红 5, 黄云 6 1. 重庆医科大学实验动物中心, 重庆 ;2. 重庆医科大学医学检验系, 重庆 ; 3. 重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室, 重庆 ; 4. 重庆医科大学附属第一医院分子肿瘤及表观遗传学实验室, 重庆 ; 5. 泸州医学院实验动物科, 四川泸州 ;6. 泸州市畜牧局, 四川泸州摘要 : 目的 : 构建小鼠染色质区解旋酶 DNA 结合蛋白 5(CHD5) 基因干扰 RNA(smalinterferingRNA,siRNA) 重组腺病毒载体并在 NIH3T3 细胞中验证其干扰作用. 方法 : 人工合成靶向 CHD5 的 sirna 干扰序列, 用分子克隆的方法插入到穿梭载体 pses-hus 上, 并与腺病毒骨架质粒 padeasy-1 在 BJ5183 细菌中进行同源重组, 得到 padeasy-ses-hus-chd5sirna 重组质粒, 在 HEK293 细胞中包装成重组腺病毒 AdṟsimCHD5, 然后感染 NIH3T3 细胞, 用 RT-PCR 和 WesternBlot 方法检测其对 CHD5mRNA 和蛋白表达的干扰效果. 结果 : 得到高滴度 AdṟCHD5siRNA 重组腺病毒,RT-PCR 和 WesternBlot 结果表明该重组腺病毒能有效地降低 CHD5 基因的表达. 结论 : 成功构建 AdṟCHD5siRNA 重组腺病毒载体, 并在 NIH3T3 细胞上实现 CHD5 基因表达抑制, 为进一步研究 CHD5 基因功能奠定了基础. 关键词 : 染色质区解旋酶 DNA 结合蛋白 5 (CHD5);RNA 干扰 ; 腺病毒载体中图分类号 :Q783 文献标志码 :A 染色质区解旋酶 DNA 结合蛋白 5(chromodomainhelicaseDNA-bindingprotein,CHD5) 是 Swi/Snf 亚家族成员, 该家族成员包含 1 个 Swi-Snf 解螺旋酶和 2 个染色质区基序, 参与染色体重组并影响基因的转录.CHD5 基因位于人 1 号染色体短臂 (1p36) 上, 在神经胶质瘤等多种癌症中发现该区域的缺失与癌症 [1-3] [4] 发生存在紧密联系.Bagchi 等利用小鼠模型发现 CHD5 基因通过 p19arf/p53,p16ink4a 途径调控细胞的增殖衰老和凋亡等活动, 具有抑制肿瘤生长的功能.CHD5 基因可能是整个抑癌体系的上游关键基因, 详细的抑癌机制及与 1p36 上其他抑癌基因之间的相互作用尚待进一步研究阐明. 本研究通过筛选 3 段针对小鼠 CHD5 基因的有效干扰序列, 构建重组腺病毒感染载体, 感染 NIH3T3 细胞, 检测干扰效果, 为进一步应用 CHD5 基因探讨肿瘤发生机制及治疗提供新思路和新工具. 1 材料与方法 1.1 材料细菌质粒和细胞 DH5α 和 BJ5183 细菌,HEK293 细胞为本实验室冻存,NIH3T3 细胞由重庆市超声医学工程重点实验 1 收稿日期 : 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 ( /H1622). 作者简介 : 陈妮 (1984 ), 女, 广西玉林人, 硕士研究生, 主要从事宫颈癌基因治疗方面的研究. 通信作者 : 赖国旗, 教授.

