518 ChinJGastroenterol,2016,Vol.21,No 9 肿瘤干细胞 (cancerstem cels,csc) 是肿瘤组织中一小群具有自我更新能力并能分化产生异质性肿瘤细胞的干细胞, 在维持肿瘤细胞恶性表型如增殖转移复发耐药性等方面发挥重要作用 [1], 可为特殊的细胞

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缮甄詹
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1 胃肠病学 2016 年第 21 卷第 9 期 517 论著肿瘤相关成纤维细胞对肝癌干细胞的影响 # 冯仁鑫陈 # 升 & 刘娇宁北芳谢渭芬第二军医大学附属长征医院消化内科 (200003) 背景 : 肿瘤相关成纤维细胞 (CAF) 是肿瘤微环境中一类特殊的间质细胞, 研究显示 CAF 在一些恶性肿瘤中可调节肿瘤干细胞 (CSC) 的干细胞特性和致瘤性然而在肝细胞癌 (HCC) 中,CAF 对 CSC 的调控作用尚不清楚目的 : 探讨 CAF 对肝癌干细胞的影响方法 : 分别采用免疫组化和免疫荧光技术标记 CD44 阳性 CSC 和 α SMA 阳性 CAF, 观察两者在人 HCC 标本中的位置关系从 HCC 手术标本中分离纯化 CAF 和癌旁成纤维细胞 (PTF), 收集相应条件培养基和干细胞条件培养基以 real timepcr 检测 CAF 或 PTF 条件培养基培养的人肝癌细胞株 HuH 7 中的肝癌干细胞相关基因表达采用流式细胞术分选肝癌干细胞表面标记物 EpCAM 阳性 HuH 7 细胞, 以 CAF 或 PTF 干细胞条件培养基培养细胞, 行干细胞成球实验结果 : 在 HCC 标本中,CAF 与 CSC 位置紧邻与 PTF 组和对照组 HuH 7 细胞相比,CAF 条件培养基处理组 HuH 7 细胞肝癌干细胞表面标记物基因和自我更新相关基因表达显著上调 (P 均 <0.05) CAF 干细胞条件培养基处理组未经分选的 HuH 7 细胞和 EpCAM 阳性 HuH 7 细胞, 成球率分别显著高于相应 PTF 组和对照组细胞 (19.15% 32.13% 对 10.89% 19.57% 和 12.57% 19.77%,P 均 < 0.001) 结论:CAF 在肝癌干细胞自我更新能力的维持和促进中起重要作用关键词癌, 肝细胞 ; 肿瘤相关成纤维细胞 ; 肿瘤干细胞 ; 自我更新 ; 球形体, 细胞 EfectofCancer asociatedfibroblastsoncancerstem CelsinHepatocelularCarcinoma FENGRenxin,CHEN Sheng,LIUJiao,NINGBeifang,XIEWeifen.DepartmentofGastroenterology,ChangzhengHospital,theSecondMilitary MedicalUniversity,Shanghai(200003) Correspondenceto:XIEWeifen, weifenxie@medmail.com.cn Background:Cancer asociatedfibroblasts(caf)areaclasofspecificmesenchymalcelsintumormicroenvironment. IthasbeendemonstratedthatCAFmightregulatethestemnesandtumorigenicityofcancerstem cels(csc)insome malignancies,however,theregulatoryefectofcafoncscinhepatocelularcarcinoma(hcc)isnotclearyet.aims: ToexploretheefectofCAFonCSCinHCC.Methods:CD44 positivecscandα SMA positivecafwerelabeledby immunohistochemistryandimmunofluorescence,respectively,forlocalizationofcscandcafinhumanhcctisue.caf andperitumoralfibroblasts(ptf)wereisolatedandpurifiedfromhccsurgicalspecimens,andtherespectiveconditioned