响治疗效果的因素较多 其中肿瘤的复发 耐药 侵袭和转移最为重要 肿瘤干细胞 是指在肿瘤组织中存在一小部分具有干细胞性质的细胞群 该类细胞具有自我更新和多向分化潜能 能维持肿! 瘤的形成及生长 肿瘤干细胞数目相对恒定 具 "# 有典型的生物学特性 无限的自我更新能力 多分化潜能 高致瘤性 高侵袭转移能

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1 胃癌干细胞中差异表达 对其生物学特性的影响 潘韵芝 舒雄 孙力超 遇珑 孙立新 杨治华 冉宇靓 国家癌症中心 中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院 北京 摘要 目的 探讨胃癌干细胞中差异表达 及其对胃癌干细胞生物学特性 自我更新 侵袭 耐药能力 的调控作用 方法 采用无血清悬浮培养法和干细胞标志物流式分选术分离人胃癌干细胞 分别采用胃癌细胞球形成实验 体外侵袭 耐药实验鉴定胃癌干细胞的生物学特性 表达谱芯片检测人胃癌干细胞中差异表达 采用定量逆转录 )+) 技术检测相关差异表达 的表达情况 验证 芯片结果 相关 抑制剂干扰后 分别进行胃癌细胞球形成实验 体外侵袭与耐药实验检测 对人胃癌干细胞自我更新 侵袭 耐药能力的影响 结果 成功分离得到人胃癌干细胞 )--./0 亚群 其具有典型的肿瘤干细胞生物学特性 较强的自我更新能力 侵袭和耐药能力 与 )--.0 细胞亚群相比 人胃癌干细胞 )--.10 细胞亚群高表达 共有 个 低表达 共有 个 采用 ) 技术验证 表达谱芯片相关结果 得到 ) 亚群中 表达上调 - 表达下调 抑制相关高表达 表达后 肿瘤干细胞的自我更新能力 侵袭和耐药能力均下降 结 胃癌干细胞中具有多种差异表达 对胃癌干细胞生物学特性具有调控作用 关键词 胃癌干细胞 )-- 自我更新 侵袭 耐药中图分类号 ' 文献标识码 文章编号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胃癌是常见的消化道恶性肿瘤之一 其死亡率 收稿日期 修回日期 通讯作者 冉宇靓!"#$!%&' 在各种恶性肿瘤中位居第 位 手术 放疗和化疗是胃癌治疗的常用手段 虽然近年来上述治疗策略 取得了很大进展 但患者的 年生存率仍很低 影!"#!$

2 响治疗效果的因素较多 其中肿瘤的复发 耐药 侵袭和转移最为重要 肿瘤干细胞 是指在肿瘤组织中存在一小部分具有干细胞性质的细胞群 该类细胞具有自我更新和多向分化潜能 能维持肿! 瘤的形成及生长 肿瘤干细胞数目相对恒定 具 "# 有典型的生物学特性 无限的自我更新能力 多分化潜能 高致瘤性 高侵袭转移能力 强耐药性 近年来不同肿瘤组织中肿瘤干细胞相继被分离出来如乳腺癌 恶性胶质瘤 前列腺癌 结 $# 肠癌 肝癌 胰腺癌等 国内外研究者通过侧群细胞法 表面标志物分选 无血清悬浮培养等多种途径成功分离了胃癌干细胞 %& ' 此外 多种胃癌干细胞表面标志物被发现如!!!) 等 这些表面标志物对于胃癌干细胞的分离鉴定至!# 关重要 胃癌干细胞表型功能和分子机制的不断深入研究 为胃癌的靶向治疗提供了新策略 &+ -&+. 是一类由内源基因编码的长度约为 #" 个核苷酸的非编码单链 + 分子 能与特定的 + 反义互补从而调控基因表达 大量研究表明 &+ 在多种肿瘤干细胞中表达异常 对肿瘤干细胞的自我更新 生长增殖 侵袭迁移 $ 耐药 凋亡等特性具有重要的调控作用 本研究重点探讨胃癌干细胞中差异表达的 &+ 并进一步研究这些 &+ 对胃癌干细胞生物学特性的调控作用 材料与方法 细胞系和肿瘤干细胞的培养 /" 和 0'$ 细胞系购于中国科学院细胞库 细胞系使用含 1 0 &&& / 谷氨酰胺 青霉素 链霉素的 +23!1 培养 无血清培养基 含 & %&1%4 碱性成纤维细胞生长因子 6''&61%4 ' '&6 和 1%4 3 '&6 胃癌细胞系 /" 和 0'$ 经无血清悬浮培养 7 可形成紧实的细胞球体 胃癌干细胞是使用无血清悬浮培养胃癌细胞系 /" 和 0'$ 通过流式细胞分选 技术分离所得 流式细胞分选技术分离胃癌干细胞采用无血清悬浮培养 /" 和 0'$ 细胞系 培养第 7 时采用 3 5 &)5!! 