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开姜萧
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1 第 38 卷 00 年月分析化学 (FENXIHUAXUE) 研究 ChineseJournalofAnalyticalChemistry 第期 ~ DOI:0.374/SP.J 液相色谱 - 串联质谱法检测贝类产品中腹泻性贝类毒素母清林 * 方杰万汉兴王晓华曹柳燕张庆红 ( 浙江省舟山海洋生态环境监测站, 舟山 36000) ( 中国海洋大学环境科学与工程学院, 青岛 6600) 摘要建立了贝类组织中种腹泻性贝毒 (DiarrheticShelfishPoisoning,DSP) 聚醚类毒素 - 大田软海绵酸 (okadaicacid,oa) 和鳍藻毒素 (dinophysistoxiṉ,dtx-) 的高效液相色谱 - 串联质谱分析方法贝类样品经 80% 甲醇溶液提取, 经正己烷脱脂和 HLB 固相萃取柱净化, 采用 PursuitC8(50mm 3.0mm,3 mm,varian 公司 ) 色谱柱分离, 以 80%(V/V) 甲醇水溶液为流动相等度洗脱, 负离子扫描, 在多反应监测 (MRM) 模式下进行定性与定量分析在 4 ~00mg/L 范围内线性关系良好,OA 和 DTX- 的最低定量限均为 mg/kg 添加水平在 5 和 50mg/kg 时的平均回收率大于 80%, 相对标准偏差小于 %(n = 6) 关键词液相色谱 - 串联质谱 ; 贝类毒素 ; 大田软海绵酸 ; 鳍藻毒素 ; 贝类产品引言贝类毒素种类多分布广毒性强贝类毒素检测直接关系到海产品的食用安全 [] 腹泻性贝毒 (Diarrheticshelfishpoisoning,DSP) 是一种藻类毒素, 因被人食用后主要产生以腹泻为主要特征的中毒效应而得名 DSP 是一类脂溶性多环醚类天然化合物, 主要来源于鳍藻属 (Dinophysisspp.) 和原甲藻属 (Prorocentrumspp.) 等有毒藻, 通过食物链传递而大量存在于软体贝类中食用贝类导致腹泻的 [] 症状最早于 0 世纪 60 年代出现在荷兰 0 世纪 70 年代,Yasumoto 等发现腹泻性贝毒根据毒素的结构,DSP 可以分成 3 类 : 聚醚类毒素 - 大田软海绵酸 (OA) 和鳍藻毒素 (DTX); 大环聚醚内酯毒素 - 扇贝毒素 (PTX); 融合聚醚毒素 - 虾夷扇贝毒素 (YTX) 此外, 大田软海绵酸的二元醇酯衍生物尽管没有表现出和大田软海绵酸同样的毒性作用, 但可以水解生成大田软海绵酸, 因此也应视为此类毒素 OA 和 DTX- 是蛋白磷酸酶 (PP 和 PPA) 的有效抑制剂, 因此可导致腹泻小肠上皮细胞的腹泻型退化和促进癌变的发展 ; 同时可能影响到 DNA 复制和修复过程中的酶活性, 从而带来致畸效应 [3,4] 目前, 已有多个国家或组织制定了贝类水产品中 DSP 限量标准, 范围为 0~00μg/kg (OA) 目前, 常用的 DSP 分析方法主要分为生物检测和物理化学检测法及其它特殊检测方法, 主要包括小白鼠分析法 [5~8] 气相色谱法液相色谱法 [9,0] 液相色谱 - 质谱联用法 [,] 酶活性抑制检测技术 [3] 酶联免疫法 [4~6] 细胞毒性检测技术等 [7,8] 生物检测技术难于对毒素进行分离检测而气相色谱技术需要繁琐的衍生步骤, 液相色谱法缺乏准确的定性能力易造成假阳性随着 LC-MS 联用技术的发展, 其在环境分析领域的应用越来越广液相色谱优越的分离能力与质谱强大的定性定量功能相结合, 可以克服其它方法定性不准确的缺点 Draisci [] 和 Paulo [] 等利用液相色谱质谱联用检测了贝类中的腹泻性贝毒, 液液萃取净化, 采用一级质谱 SIM 模式 ( 选择离子监测 ) 进行定性与定量分析液液萃取技术试剂用量大, 并且操作过程中容易产生乳化现象, 采用一级质谱 SIM 模式定性能力较弱容易产生假阳性本研究利用固相萃取液相色谱 - 串联质谱测定贝类中两种常见的腹泻性贝毒 OA 和 DTX-, 固相萃取能很好地去除杂质的干扰, 操作简便,OA 的检测离子对为 m/z803.6/55. 和 /563.,DTX- 的检测离子对为 m/z87.4/55. 和 87.4/3. 采用二级质谱 MRM 模式 ( 多反应监测 ) 进行定性分析, 选择两对离子对定性更加准确, 利用其中丰度较高的离子对定量可以提高灵敏度本方法应用于实际样品分析, 灵敏度准确度均能满足日常检测的要求收稿 ; 接受本文系浙江省环保科技计划专项基金 (No.08-9) 资助项目 * m_qinglin@63.com