medium(cm)andstemnescm werecolected.humanhcccellinehuh 7wasculturedwithCAF orptf CM,and theexpresionofhepaticcsc relatedgenesinhuh 7celswasevaluatedbyreal timepcr.huh 7celspositivefor EpCAM,acelsurfacehepaticCSCmarker,wereobtainedbyfluorescence activatedcelsorting,andculturedwithcaf orptf stemnescmforspheroidformation.results:cafwasadjacenttocscinhcctisue.whencomparedwithptf CM andcontroledcm,caf CMup regulatedtheexpresionofhepaticcscsurfacemarkergenesandself renewal related genesinhuh 7cels(Pal<0.05).ThespheroidformationratesofunsortedHuH 7celsandEpCAM positivehuh 7 celsin CAF stemnescm weresignificantlyhigherthan thosein PTF stemnescm and controled stemnescm (19.15%,32.13% vs.10.89%,19.57% and12.57%,19.77%,pal<0.001).conclusions:cafplayimportant rolesinthemaintenanceandenhancementofself renewalcapabilityofhepaticcsc. Keywords Carcinoma,Hepatocelular; Cancer AsociatedFibroblasts; NeoplasticStemCels; Self Renewal; Spheroids,Celular DOI: /j.isn 基金项目 : 国家自然科学基金 ( ) # 本文共同第一作者, 冯仁鑫, fengrenxin1989@163.com; 陈升, chenshengemc@163.com & 本文通信作者, weifenxie@medmail.com.cn

2 518 ChinJGastroenterol,2016,Vol.21,No 9 肿瘤干细胞 (cancerstem cels,csc) 是肿瘤组织中一小群具有自我更新能力并能分化产生异质性肿瘤细胞的干细胞, 在维持肿瘤细胞恶性表型如增殖转移复发耐药性等方面发挥重要作用 [1], 可为特殊的细胞表面标记物所标记目前 CD133 CD24 CD44 CD90 上皮细胞黏附分子 (epithelial celadhesionmolecule,epcam) DLK1(delta like1 homologue) 等表面标记物均被用于肝癌干细胞的分离和鉴定 [2 3] 肿瘤微环境中还有一类特殊的间质细胞, 即肿瘤相关成纤维细胞 (cancer asociated fibroblasts,caf), 对维持肿瘤的标志性特征, 如增殖信号的持续活化诱导血管生成抵抗细胞死亡改变细胞能量代谢等具有重要意义 [4] 既往研究发现 CAF 可调节胃癌 [5] 结直肠癌 [6] [7] 前列腺癌等恶性肿瘤中 CSC 的干细胞特性和致瘤性肝细胞癌 (hepatocelularcarcinoma,hcc) 多发生于肝纤维化和肝硬化患者, 癌组织和癌旁组织中含有大量 [8] 成纤维细胞本课题组前期研究发现,CAF 可通过分泌趋化因子 CCL2 CCL5 CCL7 CXCL16 激活 HCC 细胞中的 Hedgehog(Hh) 和转化生长因子 β (TGF β) 信号通路, 从而促进肿瘤转移, 但 CAF 对肝癌干细胞的影响尚有待明确, 本研究对此进行了探讨材料与方法一标本来源用于分离 CAF 和癌旁成纤维细胞 (peritumoral fibroblasts,ptf) 的人 HCC 组织及其配对癌旁组织 ( 取自距癌灶边缘 5cm 处 ) 