0 0&& 以!11 比例稀释抗体孵育细胞 然后 20 洗涤 次 采用流式细胞仪 0 0& & 分选!!8 和!! 细胞 &+ 芯片和生物信息学分析 &+ 芯片使用 9&: '& &+ ; 购于北京博奥生物生物科技有限公司 使用 +3 试剂 -3&% 提取流式分选后所得的!!8 和!!/" 细胞 + 提取后的 + 经标记后与芯片杂交 采用 9&: : & 软件对数据标准化处理和分析 若表达量变化超过 倍 则视为该 &+ 在胃癌干细胞中差异表达 使用 % -;%;% &+ -;&;% 和 2& -&;7 6&;7 对 &+ 靶基因进行预测 使用 3;$ 447&7;&;%4 将基因绘制 '' 通路 <+2+ 采用 & &+ && =& >6& 提取流式分选后所得的!! 8 和!! /"4 0'$ 细胞 + 具体操作为 收集细胞 个 20 洗 遍 加! 9&40&7&% 05 剧烈振荡以破解细胞释放 &+ 加入 4 体积的 &+ )% 77&& 涡旋后在冰上放置 & 加入和 9&40&7&% 05 等体积苯酚和氯仿 涡旋混匀 # 后 最大 % 离心 取上清于 个新 2 管中 加入 4 体积的 酒精到水相里涡旋充分混匀 把液体加到柱子里 "% 离心 - 收集滤液后添加 4 体积的 室温酒精充分混匀 混合物第 次加入 个新的柱子离心 " 后弃去滤液 用 的 &+? 5& 瞬时离心 "# 用 " &+? 5& 4 洗涤 次瞬时 " # 离心 & 加入 无 + 酶水 盖紧后最大速度离心 # 利用 05% &+ <+ 2+ 2& 和 <+2+ =& 锐博生物 广州 配置 &+ 的 <+2+ 反应体系 A0+!!"#!$

3 !"#$% &#'!!!)" +!-./&#'!! 01 +!-./)1 补齐反应体系 反应条件为 预变性 + 变性 + 1 退火 1 延伸 1 2$3$ 反应和信号检测在 &7+ )% 6 131% 8" &!131%1- 完成 以 9 基因作为对照 蛋白质印迹采用 :#;$#)!% )$%!)%! %! $- 提取 622 和 :9+&6 / 细胞总蛋白 具体步骤为 将待提取的细胞用冰冷 &: 洗 次 根据获取的细胞数量加入适量的细胞裂解液 7 冰上裂解 2 离心 取上清于 5 保存备用 利用 &6!% 11)3 %! $- 测定蛋白质浓度 具体操作为 将 &:&!0 :# ;# 标准品梯度稀释.+' 取 + &: 标准品 加入 稀释的 + 混合的 & 液 振荡混匀 孵育 用紫外分光光度计测 + 的吸收值 绘制蛋白定量的标准曲线 取待测蛋白样品 重复上述步骤 根据标准曲线算出相应蛋白浓度 在蛋白样品提取 浓度测定后 分别制胶 上样 电泳 转膜 抗体孵育 曝光等步骤进行蛋白质印迹实验 其中所用到的一抗及稀释比例有 622 8; $)+-:!6 :')' $!!'3 $%2 6 :')' $!!'3)!'6 :')' $!!'3 6 :') ' $!!'3 抑制 ;%! 购于 7&&7 6!. 使用不含抗生物素的无血清培养基稀释分选得到 622 和 6225 细胞 以 + 个 孔接种于六孔板中 过夜培养 按照说明书要求 ;%! 的终浓度为! 采用!$%) 70%!' 将 ;%! 和阴性对照转染至相应细胞中 转染后 2 加入无血清培养基 后 收获细胞进行相应实验 体外自我更新能力的分析取分选得到细胞或者 抑制剂处理后的 细胞 以 + 个 孔的密度接种于低黏附 2 孔板 用含./ 甲基纤维素的无血清悬浮培养基培养 在 +6 孵箱中培养 " 后观察成球情况 体外侵袭实验取无血清培养基稀释后的 )%' 胶 ' + 平铺于 )1 小室的上室 放置 培养箱 然后将分选得到细胞或者 抑制剂处理后的细胞以 + 密度 孔均匀加在 )%' 胶表面 )1 小室的下室加入含 血清的 72 完全培养基 2/ 后 割片 7 封片 镜下观察结果 体外耐药实验取分选得到细胞或者 抑制剂处理后的细胞 以 2 个 孔的密度接种于 孔板 每组细胞均用含.