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川循岑
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1 第 40 卷 2012 年月分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究 Chinese Journal of Analytical Chemistry 第期 ~ DOI: /SP.J 大田软海绵酸和鳍藻毒素 -1 纯化样品的分析冯振洲 1,2 于仁成 * 1 周名江 1 1 ( 中国科学院海洋研究所海洋生态与环境科学重点实验室, 青岛 ) 2 ( 中国科学院研究生院, 北京 ) 摘要采用高效液相色谱 - 荧光检测 (HPLC-FLD) 高效液相色谱 - 紫外检测 (HPLC-UV) 流动注射进样 - 质谱检测和高效液相色谱 - 质谱联用分析 (HPLC-MS) 等方法对从有毒利玛原甲藻 (Prorocentrum lima Dodge) 中分离纯化的 OA 和 DTX1 毒素样品进行定性鉴定和纯度分析, 为毒素标准品的制备提供材料和方法依据通过柱前衍生 HPLC-FLD 分析, 能够在样品中检测到 OA 和 DTX1 与 4- 溴甲基 7- 甲氧基香豆素 (BrMmc) 的衍生物, 表明样品中存在 OA 和 DTX1 毒素 HPLC-UV 方法在 200 nm 下的检测结果表明,OA 和 DTX1 是样品色谱图中主要的色谱峰,OA 样品和 DTX1 样品纯度可以达到 95% 和 98% 根据正负离子模式下流动注射 - 质谱分析结果, 毒素样品和标准品质谱图中信号最强离子的 m/z 相同, 应为 OA 和 DTX1 毒素的 [M+ Na] + 和 [M - H] - 离子, 其裂解方式也基本一致通过 HPLC-MS 方法, 对样品进行了 m/z 200~ 1000 的全扫描分析, 发现 OA 样品中可检测到少量杂质, 而 DTX1 样品中仅检测到 DTX1 毒素成分上述分析结果表明, 前期分离纯化的 OA 和 DTX1 毒素样品纯度较高, 可以在 DSP 毒素液相色谱和液 - 质联用分析中用作标准毒素关键词腹泻性贝毒 ; 大田软海绵酸 ; 鳍藻毒素 -1; 高效液相色谱 - 质谱联用 1 引言大田软海绵酸 (OA) 及其衍生物鳍藻毒素 (DTXs) 是一类亲脂性聚醚类化合物, 主要由鳍藻属和原甲藻属有毒甲藻产生 [1] 当有毒微藻被双壳贝类滤食后,OA 和 DTXs 毒素会在贝类消化腺内累积贝类中沾染的 OA 和 DTXs 毒素是导致腹泻性贝毒中毒 (DSP) 的主要毒素成分 [2, ] 食用染毒贝类后, 患者会出现腹泻呕吐等急性中毒症状研究发现,OA 和 DTX1 引起成人出现中毒症状的最小剂量约为 40 和 36 mg [4] 除上述急性中毒症状外,OA 和 DTXs 毒素还是蛋白磷酸酶 1(PP1) 和蛋白磷酸酶 2A(PP2A) 的抑制物 [5], 能够影响蛋白磷酸化过程, 促进细胞凋亡和肿瘤形成 [6,7] 其长期毒性效应对贝类养殖业的可持续发展和公众健康构成了严重威胁香港深圳舟山连云港青岛烟台天津等地的海产品中曾检出 DSP 毒素 [8] 对于 OA 和 DTX1 等 DSP 毒素成分, 高效液相色谱 - 荧光检测法 (HPLC-FLD) 和高效液相色谱 - 质谱联用分析法 (HPLC-MS) 是应用最广的方法 [9~ 11] HPLC-FLD 法是通过毒素成分与衍生剂的反应, 将毒素转化成具有荧光活性的衍生物进行检测 9- 蒽重氮甲烷 (ADAM) 和 4- 溴甲基 7- 甲氧基香豆素 (BrMmc) 等荧光衍生剂常用于 OA 和 DTX1 的分析 [12] 其中,BrMmc 衍生法是一种较成熟在国内应用较多的 DSP 毒素分析方法 [13~ 15] 在实际应用中, 这些方法都需要有毒素标准品支持但是, 目前毒素标准品价格昂贵, 在一定程度上制约着贝类产品质量控制工作的开展本研究组曾从培养的有毒利玛原甲藻 (Prorocentrum lima Dodge) 中分离纯化了一定量的 OA 和 DTX1 毒素 ( 实验过程另文发表 ) 在本研究中, 通过 HPLC-FLD 高效液相色谱 - 紫外检测法 (HPLC-UV) 流动注射进样 - 质谱检测法和 HPLC-MS 等方法, 对制备的 OA 和 DTX1 毒素样品的性质和纯度进行了分析 2 实验部分 2.1 仪器与试剂收稿 ; 接受本文系国家高技术研究发展计划项目 (863 计划,No. 2006AA09Z178) 国家自然科学基金项目 (No ) 和海洋所知识创新领域前沿项目资助 * rcyu@ qdio.ac.cn