来源于上海东方肝胆外科医院原发性 HCC 手术患者, 患者术前签署手术标本使用同意书二细胞株主要试剂和仪器人肝癌细胞株 HuH 7( 中科院上海细胞生物学研究所 ) 培养于含 10% 胎牛血清 (FBS) 的 DMEM 培养基中,37 5% CO 2 培养箱中培养 DMEM 培养基 DMEM/F12 培养基非必需氨基酸 (HyClone, GEHealthcare),FBS ITS 细胞培养添加剂谷氨酰胺 B 27 添加剂 (Gibco,ThermoFisherScientific Inc.), 青链霉素混合液 (Sigma AldrichCo.), 抗人成纤维细胞磁珠荧光标记 EpCAM 抗体 (Miltenyi Biotec), 表皮生长因子 (EGF) 成纤维细胞生长因子 (FGF)(R&D Systems), 兔抗人 CD44 抗体 (BD Biosciences), 小鼠抗人 α 平滑肌肌动蛋白 (α SMA) 抗体 ( 武汉博士德生物工程有限公司 ),AlexaFluor 488 驴抗小鼠 IgG TRIzol 试剂 SuperScript Ⅲ cdna 合成试剂盒 (Invitrogen,ThermoFisherScien tificinc.),sybr PremixExTaq TM real timepcr 试剂盒 (TAKARABIOINC.) 免疫磁珠细胞分选仪 (MiltenyiBiotec), 荧光显微镜 (CarlZeisAG),real timepcr 系统 (AppliedBiosystems,ThermoFisher ScientificInc.), 流式细胞仪 (BDBiosciences) 三方法 1.CAF PTF 的分离纯化 : 采用免疫磁珠细胞分选法 (MACS) 分离 CAF 和 PTF [8] 以 PBS 将标本洗净后剪成 1mm 3 的小块, 加入含 0.5% 胶原酶 Ⅳ 1% FBS 1% 青链霉素的 DMEM/F12 培养基, 37 5% CO 2 培养箱孵育 30min 待组织完全消化后收集细胞悬液, 离心弃上清, 将细胞沉淀重悬于原代成纤维细胞专用培养基 ( 含 10% FBS 1% ITS 细胞培养添加剂 1% 青链霉素 1% 谷氨酰胺的 DMEM/F12 培养基 ) 将培养 2~3 代的原代成纤维细胞消化计数后重悬于 MACS 缓冲液中, 加入抗人成纤维细胞磁珠后上柱, 在免疫磁珠细胞分选仪中进行纯化纯化后的 CAF PTF 培养于含 10% FBS 的 DMEM 培养基中, 取 4~10 代纯化的 CAF PTF 进行实验 2.CAF PTF 条件培养基收集 1 3% FBS 成纤维细胞条件培养基 : 将 CAF PTF 分别接种于 35mm 培养皿中, 待贴壁后更换为含 3% FBS 的 DMEM 培养基, 培养 24h 后收集培养上清 2 成纤维细胞干细胞条件培养基 : 将 CAF PTF 分别接种于 35mm 培养皿中, 待贴壁后更换为干细胞培养基 ( 含 1% ITS 细胞培养添加剂 1% 非必需氨基酸 1% B 27 添加剂 40 ng/ml EGF 20ng/mLFGF 的 DMEM 培养基 ), 培养 24h 后收集培养上清收集得到的上述条件培养基以 0.22μm 滤膜过滤后直接用于 HuH 7 细胞培养, 或液氮速冻后 -80 保存备用 3. 免疫组化和免疫荧光标记 :HCC 组织石蜡包

3 胃肠病学 2016 年第 21 卷第 9 期 519 埋,5μm 厚连续切片, 切片常规脱蜡至水, 柠檬酸盐缓冲液煮沸抗原修复,10% 山羊血清封闭, 依次加入兔抗人 CD44 抗体 (1 200) 和酶标山羊抗兔二抗孵育,DAB 显色, 阳性染色为棕黄色苏木精复染细胞核后 5% 马血清封闭 2h, 依次加入小鼠抗人 α SMA 抗体 (1 200) 和 AlexaFluor 488 驴抗小鼠 IgG (1 500) 孵育, 封片, 于正置荧光显微镜下观察并拍照 4.Real TimePCR 检测肝癌干细胞相关基因表达 : 将 HuH 7 细胞接种于 35mm 培养皿中, 待贴壁后更换为无血清 DMEM 培养基, 培养 12h 后更换为 3% FBSCAF 或 PTF 条件培养基, 对照组更换为 3% FBSDMEM 培养基, 培养 24h 后收集细胞 TRIzol 试剂提取细胞总 RNA, 取 1μg 总 RNA 为模板合成 cdna, 以合成的 cdna 为模板行 real timepcr 扩增, 操作步骤均参照试剂盒说明书 PCR 引物序列见表 1,PCR 反应条件 :94 30s; 94 10s,60 34s, 共 40 个循环以 2 -ΔΔCt 法计算目的基因 mrna 相对表达量表 1 Real TimePCR 引物序列 5. 