采用生物检测法进行检测时, 环亚胺类毒素的存在会引起一种物理反应, 通常使动物致死环亚胺类毒素如图 1B 所示, 根据理化性质也被归类为亲脂性海洋毒素虽然这些毒素目前尚未受到管制, 但欧洲食品安全局 (EFSA) 指出, 这类毒素的毒性数据以及其贝类中的存在情况应当被更多地收集自 2011 年

Size: px

Start display at page:

Download "采用生物检测法进行检测时, 环亚胺类毒素的存在会引起一种物理反应, 通常使动物致死环亚胺类毒素如图 1B 所示, 根据理化性质也被归类为亲脂性海洋毒素虽然这些毒素目前尚未受到管制, 但欧洲食品安全局 (EFSA) 指出, 这类毒素的毒性数据以及其贝类中的存在情况应当被更多地收集自 2011 年"

栾录羿
5 years ago
Views:

1 [ 应用纪要 ] Arjen Gerssen 1 Mirjam D. Klijnstra 1 Simon Cubbon 2 和 Antonietta Gledhill 2 1 瓦格宁根大学食品安全研究所 ( 荷兰瓦格宁根 ) 2 沃特世公司 ( 英国曼彻斯特 ) 应用优势这是一种能够快速可靠地分析贝类中管制和非管制亲脂性海洋生物毒素的方法与传统的 H P LC/MS/MS 方法相比, 其分析速度提高了 4 倍 :( 单次分析由 20 min 缩短为 5 min) 本方法还可以满足规定的检测水平, 可用于代替小鼠生物检测法简介食用受到生物毒素污染的贝类 ( 贻贝牡蛎蛤等 ) 可能会引起人体严重中毒, 如腹泻性贝毒 (DSP) 由于 DSP 毒素具有亲脂性, 通常将其归类为亲脂性海洋生物毒素海洋生物毒素由不同种类的浮游植物自然产生, 因此也称之为藻毒素亲脂性海洋生物毒素在理化性质方面呈现出多样性, 如羧酸磺酸氨基和亚氨基官能团, 因此具有一定的复杂性欧盟 (EU) 立法对各种类别的毒素进行管制, 并在官方控制程序中具体介绍了对这些毒素实施监控的方式如图 1A 所示, 应当受到监控的亲脂性生物毒素有冈田软海绵酸 (OA); 鳍藻毒素 1 2 3(DTX1,2,3), 其中 DTX3 分别是 OA,DTX1 和 2 的酯类形式 ; 扇贝毒素 1 2(PTX1,2); 虾夷扇贝毒素 (YTX);45OH 虾夷扇贝毒素 (45OH YTX); 同源虾夷扇贝毒素 (homoytx);45oh 同源虾夷扇贝毒素 (45OH homoytx); 原多甲藻酸 1 2 和 3(AZA1,2,3) 1 在 2011 年 7 月之前, 上述毒素的官方检测方法为一种生物检测法, 该方法基于大鼠口服贝类肉或小鼠腹腔注射贝类提取物进行检测这种方法主要存在两个问题 : 第一, 有违生物伦理学 ; 第二, 无法非常科学地可靠地测定痕量的特定毒素沃特世解决方案 A) R 1 R 2 CH H 3 B) ACQUITY UPLC 系统 ACQUITY UPLC BEH C 18 色谱柱 Xevo TQ-S 质谱仪 TargetLynx 应用软件 QUANPEDIA 数据库 -1 CH 3 CH 3-2 H CH 3 R 1 R 2-1 H CH 3-2 CH 3 CH 3-3 H H 1 R -1 OH -2 H R 1 R 2 R 3 R 4 -E H OH CH 3 -F H OH CH 3 -G OH H H 关键词 R 1 n H 1 H 2 45OH OH 1 45OH OH spirolide C 贝类, 生物毒素, 亲脂性, 藻毒素, 贻贝, 蛤, 牡蛎, 腹泻性贝毒,DSP 图 1. a) 管制毒素和 b) 非管制环亚胺类毒素的化学结构式 1