2 分析化学第 38 卷实验部分. 仪器与试剂 00L 液相色谱串联质谱仪 (Varian 公司 );KQ-300E 超声波仪 ( 昆山仪器公司 ); 氮吹仪 ( 安谱公司 ); 位固相萃取装置 (Supelco 公司 );OasisHLB 固相萃取小柱 (60mg,3mL,Waters 公司 );L-550 离心机 ;Mili-Q 纯水仪 (Milipore 公司 ) OA 和 DTX-( 北京伊普瑞斯科技公司 ), 甲醇丙酮甲酸正己烷 ( 色谱纯,TEDIA 公司 ), 其它试剂均为分析纯实验用水为 Mili-Q 超纯水. 样品处理称取.0g 贝类样品, 加入 4 ml80% (V/V) 甲醇溶液, 超声提取 5 min, 以 4000r/min 离心 0min, 重复提取一次, 合并提取液, 用 5mL 正己烷脱脂两次, 弃去正己烷层, 剩下溶液在 45 下氮气吹至约 ml 用于固相萃取 HLB 固相萃取小柱分别用 3 ml 甲醇水活化, 上样后用 3 ml 水和 3 ml0%(v/v) 甲醇水溶液清洗, 干燥后用 5 ml 甲醇洗脱, 氮气吹干后用 ml 初始流动相溶解, 过 0. mm 滤膜后上机测定.3 液相色谱 - 质谱条件色谱条件 :PursuitC8 液相色谱柱 (50mm 3.0mm,3 mm, 美国 Varian 公司 ); 流动相 A 为超纯水,B 为甲醇 ;80%(V/V) 甲醇溶液等度洗脱 6min, 流速 0.4mL/min; 进样体积 0 ml; 柱温为 30 质谱条件 : 电离方式 : 电喷雾离子源, 负离子扫描 (ESI-), 多反应监测 (MRM); 电喷雾电压 -400 V, 保护电压 -600V; 离子源温度 50 ; 雾化气为空气, 压力 380kPa, 干燥气为氮气, 压力 5kPa, 干燥气温度 300 ; 碰撞气为氩气, 压力为 0.9kPa 碰撞能量均为 45.5V 3 结果与讨论 3. 质谱条件的优化利用注射泵以 0μL/min 流动注射的方式将 mg/l OA 和 DTX- 标准溶液注入离子源, 分别在正负离子模式下选择适合每种化合物的电离方式, 发现这两种化合物均适宜于负离子模式利用一级质谱全扫描分析每种化合物的分子离子峰, 选取 m/z803.6 和 87.6 为母离子, 优化电喷雾电压保护电压毛细管电压等利用二级质谱全扫描收集各自的子离子信息, 确定适合定性与定量分析的特征离子对 OA 的检测离子对为 m/z803.6/55. 和 803.6/563.;DTX- 的检测离子对为 m/z87.4/ 55. 和 87.4/3.; 优化碰撞能量均为 45.5V 随着碰撞气压力的升高, 离子响应信号也增强, 碰撞气压力选择 0.9kPa 3. 提取剂的选择生物体常用的提取剂有乙腈甲醇丙酮等, 本实验比较了 80% 乙腈溶液和 80% 甲醇溶液的提取效率结果表明,80% 甲醇溶液提取效率优于 80% 乙腈水溶液在同一加标水平, 两种提取剂提取后的溶液经相同的固相萃取步骤后色谱图如图所示可能由于两种提取剂所提取的溶液基质有一定差异, 故两次提取 OA 和 DTX- 保留时间略有不同 [] 对于贝类样品, 仅采用液液分配很难去除干扰物, 并且在实验中发现, 液液萃取时容易产生乳化现象, 难于破乳, 从而影响操作, 故将粗提溶液采用正己烷脱脂后再用固相萃取小柱对提取液进一步净化本实验采用 HLB 固相萃取小柱, 萃取时先依次用 3 ml 甲醇 3 ml 水预处理小柱, 然后加入预先经正己烷脱脂氮吹后的样品溶液, 用 3mL 纯水淋洗盐分,3mL0% 甲醇溶液淋洗, 然后干燥柱床, 用 5mL 甲醇洗脱 ; 氮气吹干后用 ml80% 甲醇溶液溶解残渣, 超声溶解后过 0. mm 滤膜供 LC-MS/ MS 测定 3.3 方法的线性范围和检出限对于 LC-MS 分析, 基质效应常常成为影响准确定量的干扰因素为消除基质效应对分析结果的影响, 将 DSP 标准溶液逐级稀释后添加到.0g 空白基质中做标准曲线, 配制成样品中含量为,5,

3 第期母清林等 : 液相色谱 - 串联质谱法检测贝类产品中腹泻性贝类毒素图两种提取溶提取同一加标水平样品总离子流图 ( 加标 0 mg/kg) Fig. TICsoftwokindsextractionatthesamespikedlevel(spikedlevel0 mg/kg ) 5,50 和 00μg/kg 的系列用与样品提取相同的步骤处理后进行测定, 以测定的峰面积与加标浓度绘制标准曲线,X 轴代表峰面积,Y 轴代表样品浓度在 ~00μg/kg 范围内,OA,DTX- 相关系数 R 分别为 0.996,0.999 分别在空白基质中添加标样, 计算定量下限 (LOQ,S/N >0),OA, DTX- 均为 mg/kg 3.4 回收率与精密度以贻贝为研究对象, 考察了方法的回收率和精密度 ( 表 ) 在空白样中添加了个水平的 DSP 标准, 按照实验方法测定回收率和精密度, 每个水平重复测定 6 次结果表明, 在 DSP 添加量为,5 和 00μg/kg 时,OA 的平均回收率分别为 80.