流式细胞分选 : 将 HuH 7 细胞重悬于 80μL 含 0.5% BSA 2mmol/LEDTA 的流式缓冲液, 加入 10μL 荧光标记 EpCAM 抗体或同型对照 IgG, 充分混匀, 冰上避光孵育 10min, 加入 1~2mL 流式缓冲液重悬细胞,300 g 离心 5min, 弃上清将细胞沉淀重悬于 150μL 流式缓冲液, 上流式细胞仪, 收集分选的 EpCAM 阳性细胞, 进行后续实验 6. 干细胞成球实验 : 将未经分选的 HuH 7 细胞或流式细胞术分选的 EpCAM 阳性 HuH 7 细胞以约 10 个 / 孔的密度加入低吸附 96 孔板, 精确计数每孔加入的细胞数并记录实验设 3 个组别 : 干细胞培养基处理组 ( 对照组 ) PTF 干细胞条件培养基处理组 (PTF 组 ) 和 CAF 干细胞条件培养基处理组 (CAF 组 ), 培养 7d 后计数成球细胞 ( 细胞间边缘发生融合 ) 数, 计算成球率四统计学分析应用 SPSS16.0 统计软件, 实验结果以 x±s 珋表示, 多组间均数的比较采用单因素方差分析, 进一步的两两比较采用 LSD t 检验,P<0.05 为差异有统计学意义目的基因 CD44 序列 F5 ACCCTCCCCTCATTCACCAT 3 结果 CD90 CD133 EpCAM Sox2 Oct4 Nanog Klf4 Esg1 Bmi1 R5 GTTGTACTACTAGGAGTTGCCTGGATT 3 F5 AGAGACTTGGATGAGGAG 3 R5 CTGAGAATGCTGGAGATG 3 F5 CATCTGCTCTCTGCTGAC 3 R5 AACTTAATCCAACTCCAACC 3 F5 GAATAATAATCGTCAATGCCAGTG 3 R5 CGCTCTCATCGCAGTCAG 3 F5 GGACTGAGAGAAAGAAGAGGAG 3 R5 GAAAATCAGGCGAAGAATAAT 3 F5 CGCCGTATGAGTTCTGTG 3 R5 GGTGATCCTCTTCTGCTTC 3 F5 GCTAAGGACAACATTGATAGAAG 3 R5 CTTCATCACCAATTCGTACTTG 3 F5 CCCAATTACCCATCCTTCC 3 R5 GTGCCTGGTCAGTTCATC 3 F5 CGGATCTCGAATCCCTTAC 3 R5 ATCCAAGGGCCTAGTTCGAG 3 F5 TTTTATGCTGAACGACTTTTAACTT 3 R5 GCTCAGTGATCTTGATTCTGGT 3 一 CAF 与 CSC 在 HCC 标本中位置紧邻 CD44 为细胞跨膜糖蛋白之一, 参与细胞与细胞外基质间的相互作用, 多项研究以 CD44 为 CSC 标记物, 从多种肝癌细胞株或 HCC 组织中分选 CSC CD44 阳性细胞较 CD44 阴性细胞具有更强的 CSC 特征, 在体外有更强的成球能力和抵御化疗药物诱导的细胞凋亡的能力, 在小鼠体内有更强的致瘤性 [9 11] α SMA 是应用最广泛的成纤维细胞表面标记物 [12] 本研究采用免疫组化技术标记 CD44 阳性 CSC, 采用免疫荧光技术标记 α SMA 阳性 CAF, 结果显示 CAF 与 CSC 在 HCC 标本中位置紧邻 ( 图 1) 作为 HCC 中含量最丰富的间质细胞之一,CAF 与 CSC 密切的位置关系提示其可能通过直接接触或旁分泌作用影响 CSC 的生物学特性二 CAF 促进肝癌干细胞相关基因表达 HuH 7 细胞经 3% FBSCAF 条件培养基培养 24h 后,real timepcr 检测显示, 肝癌干细胞表面标记物基因 CD44 CD90 CD133 EpCAM 表达显著高

520 ChinJGastroenterol,2016,Vol.21,No 9 于 3% FBSPTF 条件培养基处理组和对照组 (P 均 <0.05),PTF 组与对照组间差异无统计学意义 (P>0.05); 此外, 自我更新相关基因 Oct4 Nanog Klf4 Bmi1 在 CAF 组 HuH 7 细胞中的表达亦显著上调 (P 均 <0.