+.+! 顺铂的培养基培养 " 加入 66/ 试剂 检测波长 2+ 处的吸光度 值 计算各组的半数抑制浓度 76 + 统计学处理采用 : ::. 软件进行统计分析 计数资料的比较采用 检验 计量资料的比较采用 % 检验 检验水准 <.+ 结果 人胃癌干细胞的分离采用无血清悬浮培养和表面标志物流式细胞分选术 检测并分选 :9+&6/ 1 细胞中 细胞亚群 图 '# 可知分选 :9+ 1 细胞中 阳性比例为. &6/ 1 细胞系中 阳性比例为 +.2 人胃癌干细胞生物学特性的研究.. 人胃癌干细胞自我更新能力的分析甲基纤维素成球实验结果表明 在 :9+ 1 细胞中 细胞亚群成球数明显高于 细胞亚群 :9+ 1 细胞中 622- 和 细胞亚群成球数分别为 2/.. 和 +..2 =. 在 &6/ 1 细胞中上述两细胞亚群成球数分别为 +.. 和..2 <. 差异具有统计学意义 '# 因此 人胃癌干细胞 622- 细胞亚群具有较强的自我更新!"#!$ +

4 能力 人胃癌干细胞侵袭能力的分析体外侵袭实验表明 在 细胞中!! "#$ 细胞亚群侵袭细胞数明显高于!! %&$ 细胞亚群 中!!"'$ 细胞亚群侵袭细胞数 是!! "&$ 细胞亚群侵袭细胞数 的 倍 差异具有统计学意义 相关实验结果在 ) 细胞系也得到验证 +-. 因此 人胃癌干细胞!!%'/ 细胞亚群具有较强的侵袭能力 人胃癌干细胞耐药能力的分析顺铂耐药实验表明 同一顺铂浓度下 细胞亚群存活率较 细胞亚群高 当顺铂浓度分别为 时 细胞亚群的存活率为! 而 细胞亚群存活率分别为! 个顺铂浓度下 值分别为! 在 ) 细胞系中 当顺铂浓度为 -01 时 细胞亚群的存活率为! 细胞亚群存活率为 值为 差异具有统计学意义 +-.! 人胃癌干细胞差异表达 1 及其验证采用北京博奥生物的 芯片 对分 +78!.1; 6 )! ! +!"#$ % & ' && )! 193: 9;3 : 9: 19: :.1; : 9: 9: ).1; :9: 0.9 % + + -% %./0 % &.10!"#$ % & ' 8 :9: 9932 : 9:.1; :9: : 9: 9: ).1;.1; :9: 0.9 ) ) % + % %%.0 % &.10!"#$ % & '!"#!$

5 选后的 细胞中!"# 和!$# 细胞亚群进行分析 芯片结果表明 上调 %&' 共有 个 下调 %&' 共有 个 结合文献调研 相关 %&' 研究现况及相关信号通路 我们采用 技术对待研究的差异表达 %&' 表达情况进行验证 实验结果可知 与!$ # 细胞亚群相比!# 亚群中 %&) %&%&)%& +%&' 表达上调 相应 值为 - --%&- %& -+ 表达下调 相应 值为 - 与 %&' 表达谱芯片结果相符.&/0 1&' 对胃癌干细胞生物学特性的调控作用 - 1&' 对人胃癌干细胞自我更新能力的影响 基于 %&' 表达谱芯片分析结果 我们对上述上调 %&' 相关功能进行研究 细胞系中 对照组成球数为 - 干扰 %&-)%&- %&)%&+%&' 表达后 甲基纤维素成球数分别为 相应 值为 同时 细胞中也得到相似实验结果 差异均具有统计学意义.&/0 因此 抑制 %& 表达后 人胃癌干细胞的自我更新能力均减弱 1&' 对人胃癌干细胞侵袭能力的影响 细胞系中 对照组侵袭细胞数为 干扰 %&)%&%&) 0&) ) ' - -!$#!# 2'2)&2 3 '&)&24/5%#. %)& &2 %&+%&' 表达后侵袭细胞数分别为 相应 值为 在 细胞系中 对照组侵袭细胞数为 0&) ) - - -!$#!# 干扰 %&)%&%&) %&+%&' 表达后侵袭细胞数分别为 2'2)&2 3 '&)&2!/5%#! "# $ %&' %& )+! -## - %&) %&+ %&) %&+ %&' %& %&+!#!$# %&' %& -##! -## 2&%&) 2&%&+ 2&%&) 2&%&+ 2&%&' ' /! - -01! ## -"# $ 2&%&) 2&%&+ 2&%&) 2&%&+ 2&%&'!"#!$