2 58 西南大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb.swu.cn 第 33 卷室惠赠,pSES-HUS 和 padeasy-1 质粒由美国芝加哥大学分子肿瘤学实验室惠赠主要试剂 KpnⅠ 和 EcoRⅤ 等限制性核酸内切酶 T4 DNA 连接酶 DNA 胶回收试剂盒 RNA 提取试剂盒及 RT-PCR 试剂盒购自 TaKaRa 公司 ; 脂质体 2000 试剂盒购自 Invitrogen 公司 ; 质粒提取试剂盒购自 OME- GA 公司 ;DMEM 培养基胎牛血清购自 Hyclone 公司 ;Western 和 IP 细胞裂解液 β -actin 单克隆抗体辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠二抗和 DAB 试剂购自碧云天公司 ; CHD5 多克隆抗体购自 SataCruz 公司 ;PCR 引物由上海生工公司合成靶向 CHD5 干扰片段根据 Genbank 获得小鼠 CHD5 基因 cdna 序列 (NM_ ), 参考 RNA 干扰的设计原则, 应用 Dharmacon sirna Design 软件设计的 3 对针对 CHD5 基因 sirna 靶位点的寡核苷酸序列 ( 表 1), 送上海生工公司合成. 表 1 CHD5 基因 sirna 靶位点的寡核苷酸序列质粒名称 CHD5siRNA1 CHD5siRNA2 CHD5siRNA3 寡核苷酸序列 5 -AGGACAGAAGAGGTGGAGAATTTT-3 5 -ATTCTCCACCTCTTCTGTCCTTTT-3 5 -AAGAAGAAACTGAAGGAGAATTTT-3 5 -ATTCTCCTTCAGTTTCTTCTTTTT-3 5 -AGGAAGAAGGTGCAGGAGTTTTTT-3 5 -AAACTCCTGCACCTTCTTCCTTTT 方法 pses-hus-chd5sirna 载体的构建构建 pses-hus-chd5sirna 载体 ( 图 1). 用 SfiⅠ 酶切 pses-hus 质粒, 胶回收酶切大片段, 将 3 对靶向 CHD5 的干扰序列退火成为双链 DNA 片段, 分别与酶切后的 pses-hus 质粒连接,CaCl2 法转化到 DH5α 感受态细胞中, 用氨苄青霉素选择性培养基筛选阳性克隆, 提取质粒, 用 KpnⅠ 和 EcoRⅤ 双酶切鉴定正确后进行测序, 确保插入序列正确, 获得含 CHD5siRNA 表达框的重组腺病毒穿梭质粒 padeasy-ses-hus-chd5sirna 和 padeasy- SES-HUS 载体的构建首先用 CaCl2 法将 padeasy-1 转化到 BJ5183 感受态细胞中, 建成 BJ-easy 感受态细菌, 然后用 PmeⅠ 酶切 pses-hus,pses-hus-chd5sirna 质粒并胶回收纯化目的片段, 最后用 CaCl2 法转化目的片段到 BJ-easy 感受态细胞中. 氨苄青霉素及链霉素抗性培养基筛选阳性克隆, 提取质粒. 用 PacⅠ 酶切鉴定正确后转化 DH5α 感受态细胞进行扩增, 再提取质粒纯化获得 padeasy-ses-hus-chd5sirna 和 padeasy- 图 1 pses-hus-chd5sirna 图谱 SES-HUS 载体, 备用重组腺病毒的包装扩增与病毒滴度测定 HEK293 细胞培养 : 在 6 孔板中每孔接种个细胞, 用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基, 在 37,0.5% CO2 条件下培养 HEK293 细胞至融合度为 50%~60% 时进行转染. 转染 : 将 padeasy-ses-hus-chd5sirna 和 padeasy-ses-hus 经 PacⅠ 酶切回收后, 根据 Lipofectamine TM 2000Reagent 转染试剂说明书转染 HEK293 细胞, 并设只接种细胞不做处理的空白对照组. 转染后在 37,0.5% CO2 条件下继续培养 10~14d 后收集细胞,-80 和 37 反复冻融 4 次获取重组腺病毒原液, 病毒原液继续感染 HEK293 细胞使病毒大量扩增, 收集三轮扩增的病毒液, 分装后 -80 保存. 病毒滴度的测定 : 将病毒液进行对数稀释, 感染 HEK293 细胞, 参

第 8 期陈妮, 等 : 小鼠 CHD5 基因 sirna 重组腺病毒载体的构建及鉴定 59 [5] 照 Kaneto 等的 GFP 阳性细胞计数法计算病毒滴度. 1.2.