2 分析化学第 40 卷 Waters e2695 液相色谱系统 ( 美国沃特世公司 );Esquire 离子阱质谱仪 ( 美国布鲁克公司 );Agilent 1100 高效液相色谱系统 ( 美国安捷伦公司 ) OA 和 DTX1 毒素样品 ( 加拿大国家研究院海洋生物科学研究所 ) 用甲醇溶解,-20 下保存备用 ; OA 和 DTX1 毒素标准品 ( 日本 WAKO 公司 ),-20 下保存备用甲醇乙腈丙酮 (Merck 公司 ); 甲酸 (98%,Fluka 公司 );4- 溴甲基 -7- 甲氧基香豆素 (BrMmc,>97% ),N,N- 二异丙基乙胺 (>99% ), 购自 Sigma-Aldrich 公司自制超纯水 2.2 实验方法高效液相色谱 - 荧光检测法取适量毒素样品和标准毒素, 置于 2 ml 玻璃样品瓶内, 高纯氮气吹干后, 加入 1 mg/l 的 BrMmc 丙酮溶液和 3 mg/l N,N- 二异丙基乙胺丙酮溶液各 50 ml, 于暗处 50 [15] 反应 2 h 后, 将溶液转移至 200 ml 内衬管中进行分析分析使用 Phenomenex Luna C 18 色谱柱 (250 mm 4.60 mm 5 mm), 流动相为乙腈 - 甲醇 - 水溶液 ( ,V/V), 流速为 1.2 ml/min, 采用 Waters 2475 荧光检测器检测, 激发波长 330 nm, 发射波长 390 nm 分析时间 20 min, 进样量 10 ml 高效液相色谱 - 紫外检测法将毒素样品和标准毒素溶解于 65% (V/V) 甲醇溶液进行分析, 使用 Phenomenex Luna C 18 色谱柱 (250 mm 4.60 mm,5 mm), 柱温为 30, 流动相为 65% (V/V) 乙腈溶液 ( 含 2 mmol/l 甲酸 ), 流速 0.6 ml/min, 用 Waters 2998 光电二极管阵列检测器检测毒素, 波长为 200 nm [16] 分析时间 25 min, 进样量 40 ml 同时分析空白溶液(65% 甲醇溶液 ), 以色谱图中毒素色谱峰面积占毒素与杂质 ( 指除毒素和空白样品色谱峰之外的其它色谱峰 ) 色谱峰总面积的比例计算毒素样品的纯度流动注射进样 - 质谱检测法采用 ESI 离子源, 分别在正负离子模式下分析毒素样品和标准品根据扫描结果, 选取信号最强的离子, 在正负离子模式下做二级质谱分析, 调整碰撞能使分子离子峰和碎片离子峰的信号都达到合适强度后, 对比毒素样品和毒素标准品的碎片模式高效液相色谱 - 质谱联用法采用 Phenomenex Luna C 18 色谱柱 (150 mm 2.0 mm 3 mm, 100 Å) 分析纯化样品, 柱温为 25, 流动相为 70% 乙腈溶液 ( 含 2 mmol/l 甲酸 ), 流速为 0.2 ml/min 正离子模式下检测, 扫描范围 m/z 200~1000, 进样量为 20 ml 3 结果与讨论 3.1 高效液相色谱 - 荧光检测法分析结果 HPLC-FLD 法对 OA 和 DTX1 样品及标准品的分析结果见图 1A, 样品色谱图中存在与 OA 和 DTX1 毒素标准品保留时间相同的色谱峰 HPLC-FLD 法分析毒素与荧光化合物 BrMmc 反应生成的衍生物, 是常用的 DSP 毒素分析方法该方法重现性较好,OA 和 DTX1 荧光衍生物保留时间稳定对 OA 和 DTX1 标准品 5 次重复进样的分析结果表明,OA 和 DTX1 衍生物的色谱峰保留时间分别为 (9.94 ±0.05) min 和 (18.18 ±0.05)min 对比毒素样品与标准品中毒素衍生物的保留时间, 可以初步证明制备的毒素样品中含有 OA 和 DTX1 成分对比 OA 和 DTX1 毒素标准品的色谱图, 样品色谱图中未观察到明显的杂质峰但是,HPLC-FLD 方法受背景干扰大, 在仅填加 BrMmC 和 N,N- 二异丙基乙胺的空白样品中也会出现明显的背景干扰, 影响定量分析结果的准确性 3.2 高效液相色谱 - 紫外检测法分析结果 HPLC-UV 法分析 OA 和 DTX1 的色谱图见图 1B 对比毒素样品和毒素标准品的色谱图可见, 样品中存在 OA 和 DTX1 HPLC-UV 法根据毒素的紫外吸收特征进行分析, 方法的灵敏度和特异性不高, 难以分析含有 DSP 毒素的贝类和藻类样品但是, 对于纯化的毒素样品,HPLC-UV 法可以反映样品的纯度状况根据本实验结果,OA 和 DTX1 是样品色谱图中主要的色谱峰, 根据峰面积计算,OA 样品的纯度可以达到 95% 以上,DTX1 样品的纯度可以达到 98% 以上 3.3 流动注射进样 - 质谱检测法分析结果质谱分析结果显示,OA 和 DTX1 的分子离子峰在正负离子模式下分别以 [OA+Na] + (m/z 827.8) [DTX1+Na] + (m/z 841.8) 和 [OA -H] - (m/z 803.8) [DTX1 -H] - (m/z 817.8) 形式存在, 见图 2A 和图 2B