6 相应 值为 ")+ 因此 抑制 #"$ 表达后 人胃癌干细胞的侵袭能力均减弱 "-$ 对人胃癌干细胞耐药能力的影响耐药实验表明.&/++ 细胞系中抑制 #"$ %&#"$&#"$ %#"$'#"$ 表达 相应 0 分别为 胃癌干细胞的耐药能力下降 此外.&/++ 细胞系中 干扰相应 #"-$ 表达后耐药能力均下降 差异均具有统计学意义 ")+ 讨 )#'+. -8 " 9%."- +.9".)% 8"+ )9"9% %!+!"#"$%&!"#"$'!"#"$%!"#"$'!"#"$ )#'+. -8 " 9%."- +.9".)% 8"+!"#"$%&!"#"$'!"#"$%!"#"$'!"#"$! " "#$!# $%&'!!"#"$%&!"#"$'!"#"$%!"#"$'!"#"$ - +!%!"- -8 ".&%!" 4#6 )9"9% %!+ : - +!%!"- -8 ".&%!" 4#6 )! "!!" +&'!!"#"$%&!"#"$'!"#"$%!"#"$'!"#"$ 胃癌是常见的恶性肿瘤之一 复发和转移是胃癌预后不佳的主要因素 肿瘤干细胞是指肿瘤内一群具有自我更新能力与不定向分化潜能的细胞 具有自我更新 无限增殖 高致瘤性 抵抗放化疗等生物学特性 目前 肿瘤干细胞的分离主要通过 种途径 侧群细胞法 无血清悬浮培养 利用表面标志物来分选 研究表明在胃癌组织和胃癌细胞系中均存有肿瘤干细胞 1 是胃癌干细胞的标志物之一 本研究通过无血清悬浮培养和胃癌干细胞标志物 1 流式分选技术相结合成功分离人胃癌干细胞 体外功能实验也证明分离得到的细胞具有典型的肿瘤干细胞生物学特性 即有较强的自我更新能力 侵袭和耐药能力 多项研究证实 #"-$ 在多种肿瘤干细胞中表达异常 有些表达上调发挥癌基因的作用 有些则表达下调发挥抑癌基因的作用 此外 #"-$ 对肿瘤干细胞的生物特性和肿瘤发病机制中也起到重 要作用 % 等研究表明 #"$'& 通过靶向 )$" $&%!+ " 信号通路可减弱胶质瘤干细胞的干性和放射抵抗性 从而为胶质瘤的治疗带来新希望 在肝癌干细胞中 #"$ 不表达或表达甚微 若重建其表达可通过 #%2 信号通 路抑制肝癌干细胞的侵袭 减少复发 /+ 等在结肠癌干细胞中发现 #"$%' 过表达可显抑制紫杉醇耐药的人结肠癌干细胞中醛脱氢酶 家族 31 和 的表达 从而加速细胞凋亡 针对胃癌干细胞利用纳米技术介导 #"$% 靶 向运输可对胃癌进行治疗 本研究中 以表达相差 倍以上作为划分标准 我们进行人胃癌干细胞 1456 与 1476 细胞亚群 #"-$ 表达谱差异的比较 芯片结果表明 上调 #"-$ 共有 个 下调 #"-$ 共有 个 在此基础上 结合文献调研和相关 #"-$ 研究现况 我们重点分析了上调表达 #"-$.#"$ %&#"$&#"$%#"$'#"$ 下调表达 #"-$.#"$#"$' 采用!"#!$