2 采用生物检测法进行检测时, 环亚胺类毒素的存在会引起一种物理反应, 通常使动物致死环亚胺类毒素如图 1B 所示, 根据理化性质也被归类为亲脂性海洋毒素虽然这些毒素目前尚未受到管制, 但欧洲食品安全局 (EFSA) 指出, 这类毒素的毒性数据以及其贝类中的存在情况应当被更多地收集自 2011 年 7 月起,LC/MS/MS 成为贝类中亲脂性海洋生物毒素的官方检测方法 2 欧盟引用的 LC/MS/ MS 方法是使用固定的提取步骤提取生物毒素, 再通过传统 LC 方法在酸性或碱性流动相下进行分离, 并使用串联四极杆 MS 进行检测本次研究的目的是建立一种在碱性条件下比传统 LC 方法更快速的常规分析方法, 其中还包括 EFSA 关注的其他非管制类化合物的分析在本应用纪要中, 我们使用 Waters ACQUITY UPLC 系统串联 Xevo TQ-S 质谱仪, 对包括部分非管制环亚胺类毒素在内的多种亲脂性海洋生物毒素进行了为时五分钟的检测分析 UPLC 技术能够缩短分析运行时间, 并且不会对色谱峰分离度和峰质量产生不良影响, 而 Xevo TQ-S( 串联四极杆质谱仪 ) 可提供超高灵敏度的检测, 还能够在切换电喷雾正离子 (ESI + ) 和负离子 (ESI - ) 模式下同时采集多重反应监测 (MRM) 跃迁数据, 该采集过程是分析亲脂性海洋生物毒素的必需步骤标准品制备经认证的标准品 OA DTX1,2 PTX2 YTX AZA1,2,3 环亚胺毒素(GYM) 和 13- 去甲基 Spirolide C (SPX1) 均购自加拿大哈利法克斯市国家研究委员会海洋生物科学研究所 (NRC-CNRC) 江瑶毒素 E(PnTX-E) F(PnTX-F) 和 G(PnTX-G) 的半纯化标准品购自新西兰尼尔森的 Cawthron 研究所各种毒素的标准储液均采用甲醇制备使用空白贻贝提取物并加入储液, 绘制基质加标 (MMS) 校准曲线空白提取物按照样品提取方法进行制备基质加标标准品的浓度分别为验证浓度的和 1.5 倍 ( 受管制毒素的验证浓度水平与允许浓度接近, 如表 1 所示 ) 亲脂性海洋生物毒素欧盟限制浓度 (MMS) (µg/kg) OA DTX1 DTX2 PTX2 160 µg OA 当量 /kg* AZA µg AZA1 当量 /kg* 虾夷扇贝毒素 1000 µg YTX 当量 /kg* GYM PnTX-E PnTX-F 200 µg/kg* SPX1 100 µg/kg* PnTX-G 50 µg/kg* OA DTX1 DTX2 PTX2 160 µg OA 当量 /kg* AZA µg AZA1 当量 /kg* 虾夷扇贝毒素 1000 µg YTX 当量 /kg* GYM PnTX-E PnTX-F 200 µg/kg* SPX1 100 µg/kg* PnTX-G 50 µg/kg* 表 1. 亲脂性海洋生物毒素的欧盟限制浓度和建议报出浓度 * 为食用贝类 2

实验 UPLC 条件系统 : 运行时间 : ACQUITY UPLC 5.0 min 色谱柱 : ACQUITY UPLC BEH C 18 柱温 : 40 样品温度 : 10 流动相 A: 2.1 100 mm,1.7 µm 6.7 mm 氢氧化铵水溶液流动相 B: 乙腈 / 水 (9:1) 含 6.

3 实验 UPLC 条件系统 : 运行时间 : ACQUITY UPLC 5.0 min 色谱柱 : ACQUITY UPLC BEH C 18 柱温 : 40 样品温度 : 10 流动相 A: mm,1.7 µm 6.7 mm 氢氧化铵水溶液流动相 B: 乙腈 / 水 (9:1) 含 6.7 mm 氢氧化铵弱清洗液 : 水 / 乙腈 (9:1) 强清洗液 : 乙腈 / 水 (9:1) 流速 : 进样体积 : 5 µl 0.6 ml/min 时间流速 %A %B 曲线 (min)(ml/min) 初值 N/A MS 条件质谱仪 : Xevo TQ-S 电离模式 : ESI -/+ 毛细管电压 : 3.0 kv 源温度 : 150 脱溶剂气温度 : 500 脱溶剂气流量 : 800 L/h MRM 方法 : 见表 2 样品提取准备三份肉贝类全组织匀浆 (1 g), 分别用 3 ml 甲醇进行提取分别加入甲醇后涡旋混合完成涡旋混合后, 将提取物在 2000 g 下离心 5 min, 并转移上清液至 10 ml 容量瓶中待第三次提取完成后 ( 共 9 ml), 加入适量甲醇至体积为 10 ml 所得贝类提取原液先用 0.2 µm 膜过滤器过滤, 然后再加标或进行分析为测定 DTX3(OA DTX1 和 2 的酯类形式 ) 的含量, 还用 2.5 M 氢氧化钠对提取物进行了碱水解再将碱性混合物在 76 下加热 40 min, 并冷却至室温, 最后用 2.5 M 盐酸中和 () () (s) (V) (ev) trinor YTX YTX homoytx OH YTX OH Homo YTX COOH YTX COOH OH YTX COOH Homo YTX OA/DTX DTX GYM SPX PnTX-G Me SPX G PnTX-F PnTX-E AZA AZA AZA AZA1/ / AZA AZA AZA4/ AZA PTX PTX PTX PTX2sa 表 2. 各种亲脂性海洋生物毒素的 MRM 通道 3