3 第期冯振洲等 : 大田软海绵酸和鳍藻毒素 -1 纯化样品的分析图 1 HPLC-FLD(A) 和 HPLC-UV(B) 分析 OA 与 DTX1 毒素标准品和样品荧光衍生物的色谱图 Fig.1 Chromatograms of OA and DTX1 standards and samples derivitized with BrMmc by HPLC-FLD (A) and HPLC-UV (B) A: a, OA 与 DTX1 标准品的色谱图 (Mixed standards of OA and DTX1);b, OA 样品的色谱图 (OA sample);c, DTX1 样品的色谱图 (DTX1 sample) B:a, 甲醇空白 (Blank);b, OA 标准品 (OA standard);c, OA 样品 (OA sample);d, DTX1 标准品 (DTX1 standard);e, DTX1 样品 (DTX1 sample) 图 2 正离子模式 (A) 和负离子模式 (B) 流动注射进样分析 OA 与 DTX1 标准品和样品的质谱图 Fig.2 Mass spectrums of OA and DTX1 standards and samples using flow injectioṉ mass spectrometry method in positive mode (A) and negative mode (B) a:oa 标准品 (OA standard);b:oa 样品 (OA sample);c:dtx1 标准品 (DTX1 standard);d:dtx1 样品 (DTX1 sample) 毒素样品和毒素标准品分析结果的对比表明样品中存在 OA 和 DTX1 在两种模式下, 样品中 OA 和 DTX1 的分子离子峰在质谱图中信号强度均最高, 其它离子信号极低, 也说明了制备的 OA 和 DTX1 样品的纯度较高在正负离子模式下毒素样品和标准品中主要离子的二级质谱分析结果 ( 图 3 和图 4) 表明, 其裂解方式一致, 进一步证明了毒素样品中含有 OA 和 DTX1 3.4 高效液相色谱 - 质谱联用法分析结果毒素样品的 HPLC-MS 分析结果见图 5 在 OA 样品的色谱图中可以观察到 3 个色谱峰, 其主要成分相似, 均含有 [OA+Na] + 的分子离子峰及其碎片, 面积最大的色谱峰为 OA, 前面的两个小的杂质峰可能为 OA 的异构体在 DTX1 样品中仅检测到 1 个色谱峰, 主要成分为 [DTX1+Na] + 的分子离子峰及其碎片 LC-MS 分析结果表明制备的 DTX1 样品纯度很高, 而 OA 样品的纯度稍低本实验综合应用 HPLC-FPD, HPLC-UV, MS 和 HPLC-MS 等方法, 对制备的 OA 和 DTX1 毒素成分进行了确认, 并对其纯度进行了分析赤潮藻毒素标准品多从培养的有毒藻类中分离纯化制得, 容易受到其它物质干扰, 很难分析样品的纯度本研究采用的 HPLC-FLD,HPLC-UV,MS 及 HPLC-MS 等方法, 根据样品中毒素成分的紫外吸收特征及质谱特征峰, 并通过 HPLC-UV 法给出了定量的纯度分析结果, 为毒

4 分析化学第 40 卷图 3 正离子模式下流动注射进样分析 OA 与 DTX1 标准品和样品的裂解方式比较 Fig.3 Comparison of fragmentation pattern of OA and DTX1 standards and samples using flow injectioṉ mass spectrometry method in positive mode a:oa 标准品 (OA standard);b:dtx1 标准品 (DTX1 standard);c:oa 样品 (OA sample);d:dtx1 样品 (DTX1 sample) 图 4 负离子模式下流动注射进样分析 OA 与 DTX1 标准品和样品的裂解方式比较 Fig.4 Comparison of fragmentation pattern of OA and DTX1 standards and samples using flow injectioṉ mass spectrometry method in negative mode a:oa 标准品 (OA standard);b:dtx1 标准品 (DTX1 standard);c:oa 样品 (OA sample);d:dtx1 样品 (DTX1 sample) 素类样品的纯度分析提供了可供借鉴的方法本实验结果表明, 所制备的毒素样品与国外在售的毒素标