3 第 8 期陈妮, 等 : 小鼠 CHD5 基因 sirna 重组腺病毒载体的构建及鉴定 59 [5] 照 Kaneto 等的 GFP 阳性细胞计数法计算病毒滴度重组腺病毒感染 NIH3T3 细胞在 6 孔板中用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基培养 NIH3T3 细胞至融合度达到 50%~70%, 加入不同滴度的阴性对照病毒 AḏRFP 进行感染,48h 后观察细胞荧光, 确定最佳感染复数 (multiplicityofinfection,moi). 再将重组腺病毒以合适的 MOI 感染 NIH3T3 细胞, 感染后 48h 收集细胞检测 CHD5 基因表达. 实验设 AdṟCHD5siRNA 实验组 AḏRFP 对照组和不感染病毒的空白对照组 RT-PCR 检测 NIH3T3 细胞 CHD5mRNA 的变化用 RNA 提取试剂盒提取腺病毒感染 48h 的 NIH3T3 细胞总 RNA, 用 RT-PCR 试剂盒进行反转录,PCR 扩增 CHD5 基因和内参 β-actin.chd5 基因的上下游引物分别为 :5 GCAGGTCCTTCCACTTGAT3 和 5 CCGCCACCCTTTGATTAC3, 产物大小为 201bp. 反应条件为 :95 预变性 2 min,95 30s,49 30s,72 30s, 共 25 个循环, 最后 72 再延伸 5 min. 内参 β-actin 的上下游引物分别为 :5 - AGCGATGTACGTAGCCAT-3 和 5 -CTCTCAGCTGTGGTGTGAA-3, 产物大小为 228bp. 反应条件为 :94 预变性 2min,94 30s,56 30s,72 30s, 共 25 个循环, 最后 72 再延伸 5min.2% 琼脂糖电泳分析 PCR 产物, 检测 NIH3T3 细胞 CHD5mRNA 表达的变化 WesternBlot 检测 NIH3T3 细胞 CHD5 蛋白的变化用细胞裂解液提取 NIH3T3 细胞感染后 48h 的总蛋白,Bradford 法测定蛋白质量浓度, 取 50μg 蛋白进行 WesternBlot 检测. 蛋白样品经 SDS-PAGE 分离后转移到 PVDF 膜上,5% 脱脂奶粉封闭 ( 室温, 1h),CHD5 一抗孵育 (4,12h),TBST 漂洗, 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗孵育 ( 室温, 2h),TBST 漂洗,DAB 显色分析. 2 结果 2.1 pses-hus-chd5sirna 载体的测序提取阳性克隆菌质粒,KpnⅠ 和 EcoRⅤ 双酶切,RNA 干扰片段插入成功的克隆仅被 KpnⅠ 单酶切, 空载质粒 pses-hus 被切成 6.8bp 和 1.8bp 左右的 2 条片段. 选取电泳结果正确的克隆进行测序, 测序结果正确 ( 图 2). 图 2 pses-hus-chd5sirna 的测序鉴定

37.6kb 和 4.5kb 左右的片段, 酶切鉴定正确, 显示骨架载体同源重组成功 ( 图 3). 2.

4 60 西南大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb.swu.cn 第 33 卷 2.2 重组腺病毒 padeasȳses-hus-chd5sirna 和 padeasȳses-hus 载体的酶切鉴定 PmeⅠ 线性化 pses-hus-chd5sirna 和 pses-hus 后与 Adeasy-1 在 BJ5183 细菌内进行同源重组, 得到重组子 padeasy-ses-hus-chd5sirna 和 padeasy-ses-hus,pacⅠ 酶切后, 得到 2 个分别为 37.6kb 和 4.5kb 左右的片段, 酶切鉴定正确, 显示骨架载体同源重组成功 ( 图 3). 2.3 重组腺病毒 padeasȳses-hus-chd5sirna 和 padeasȳses-hus 的包装扩增及滴度数据 HEK293 细胞至融合度为 50%~60% 时转染 PacⅠ 线性化后的重组子 Adeasy-SES-HUS-CHD5siRNA 和 Adeasy-SES-HUS, 转染后 24h 可观察到少量细胞发出红色荧光, 随着时间延长, 荧光逐渐增多 ( 图 4), 10~14d 后病毒颗粒成熟, 收获病毒原液, 将其继续感染 HEK293 细胞进行 3 轮扩增的病毒液, 病毒 M. λ-hindⅢ DNA 标准 ;1. Adeasy-1;2. padeasy-ses-hus- CHD5siRNA1;3. padeasy-ses-hus-chd5sirna2;4. padeasy- SES-HUS-CHD5siRNA3;5.pAdeasy-SES-HUS. 图 3 重组腺病毒载体的 PacⅠ 酶切鉴定得到大量扩增. 滴度测试显示重组腺病毒 AdṟCHD5siRNA 和 AḏRFP 的滴度高达 pfu/ml 和 pfu/ml. 图 4 转染 CHD5 干扰腺病毒 72h 后的 HEK293 细胞 ( 40) 2.4 NIH3T3 细胞中 CHD5 基因的表达变化 AḏRFP 感染 NIH3T3 细胞的适宜感染复数为 100~500. 将 CHD5 干扰病毒颗粒等量混合后与对照病毒一起以感染复数值为 100 分别感染 NIH3T3 细胞 ( 图 5),48h 后提取细胞总 RNA 和总蛋白检测 CHD5 基因表达水平差异.RT-PCR 结果显示感染了 AdṟCHD5siRNA 的 NIH3T3 细胞 CHD5mRNA 水平降低 ( 图 6).WesternBlot 进一步证实干扰后 NIH3T3 细胞 CHD5 蛋白表达受到抑制 ( 图 7). 图 5 CHD5 干扰腺病毒感染 48h 后的 NIT3T3 细胞 ( 100)