4 520 ChinJGastroenterol,2016,Vol.21,No 9 于 3% FBSPTF 条件培养基处理组和对照组 (P 均 <0.05),PTF 组与对照组间差异无统计学意义 (P>0.05); 此外, 自我更新相关基因 Oct4 Nanog Klf4 Bmi1 在 CAF 组 HuH 7 细胞中的表达亦显著上调 (P 均 <0.05)( 图 2) 三 CAF 促进肝癌干细胞自我更新 EpCAM 是一种钙离子依赖的细胞表面连接蛋白, 表达于多种人类上皮细胞, 其表达升高常伴随肿瘤早期的变化 [13] [14] 研究发现流式细胞术分选出的 EpCAM 阳性 HCC 细胞显示出自我更新和分化的 CSC 样特征, 且在 NOD SCID 小鼠体内较未经分选的 HCC 细胞有更强的致瘤性和远处转移能力为验证 CAF 对肝癌干细胞自我更新能力的影响, 本研究以 EpCAM 为分选标记物, 采用流式细胞术从人肝癌细胞株 HuH 7 中分选出 CSC, 检测未经分选的 HuH 7 细胞与 EpCAM 阳性 HuH 7 细胞 ( 肝癌干细胞 ) 的成球能力检测结果显示, 未经分选的 HuH 7 细胞经 CAF 干细胞条件培养基处理后, 成球率为 19.15%, 显著高于 PTF 干细胞条件培养基处理组 (10.89%) 和对照组 (12.57%)(P 均 <0.001),PTF 组与对照组间差异无统计学意义 (P>0.05); 在 EpCAM 阳性 HuH 7 细胞中,CAF 组成球率亦显著高于 PTF 组和对照组 (32.13% 对 19.57% 和 19.77%, P 均 <0.001), 且三组成球率均明显高于给予相同处理的未经分选的 HuH 7 细胞上述结果表明 CAF 可显著提高肝癌干细胞和 HCC 细胞的成球能力, 促进两者自我更新, 而 PTF 对两种细胞的自我更新能力无明显影响 ( 图 3) 讨论 CSC 是肿瘤组织中一小群具有下述特性的干细胞 :1 特异的表面标记物 ;2 自我更新和无限增殖 ; 3 分化潜能 ;4 高致瘤性 ;5 辐射抵抗性 ;6 耐药性 [1,15] 目前观点认为 CSC 是肿瘤发生发展的根本原因, 也是导致肿瘤转移复发以及耐药的关键因标尺 =200μm 免疫组化标记 CD44 阳性 ( 棕黄色颗粒 )CSC, 免疫荧光标记 α SMA 阳性 ( 绿色荧光 )CAF 图 1 CAF 与 CSC 在 HCC 标本中位置紧邻

5 胃肠病学 2016 年第 21 卷第 9 期 521 两组间比较, P<0.05, P<0.01 图 2 CAF 促进肝癌干细胞表面标记物基因 (A) 和自我更新相关基因 (B) 表达两组间比较, P<0.001 图 3 CAF 促进肝癌干细胞干细胞球形成素之一 [16 17] 在众多间质细胞中,CAF 作为在肿瘤组织中活化的成纤维细胞, 与 PTF 相比具有更强的促进肿瘤恶性行为的能力 [8] 关于 CAF 与 CSC 间相互作用的研究显示, 化疗药物可促进 CAF 分泌白细胞介素 17A(IL 17A), 进而促进结直肠癌干细胞自我更新和肿瘤生长 [6] ;CAF 还可通过激活 TGF β 信号通路促进胃癌干细胞的自我更新能力和致瘤性 [5] ; 在非小细胞肺癌中,CAF 甚至可通过激活胰岛素样生长因子 Ⅱ(IGF Ⅱ)/IGF1 受体 (IGF1R) 信号通路, 诱导自我更新相关基因 Nonag 表达, 使肿瘤细胞去分化成为 CSC 样细胞 [18] 然而在 HCC 中,CAF 对 CSC 的调控作用尚不清楚本研究从人 HCC 组织及其配对癌旁组织中分离纯化 CAF 和 PTF, 探讨 CAF 对 CSC 生物学特性的影响免疫组化和免疫荧光标记技术显示 CAF 与 CSC 在 HCC 标本中位置紧邻, 提示两者间可能存在直接接触或旁分泌关系以 CAF 或 PTF 条件培养基培养人肝癌细胞株 HuH 7,real timepcr 检测显示 CAF 条件培养基可促进肝癌干细胞表面标记物基因表达, 其中 CD44 表达量约为 PTF 组和对照组的 4 倍, 其他表面标记物表达量亦分别上调 2~3 倍同时,CAF 条件培养基还可促进肝癌干细胞自我更新相关基因表达, 以 Klf4 表达上调最为显著, 约为对照组的 3.5 倍 CSC 在特定生长环境下具有很强的自我更新和增殖能力干细胞成球实验是分离和研究 CSC 的一种较为成熟的方法, 即将单个细胞培养于低吸附培养皿中, 以含有特殊细胞因子的无血清干细胞培养基进行培养, 观察细胞的自我更新能力, 目前已利用该技术在结直肠癌 [19] 肺癌 [20] [21] 胰腺癌等肿瘤细胞株中成功分离富集相应 