5 第期冯振洲等 : 大田软海绵酸和鳍藻毒素 -1 纯化样品的分析图 5 OA 与 DTX1 样品的 HPLC-MS 分析色谱图 Fig.5 HPLC-MS chromatograms of OA and DTX1 samples a:oa 样品 (OA sample);b:dtx1 样品 (DTX1 sample) 扫描范围 (Fulḻ scan) m/z 200~1000 准品地色谱图无明显差别, 毒素样品可以作为标准品, 用于 HPLC-FLD 和 LC-MS 方法进行毒素分析 References 1 ZingoneA,EnevoldsenH O.OceanCoastManage.,2000,43(8-9):725~748 2 SvenssonS,ForlinL.Aquat.Toxicol.,2004,66(4):405~418 3 LuckasB,DahlmannJ,ErlerK,GerdtsG,WasmundN,HummertC,HansenPD.Environ.Toxicol.,2005, 20(1):1~17 4 RamstadH,ShenJL,LarsenS,AuneT.Toxicon,2001,39(9):1387~ HolmesCFB,LuuH A,CarrierF.FEBSLeters,1990,270(1,2):216~218 6 CHEN Yang,YAN Tian,YU ReṉCheng,ZHOU Ming-Jiang.ActaScientiarum Naturalium Universitatis,2008, 47(5):86~92 陈洋, 颜天, 于仁成, 周名江. 中山大学学报,2008,47(5):86~92 7 GuoF,AnT,ReinKS.Toxicon,2009,55(2-3):325~332 8 Zhou MJ,LiJ,LuckasB,YuR C,YanT,HummertC,KastrupS.Mar.Polut.Bulet.,1999,39(1-12): 331~334 9 PazB,DaranasA H,CruzP G,FrancoJ M,PizarroG,Souto M L,Norte M,FernandezJJ.Toxicon,2007, 50(2):225~ PrassopoulouE,KatikouP,GeorgantelisD,KyritsakisA.Toxicon,2009,53(2):214~ ValeP,VelosoV,Amorim A.Toxicon,2009,54(2):145~ JamesKJ,Bishop A G,HealyB M,RodenC,SherlockIR,Twohig M,DraisciR,GiannetiL,LucentiniL. Toxicon,1999,37(2):343~ ShenJL,HummertC,LuckasB.FreseniusJ.Anal.Chem.,1997,357(1):101~ CHENZe-Ling,FU YuṉNa,GONG Ning.MarineScienceBuletin,2000,19(1):73~78 陈则玲, 付云娜, 巩宁. 海洋通报,2000,19(1):73~78 15 FU YuṉNa,CHENZe-Ling.MarineScienceBuletin,2003,22(1):92~95 傅云娜, 陈则玲. 海洋通报,2003,22(1):92~95 16 BouaïchaN,Hennion M,SandraP.Toxicon,1997,35(2):273~281 AnalysisofPurifiedSamplesofOkadaicAcid(OA) anddinophysistoxin1 FENGZheṉZhou 1,2,YU ReṉCheng *1,ZHOU Ming-Jiang 1 1 (KeyLaboratoryof MarineEcologyandEnvironmentalSciences,InstituteofOceanology, ChineseAcademyofSciences,Qingdao266071,China) 2 (GraduateSchool,ChineseAcademyofSciences,Beijing100039,China) Abstract Okadaicacid (OA)anddinophysistoxins(DTXs)arerepresentativetoxinscorresponding