%,83.9% 和 90.%,DTX- 的平均回收率分别为 8.%,83.3% 和 0.0, 相对标准偏差均小于 % 表方法的加标回收率和精密度 Table RecoveriesandRSDsofthemethod 化合物 Compounds 加入量 Added(mg/kg) 回收率 Recovery(%) 相对标准偏差 RSD(%,n = 6) 大田软海绵酸 Okadaicacid(OA).0,5.0, ,83.9, ,9.5,9. 鳍藻毒素 Dinophysistoxiṉ (DTX-).0,5.0, ,83.3,0.0 0.,9.9, 样品分析利用本方法测定了市售 85 个贝类样品, 均未检出 DSP 空白样品及空白加标样品( mg/kg) 色谱图见图对当地市售的文蛤贻贝等进行检测, 均未检出 DSP 实验结果表明, 本方法操作简便快速, 灵敏度高, 可以消除假阳性, 其回收率及重复性能满足日常监测的要求图空白贻贝样品 (a) 和加标 mg/kg(b) 的色谱图 Fig. Chromatogramsofblankmusselsample(a),andmusselsamplespikedwithOAandDTX-of mg/kg (b)

4 分析化学第 38 卷 References JIANG Tao( 江涛 ),JIANGJiu-Tian( 江久天 ).ChineseJ.Anal.Chem.( 分析化学 ),008,36():460~464 YasumotoT,OshimaY,SugawaraW,FukuyoY,OguriH,IgarashiT,FujitaH.Bul.JpnSocSciFish,980, 46:405~4 3 ZHOU Ming-Jiang ( 周名江 ),LIJun( 李均 ),YU ReṉCheng( 于仁诚 ),YAN Tian( 颜天 ),FU Meng( 傅萌 ). ChineseJournalof MarineDrugs( 中国海洋药物 ),999,7(3):48~54 4 CordierS,MonfortC,MiossecL,RichardsonS,BelinC.Environ.Res.,000,84():45~50 5 QIU De-Quan( 邱德全 ),LIN Yong-Shui( 林永水 ),ZHOUJiṉ Ming( 周近明 ),XIONGShi-Lin( 熊仕林 ).Tropic Oceanology( 热带海洋 ),996,5(4):46~49 6 WUShiwei( 吴施卫 ),ZHANG ChuṉChao( 张纯超 ),LU Chu-Qian( 卢楚谦 ),LIU Jing-Qin( 刘景钦 ),LIANG QianILin( 梁谦林 ).MarineEnvironmentalScience( 海洋环境科学 ),005,4(4):48~5 7 WUShi-Wei( 吴施卫 ),ZENG Miao( 曾淼 ),LU Da-Peng( 卢大鹏 ),LUO Yi-Dan( 罗一丹 ),JiangTiaṉJiu( 江天久 ).MarineEnvironmentalScience( 海洋环境科学 ),008,7():66~8 8 LiuCai-Cai( 刘材材 ),XiangLing-Yun( 项凌云 ),WangJiṉHui( 王金辉 ),Zhang Hao-Fei( 张昊飞 ),YeShu-Feng ( 叶属峰 ),XuRen( 徐韧 ),ChengXiang-Sheng( 程祥圣 ).MarineEnvironmentalScience ( 海洋环境科学 ),00, 9():4~7 9 LIUReṉYan( 刘仁沿 ),FU YuṉNa( 付云娜 ),GUANDao-Ming( 关道明 ).MarineEnvironmentalScience ( 海洋环境科学 ),004,3():70~7 0 CHENZe-Ling( 陈则玲 ),FU YuṉNa( 付云娜 ),GONGNing( 巩宁 ).MarineEnvironmentalScience ( 海洋环境科学 ),000,9():73~78 DraisciR,PaleschiL,GiannetiL,LucentiniL,JamesK.J,BishopA.G,SatakeM,YasumotoT.J.Chromatogr.A,999,847(-):3~ ValeP,deM Sampayo M A.Toxicon,00,40():33~4 3 LIAi-Feng( 李爱峰 ),YU ReṉCheng( 于仁成 ),LIJun( 李均 ),TANG Xiang-Hai( 唐祥海 ),WANG YuṉFeng( 王云峰 ),YANTian( 颜天 ),ZHOU Ming-Jiang( 周名江 ).ChineseJ.Anal.Chem.