CSC 本研究以 CAF 或 PTF 干细胞条件培养基培养未经分选的 HuH 7 细胞和经流式细胞术分选的 EpCAM 阳性 HuH 7 细胞 ( 肝癌干细胞 ), 发现 CAF 可提高肝癌干细胞和 HCC 细胞的成球能力 ( 成球率分别增高 12.36% 和 6.58%), 而 PTF 则无此作用, 证实 CAF 可促进肝癌干细胞自我更新既往研究显示 Hh 和 TGF β 信号通路在 CSC 干细胞特性的维持中起重要作用 [22 23], 本课题组前期研究亦发现 CAF 分泌的趋化因子 CCL2 CCL5 CCL7 CXCL16 可激活 HCC 细胞中的 Hh 和 TGF β 信号通路 [8], 结合本研究结果, 提示 CAF 可能通过旁分泌作用促进肝癌干细胞自我更新综上所述,CAF 在肝癌干细胞自我更新能力的维持和促进中起重要作用, 这一发现为以 CAF 与 CSC 之间的相互作用为靶点的 HCC 生物靶向治疗提供了有力的实验依据参考文献 1 MageeJA,PiskounovaE,MorisonSJ.Cancerstemcels: impact,heterogeneity,anduncertainty[j].cancercel,

6 522 ChinJGastroenterol,2016,Vol.21,No ,21(3): MaS, Chan KW, Hu L, etal. Identification and characterizationoftumorigeniclivercancerstem/progenitor cels[j].gastroenterology,2007,132(7): FengD, Wang N, Hu J, etal. Surface markersof hepatocelularcancerstemcelsandtheirclinicalpotential [J].Neoplasma,2014,61(5): KaluriR,ZeisbergM.Fibroblastsincancer[J].NatRev Cancer,2006,6(5): Hasegawa T, Yashiro M, NishiT, etal. Cancer asociated fibroblasts might sustain the stemnes of scirhousgastriccancercelsviatransforminggrowthfactor β signaling[j]. IntJ Cancer, 2014, 134 (8): LotiF,JararAM,PaiRK,etal.Chemotherapyactivates cancer asociatedfibroblaststomaintaincolorectalcancer initiatingcelsbyil 17A[J].JExpMed,2013,210 (13): LiaoCP,AdisetiyoH,LiangM,etal.Cancer asociated fibroblastsenhancethegland formingcapabilityofprostate cancerstemcels[j].cancerres,2010,70(18): Liu J, Chen S, Wang W, etal. Cancer asociated fibroblasts promote hepatocelular carcinoma metastasis throughchemokine activatedhedgehogandtgf βpathways [J].CancerLet,2016,379(1): KonJ,OoeH,OshimaH,etal.ExpresionofCD44in rathepaticprogenitorcels[j].jhepatol,2006,45(1): Wan S, ZhaoE, Kryczek I, etal. Tumor asociated macrophagesproduceinterleukin6andsignalviastat3to promoteexpansionofhumanhepatocelularcarcinomastem cels[j].gastroenterology,2014,147(6): XieZ,ChoongPF,PoonLF,etal.InhibitionofCD44 expresion in hepatocelular carcinoma cels enhances apoptosis,chemosensitivity,andreducestumorigenesisand