6 分析化学第 40 卷 forthediarrheticshelfishpoisoning (DSP)incidents.Inthecurrentstudy,thesamplesofOAand DTX1,whichwerepurifiedpreviouslyfromtheculturedalgalcelsofdinoflagelateProrocentrumlimaDodge,wereanalyzedfortheidentityandpurity withhighperformanceliquidchromatography coupledwithfluorescencedetector (HPLC-FLD)andultravioletdetector (HPLC-UV),massspectrometry (MS)andHPLC-MS.CommercialyavailabletoxinstandardsofOAandDTX1 werealso analyzedtocompare withthepurifiedsamples.afterderivatized with4-bromomethyḻ7-methoxycoumarin (BrMmc),OAandDTX1weredetectedinthepurifiedsampleswiththeHPLC-FLD method.inthehplc-uvchromatogramsdetectedat200nm,oaanddtx1werefoundtobethemost predominantpeaks,andthepuritycalculatedbasedonthepeakareacouldreach95% and98%forthe samplesofoaanddtx1,respectively.inthemsspectrumsofthepurifiedsamplesandtoxinstanḏ ards,thehighestsignalsinthepositivemodeorthenegativemodehadthesamevalueofm/z,which couldbeidentifiedas[m+na] + and [M -H] - ofoaanddtx1.the[m+na] + and [M -H] - ions ofthetoxinsamplesshowedsimilarfragmentationpaternasthoseofthetoxinstandards,further confirmingthepresenceofoaanddtx1inthepurifiedsamples.inthelc-msanalysisofthepurifiedsampleswiththefuḻscanm/zrangeat ,asmallitleamountofimpuritiesintheoa samplewasfound,andnoimpuritypresentedinthedtx1sample.theresultsofthecurrentstudy suggestedthattheoaanddtx1samplespreparedpreviouslyhadhighpurityandcouldbeusedas standardsfortheanalysisofoaanddtx1withhplc-fldandhplc-msmethodsinmanagement andprotectionofseafood. Keywords Diarrheticshelfishpoisoning;Okadaicacid;Dinophysistoxin1;Highperformanceliquid chromatography-massspectrometry (Received13July2010;accepted15August2010)

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不同基源石斛属植物不同来源商品石斛徐蓓杨莉陈崇崇王峥涛徐珞珊建立黄草类石斛的薄层色谱定性鉴别方法采用薄层色谱法考察不同基源石斛及商品药材中专属性成分联苄类化合物毛兰素石斛酚杓唇石斛素和三羟基甲氧基联苄的薄层色谱行为对石斛药材进行定性鉴别通过种不同基源的石斛及批商品石斛的薄层色谱鉴别证明此方法专属性强操作简单重复性好为石斛的鉴别提供了一种准确有效的新方法本方法可用于黄草类石斛的鉴别为中药石斛的质量标准研究提供科学依据