第 8 期陈妮, 等 : 小鼠 CHD5 基因 sirna 重组腺病毒载体的构建及鉴定 61 M. DNA 标准 ;1,4. 空白组 ;2,5. 对照组 ;3,6. 干扰组. 图 6 RNA 干扰 48h 后 NIH3T3 细胞中 CHD5mRNA 的表达变化 1. 空白组 ;2. 对照组 ;3. 干扰组. 图 7 RNA 干扰 48h 后 NIH3T3 细胞中 CHD5 蛋白的表达变化 3 讨论 CHD5 基因在人类多种癌症中存在基因缺失突变现象.

RNA 干扰既是许多生物的基因调控 [7] 方法, 也是一种强大的了解基因功能的工具. 目前常用的制备 sirna 的方法主要包括化学合成法体外转录法制备 sirna 混合物和 sirna 表达框架 (sirnaexpressioncassetes,secs) 法 sirna 表达载体法.

5 第 8 期陈妮, 等 : 小鼠 CHD5 基因 sirna 重组腺病毒载体的构建及鉴定 61 M. DNA 标准 ;1,4. 空白组 ;2,5. 对照组 ;3,6. 干扰组. 图 6 RNA 干扰 48h 后 NIH3T3 细胞中 CHD5mRNA 的表达变化 1. 空白组 ;2. 对照组 ;3. 干扰组. 图 7 RNA 干扰 48h 后 NIH3T3 细胞中 CHD5 蛋白的表达变化 3 讨论 CHD5 基因在人类多种癌症中存在基因缺失突变现象. 前人的研究已证实 CHD5 作为一个抑癌基因, [4] 正向作用于 p19arf/p53 信号通路, 调控细胞的增殖凋亡和衰老等活动. RNA 是生物体内的重要物质, 内源性或外源性的双链 RNA(dsRNA) 经剪切形成的小片段 RNA 可通 [6] 过与互补序列的结合反作用于 DNA, 引起基因的表达沉默或抑制.RNA 干扰既是许多生物的基因调控 [7] 方法, 也是一种强大的了解基因功能的工具. 目前常用的制备 sirna 的方法主要包括化学合成法体外转录法制备 sirna 混合物和 sirna 表达框架 (sirnaexpressioncassetes,secs) 法 sirna 表达载体法. 前 3 种方法属于体外制备 sirna 法, 或价格昂贵或作用时间短, 且需直接操作 RNA, 不利于长期研 [8] [9] 究, 而 sirna 表达框架的缺点在于难以对细胞进行转染.He 等创建的 padessy 重组腺病毒系统通过细菌内高效同源重组, 结合抗生素抗性标记, 是一种方便有效构建 sirna 重组腺病毒体内表达载体的方法. 该方法发挥了腺病毒可以高效率感染细胞稳定表达外源基因, 达到长时间沉默基因的优势, 制备的重组腺病毒载体既可用于体外研究也可用于动物的体实验. 本实验通过 padessy 系统构建小鼠 CHD5 基因的重组干扰腺病毒载体, 同时使用 3 段有效干扰序列可以达到一定的鸡尾酒效应, 在 NIH3T3 细胞中证实其能稳定有效地抑制 CHD5 基因表达, 是进一步研究 CHD5 基因功能的有用工具. 参考文献 : [1] BRODEUR G M,SEKHONG,GOLDSTEIN M N.ChromosomalAberrationsinHumanNeuroblastomas[J].Cancer, 1977,40(5): [2] WHITEPS,THOMPSONP M,GOTOH T,etal.DefinitionandCharacterizationofaRegionof1p36.3Consistently DeletedinNeuroblastoma[J].Oncogene,2005,24(16): [3] CHEUNG T H,LO K W,YIMSF,etal.ClinicopathologicSignificanceofLossofHeterozygosityonChromosome1in CervicalCancer[J].GynecolOncol,2005,96(2): [4] BAGCHIA,MILLSA A.TheQuestforthe1p36TumorSuppressor[J].CancerRes,2008,68(8): [5] KANETO H,XU Gang.ActivationoftheHexosaminePathwayLeadstoDeteriorationofPancreaticBeta-CelFunction ThroughtheInductionofOxidativeStress[J].JBiolChem,2001,276(33): [6] ARAVIN A,TUSCHL T.IdentificationandCharacterizationofSmalRNAsInvolvedinRNA Silencing [J].FEBS Let,2005,579(26): [7] 荀恒杰, 于源华, 蔡林君.RNA 干扰分子的制作 [J].ChineseBuletinofLifeScience,2006,18(2): [8] 喻彬, 陈炜.RNAi 与肿瘤相关基因及在肿瘤治疗中的研究 [J]. 国际泌尿系统杂志,2007,27(4): [9] HETong-chuan,ZHOUShi-bin,LUIST,etal.ASimplifiedSystemforGenerationRecombinantAdenoviruses[J]. ProcNatlAcadSciUSA,1998,95(5):