invasion[j]. CancerChemotherPharmacol,2008,62 (6): MazoccaA,DituriF,LupoL,etal.Tumor secreted lysophostatidicacid accelerateshepatocelularcarcinoma progresion by promoting diferentiation ofperitumoral fibroblastsinmyofibroblasts[j].hepatology,2011,54 (3): MunzM,BaeuerlePA,GiresO.Theemergingroleof EpCAM incancerandstemcelsignaling[j].cancerres, 2009,69(14): YamashitaT, JiJ, Budhu A, etal. EpCAM positive hepatocelularcarcinomacelsaretumor initiatingcelswith stem/progenitorcelfeatures[j].gastroenterology,2009, 136(3): Meacham CE, Morison SJ. Tumourheterogeneity and cancercelplasticity[j].nature,2013,501(7467): ChenJ,JinR,ZhaoJ,etal.Potentialmolecular,celular andmicroenvironmentalmechanism ofsorafenibresistance inhepatocelularcarcinoma[j].cancerlet,2015,367 (1): ChibaT,IwamaA,YokosukaO.Cancerstem celsin hepatocelularcarcinoma:therapeuticimplicationsbased onstemcelbiology[j].hepatolres,2016,46(1): ChenWJ,HoCC,ChangYL,etal.Cancer asociated fibroblastsregulatetheplasticityoflungcancerstemnes viaparacrinesignaling[j].natcommun,2014,5: Colura A, Marisa L, Trojan D, et al. Extensive characterizationofspheremodelsestablishedfromcolorectal cancercellines[j].celmollifesci,2013,70(4): FesartD, BegueretH, Delom F. Three dimensional culturemodeltodistinguishnormalfrom malignanthuman bronchialepithelialcels[j].eurrespirj,2013,42 (5): WatanabeY,YoshimuraK,YoshikawaK,etal.Astem celmedium containingneuralstimulatingfactorinducesa pancreaticcancerstem likecel enrichedpopulation[j]. IntJOncol,2014,45(5): CochraneCR,SzczepnyA,WatkinsDN,etal.Hedgehog SignalingintheMaintenanceofCancerStem Cels[J]. Cancers(Basel),2015,7(3): NakaK.TGF βsignalingincancerstem cels[articlein Japanese][J].NihonRinsho,2015,73(5): ( 收稿 ; 修回 )

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL ( )2017 57 5JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)2017,Vol.57No.5 11 LY294002, (, 330006) : LY294002 PI3K/AKT 0 10 15 20 25 30μmol L -1 LY294002(LY294002 ) A549,PBS CCK8 LY294002 A549 ; Westernblot