4 单日验证为评估开发出的 UPLC/MS/MS 方法的性能, 在单个实验室进行了单日验证研究评估参数如下 : 线性回收率重复性实验室内重现性 ( 根据重复性经验计算得出 ) 选择性和判断标准 (CCα) 使用来自荷兰国家监测计划的空白贝类进行验证验证所用的贝类包括贻贝( 紫贻贝 Mytilus edulis) 牡蛎( 长牡蛎 Crassosrea gigas) 鸟蛤( 欧洲鸟蛤 Cerastoderma edule) 和剑蛏 ( 大西洋蛏子 Ensis directus) 为了确保验证所用的贝类为空白样品, 在研究开始之前对这些贝类进行了分析以确定是否存在表 2 中所示的毒素将七份不同的贝类样品 ( 四份贻贝一份牡蛎一份鸟蛤和一份剑蛏 ) 进行提取并加标, 浓度分别为验证浓度的和 1.5 倍结果与讨论用甲醇稀释各个环亚胺类毒素的储液, 用以通过 IntelliStart 技术获取调谐参数 IntelliStart 能够自动进行仪器设置化合物调谐和系统适用性检查, 极大地简化了 LC/MS 系统的使用流程各种毒素的 m/z 锥孔电压和碰撞能量见表 2 对于贵重的毒素标准品, 可以用提取物加标代替原贝类组织匀浆, 能节约 10 倍量的标准品提取物加标这一方法因对所有相关毒素具有高提取率 (>90%) 而得到了验证因此, 加标提取物导致假阴性结果的可能性非常低 UPLC/MS/MS 方法的开发基于之前由 Gerssen 等人所介绍的色谱法 3 UPLC 分离为各类不同毒素提供了良好的结果, 仅原多甲藻酸受碱性条件的影响导致峰形有一定程度的劣化但由于 Xevo TQ-S 具有较高的选择性和灵敏度, 色谱峰仍能够在法规要求的灵敏度水平下轻松检出, 因此这在常规应用中不会成为问题各种毒素经五分钟 UPLC 分离得到的 MRM 色谱图如图 2 所示鳍藻毒素 -2 扇贝毒素 -2 冈田软海绵酸原多甲藻酸 -1 原多甲藻酸 -2 鳍藻毒素 -1 原多甲藻酸 -3 江瑶毒素 -E 江瑶毒素 -F 虾夷扇贝毒素江瑶毒素 -G 13- 去甲基 Spirolide C 时间环亚胺毒素时间图 2. 贻贝基质中 1.0 倍验证浓度的基质匹配标准品的 MRM 色谱图 4

5 对于每种化合物, 存在两个优化的 MRM: 一个用于确证, 而另一个用于定量两个 MRM 结果之间的离子比率可作为分析标准之一, 用于确定生物毒素是否确认为阳性另一个监管标准是化合物最大残留量 (MRL) 使用 TargetLynx 处理软件能够自动标记规定范围内的参数, 当这些参数超过限制浓度时, 分析人员能够非常容易地观察到各种毒素的检测灵敏度良好, 甚至在浓度为验证浓度 ( 管制毒素的规定浓度 ) 的倍时, 仍可获得大于 3 的信噪比目前, 部分受管制毒素的标准品仍无法获得 (PTX1 45OH YTX homoytx 和 45OH homoytx) 为测定这些毒素,MRM 通道也包含在根据现有毒素标准品 ( 即 PTX2 和 YTX) 结构而得到的方法中此外, 其它非管制亲脂性毒素的 MRM 也包括在内, 可利用该确证方法对其进行筛选, 如图 2 所示这些实验中确定的方法参数现已整合到 Quanpedia 数据库中, 此系统的所有用户均可获取该方法规程单日验证在单日验证中, 对不同方法的性能参数进行了评估, 如线性回收率重复性实验室内重现性选择性和 CCα, 如表 3 所示 (µg/kg) (%) 表 3. 单日验证试验结果 1 包含 ensis 基质, 2 不含 ensis 基质,* 重现性较差 RSDr (%) RSDrl (%) CCα (µg/kg) OA DTX DTX YTX AZA AZA AZA PTX GYM SPX * 141 SPX PinE * 347 PinF PinG