( 分析化学 ),006,34(3):83~ 87 4 LIU ReṉYan( 刘仁沿 ),LIANG Yu-Bo( 梁玉波 ),ZHANGFang( 张芳 ),XU Dao-Yan( 许道艳 ),MaDe-Yi( 马德毅 ).JournalofDalian MaritimeUniversity( 大连海事大学学报 ).008,34():33~36 5 LIU ReṉYan( 刘仁沿 ),LIANG Yu-Bo( 梁玉波 ),CHEN Bing-Jun( 陈冰君 ),XU Dao-Yan( 许道艳 ),LIANG Bin ( 梁斌 ).ChineseJournalofAnalysisLaboratory( 分析实验室 ),008,7(7):6~9 6 LIU ReṉYan( 刘仁沿 ),LIANG Yu-Bo( 梁玉波 ),CHEN Yu-An( 陈媛 ),XU Dao-Yan( 许道艳 ),CHEN Bing-Jun ( 陈冰君 ),LIU Yong-Jian( 刘永健 ).JournalofAnalyticalScience( 分析科学学报 ),00,6():3~34 7 DINGJun( 丁君 ).JournalofDalianFisheriesUniversity( 大连水产学院学报 ),00,6():~8 8 ZHU Xiao-Bing( 朱小兵 ),XIANGJuṉJian( 向军俭 ).JournalofJinanUniversity( 暨南大学学报 ),00,3(5): 0~5 DeterminationofDiarrheticShelfishPoisoninginShelfishesby LiquidChromatographywithTandem MasSpectrometry MU Qing-Lin *,FANGJie,WAN HaṉXing,WANG Xiao-Hua,CAO Liu-Yan,ZHANG Qing-Hong (ZhejiangProvincialZhoushan MarineEcologicalEnvironmentalMonitoringStation,Zhoushan3600) (ColegeofEnvironmentalScienceandEngineering,OceanUniversityofChina,Qingdao6600) Abstract Aliquidchromatography-electrosprayionizationtriple-quadrupletandem massspectrometricmethodhasbeenestablishedforthedeterminationoftwokindsofdiarrheticshelfishpoisoning includingokadaicacid (QA)anddinophysistoxiṉ(DTX-).Afterbeingextractedusing methanol andwater(80 0,V/V),thesolutionwasextractedwithṉhexanetoremovelipidcomponentsand

5 第期母清林等 : 液相色谱 - 串联质谱法检测贝类产品中腹泻性贝类毒素 thencleaneḏupbysolidphaseextraction(spe)onanoasishlbcartridge.theanalyteswereeluted withmethanoḻwater(80 0,V/V)onaPursuitC8column(50mm 3.0mm,3μm).Thequaṉ titativeandconfirmatorydeterminationofoaanddtx-wasperformedbymultiplereactionsmonitoring (MRM)mode.OA and DTX- weredeterminedinthenegativeion mode.thecalibration curvewaslinearintherangeof4-00g/l.thequantificationlimitsofoaanddtx-wereg/kg. Themeanrecoveriesatspikedconcentrationof-00g/kg were morethan80% andtherelative standarddeviationswerelessthan% (n=6). Keywords Liquidchromatographytandem massspectrometry;shelfishpoisoning;okadaicacid; Dinophysistoxiṉ;Shelfish (Received3June00;accepted30June)

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