6 62 西南大学学报 ( 自然科学版 ) htp://xbbjb.swu.cn 第 33 卷 ConstructionandIdentificationof asirnarecombinantadenovirusvectorfor MouseChromodomainHelicaseDNABindingDomain5Gene CHEN Ni 1, ZUO Guo-wei 2, PAN Yue 1, LAIGuo-qi 1,3, YANG Geṉling 1, XIANG Ting-xiu 4, HANJiaṉhong 5, HUANG Yun 6 1. CenterofExperimentalAnimals,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China; 2. DepartmentofLaboratoryMedicine,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China; 3. KeyLaboratoryofInfectiousDiseaseMolecularBiologyofMinistryEducation, ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China; 4. MolecularOncologyandEpigeneticsLaboratoryoftheFirstAfiliatedHospital, ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China; 5. DepartmentofLaboratoryAnimal,LuzhouMedicalColege,LuzhouSichuan646000,China; 6.LivestockBureauofLuzhouCity,LuzhouSichuan646000,China Abstract:Objective:Toconstructarecombinantadenoviruscarryingashortinterfering RNA (sirna) targetingchd5d (chromodomainhelicasednabindingdomain5)geneandindentifyitsinhibitiveefect innih3t3cels.methods:thesirnasequencestargetingchd5geneweresynthesizedandclonedinto theshutleplasmidpses-husandthenhomogenouslyrecombinedwiththeadenovirusbackboneplasmid padeasy-1 in E.coli BJ5183 to generate the recombinant adenoviral plasmid padeasy-ses-hus- CHD5siRNA.pAdeasy-SES-HUS-CHD5siRNA wasthentransfectedinto HEK293celsforpackingof AdṟCHD5siRNAvirus.TheexpressionofCHD5wasdeterminedbyRT-PCRandwesternblotafteriṉ fection of AdṟsimCHD5 in NIH3T3 cels for evaluating theinhibitive efect. Results: The Adṟ CHD5siRNAobtainedwasshowntohaveahightiterandreducetheexpressionofCHD5determinedby RT-PCRandwesternblotafterinfection.Conclusion:TherecombinantadenovirusAdṟCHD5siRNA was successfulyconstructedandexpressedinnih3t3cels,whichcouldprovideabasisforfurtherresearch onthefunctionandmechanismofchd5. Keywords:chromodomainhelicaseDNAbindingdomain5;RNAinterference;adenovirusvector 责任编辑夏娟

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