6 对于所有毒素, 基质加标校准曲线在所用的浓度范围 ( PL) 内表现出良好线性 (R 2 > 0.990) 各种毒素的回收率结果良好, 均介于 91%-104% 的范围内 PnTx-E 除外, 其回收率达到 122% 与其它分析物相比, 如果是采用甲醇制备提取物, 这一先洗脱的化合物 ( 保留时间为 1.2 min) 易于形成甲酯, 这恰好解释了回收率较预期高但重复性较差 (RSDr 23.1%) 的原因据观察, 所有受管制化合物的重复性良好而在非管制毒素中, 只有 PnTx-E 和 SPX1 略高于预期值对于 SPX1, 出现上述情况是由蛏类基质引起的, 如果去除蛏类的结果并重新计算, 则重复性结果符合要求, 在含蛏类基质和不含蛏类基质的情况下, 重复性分别为 14.6% 和 12.8% 若要确定一份样品是否不符合规定, 那么毒素浓度应等于或高于判断限 (CCα) 判断限是这样一种浓度, 在该浓度下能够以 1-α 或 95%(α=5%) 的概率推断样品超出允许的浓度, 从而判定该样品不符合规定 6

7 结论通过利用 UPLC 系统与串联四极杆 MS(Xevo TQ-S), 开发了一种用于分析贝类中管制和非管制亲脂性海洋生物毒素的快速可靠方法与传统的 HPLC/MS/MS 方法相比, 其分析速度提高了 4 倍, 每次分析所用时间由 20 min 缩短至 5 min 本方法还能够满足规定的检测水平, 可用于代替小鼠生物检测法 IntelliStart 技术的应用能够使用户快速自动化地确定最佳参数设置, 并且在可以获得更多的毒素标准品时, 这种方法还能进一步扩展该方法 ( 以及所有仪器设置 ) 现已收录到 Quanpedia 数据库中, 以便在其他实验室中展开应用参考文献 1. European Commission. Laying down implementing measures for certain products under Regulation (EC) No. 853/2004 of the European Parliament and of the Council and for the organisation of official controls under Regulation (EC) No. 854/2004 of the European Parliament and of the Council and Regulation (EC) No 882/2004 of the European Parliament and of the Council, derogating from Regulation (EC) No 852/2004 of the European Parliament and of the Council and amending Regulations (EC) No 853/2004 and (EC) No 854/2004. Off J Eur Commun L 2005; 338: European Commission. Commission Regulation (EU) No 15/2011 of 10 January 2011, amending Regulation (EC) No. 2074/2005 as regards recognized testing methods for detecting marine biotoxins in live bivalve molluscs. Off. J. Eur. Commun. 2011; L6: Gerssen A, Mulder PPJ, McElhinney MA, De Boer J. Liquid chromatography - tandem mass spectrometry method for the detection of marine lipophilic toxins under alkaline conditions. J Chromatogr A. 2009; 1216: Waters ACQUIT Y UPLC UPLC,Xevo 和 T he Science of W hat s Possible 是沃特世公司的注册商标 IntelliStart QUANPEDIA 和 TargetLynx 是沃特世公司的商标其他所有商标均归各自的拥有者所有 2013 年沃特世公司印制于中国 2013 年 2 月 ZH AG-PDF 沃特斯中国有限公司沃特世科技 ( 上海 ) 有限公司北京 : 上海 : 广州 : 成都 : 香港 : 免费售后服务热线 :800 (400)

CHCN_ EN.qxd.qxd

CHCN_ EN.qxd.qxd 安捷伦 6460 三重四极杆液质联用仪用于亲脂性海洋贝类毒素的高灵敏度可靠分析应用简报环境, 食品安全作者 liver Keuth Chemical and Veterinary Analytical Institute Muensterland-Emscher-Lippe, Muenster,Germany 摘要海洋生物毒素正在世界各个地方日益威胁着人类的健康毒素是由几类微观浮游藻类生成的,