7 技术对上述 表达情况进行验证 结果与表达谱符合 证明 表达谱结果可信 体外功能实验结果表明 上述上调表达的 在胃癌干细胞的自我更新 侵袭和耐药等生物学特性上具有调控作用!"# 对自我更新能力影响最大 $%&!"# 对侵袭能力影响最大 $!"# 对耐药能力影响最大 因此 胃癌干细胞中具有多种差异表达 差异表达的 对胃癌干细胞生物学特性具有调控作用 综上所述 在肿瘤干细胞的自我更新 增殖 分化及侵袭等方面起到重要作用 利用 干扰 对异常表达的 进行调控 从而间接调控肿瘤干细胞生物特性 以期对肿瘤进行干预 此外 不同的肿瘤干细胞存在特异的 而在同一肿瘤干细胞的不同分化阶段也有特异的 的表达 因此 探寻普通肿瘤细胞和肿瘤干细胞 表达的差异 抑或发现肿瘤不同发展时期特异表达的 都将促进肿瘤诊断 治疗新策略的发展 参考文献 '! & )+ &+-.+/&+ &0 & %!'1- &0 1 +0%!""!- ' &0 1&0 0 &0.0 &+-.& &0'1- &0%%$222%- '$ ++ 3 &0 4- & '1-6 7#0 80+%%!2%2- '2 38& 9)6 ):06.- &0 ++ &0 +5 5&& #&&5 8; '1- &0 %%!$!%!"!- '" 7& 0& 478/&& &+- # 0 &6 ; :22 &05 :!$$ & & #0 & 0 #8&&+ 6&6 ++ &0& &5 8 0&5 6&0 88&# ;++5 / &5&+ #8& '1-70+ #%$$$$$$$2- ' &0 1 8&0. &+- )0&+0565 #8+&+ 08&+ &0 0 0 & &0& ++ &05 0&0 ; &0 ++ 8&& ' %"<$=-5!%-2$>-!"$"!- ' 8&0?0 005 : &0 &0 ++ &05 &0 ++ 8& ++6+& 60 8&# &0 0&6&+ #56 ' ; )!)#!- '#6/ &8&5 ; #0 ' /& )&&6 86 : &+- + ##8& &++ ++ & 8&#6 & ; &0 +/+& & '1- ) ++ &0 + 95! )#!2- '#6/ &8&5 ; #0 ' 00/&68 ++ &+&0 &+- 4>0; &##&/ 0&+0 0/6 +/+& & ++ &00&0'1-70&!!$!- '! #+0 9& )&/6 &+- &0 ++ # &05 8& &0'1- ) ++ 40!2!- '!! 86 A3&0 3 &+- &0 8&&# ++ ;&0 & '1- &6!"$$22- '! ) &+- )0 858 #&8& 0&+ ; &00&0 ; & &0 & &0#'1- ) 70!!!- '!$ 6 :)80 )8. &+- &0&+ ; :22 <B C &05 :22 < C & &0 ++ ' %2$$%- '2 &0 910 &0 ) &+- &0 #8 ; & &0 #&0 #5 &0 5&+ 5+ ; &0 ++ &8 ' ; )% $"$%"- '" ) 10 &+- :$$ # 0 +&5 8 8 &0 &05 &+ 60 ; & &0'1-1 )6 70+%%%%2- ' 0 :0? 19-7# 0 ; 0&0 #0 & &5 8 # #0 0 & &50&0& ' %"- ' )60 :0 8&0 &+- 0 D /& &0 ++ &5& # /0 ; 8 +0 :>>30 0&+0 #&8&' #%2$"$- ' 36 9& $"# # 80& 0 &05 +;0&+ ; & &0 ++ / 30>/& &00 0&+0' #%2$2$2- ' &0 36 )80 &+- 92/"# # 0 &06& 0 &05 &5 &0 ; +& ++ / &0 86>+0#>/&&00 #&8& '1-70&%2"%"2"- '% #D7+& 1985 & &0 + 8#&&0& ++ # 6 5&0 868 &505#050./& #&8&'1-70&%$%$- ' "&>/ 6+& 8 && 0 ; & #&+&+ &0 +0 &0 '1- &0 40 %$$$- ' 1&0 )0 &+- &0 +5&5 5+ ; $2& ; :22 # 0 & &0 ++ 8&#'1- &&+ % %"2-!"#!$ $

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