32 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.37No (EMP) 途径是否参与调节肿瘤细胞活动尚不明确因此, 本文以肝癌细胞为主要研究对象, 探讨海藻多糖对其增殖和迁移的影响及其与 EMP 途径的关系为 AP 抗肿瘤机制的进一步研究提供新的思路肿瘤细胞与大

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侗松构殷
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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2017,37(9):31 40 DOI: /j.cb 海藻多糖通过下调肝癌细胞 Hep3B 糖酵解途径抑制细胞增殖和迁移冯 1 源唐 2 云徐 3 蕾 4 谭海刚 (1 广东省高校功能蛋白质研究重点实验室暨南大学生命与健康工程研究院广州 ) (2 天津科技大学食品与营养安全教育部实验室天津上海交通大学生命科学技术学院上海 ) (4 青岛农业大学食品科学与工程学院青岛 ) 摘要目的 : 探讨海藻多糖 (algalpolysaccharides,ap) 对肝癌细胞 Hep3B 的增殖和迁移的影响及其可能的作用机制, 为治疗肝癌提供新的思路方法 :1 比较正常细胞与癌细胞中糖酵解 (embden meyerhof parnas,emp) 途径的表达差异, 用紫外分光光度计比色法检测 EMP 限速酶酶活力 : 己糖激酶 (hexokinase,hk) 丙酮酸激酶 (pyruvatekinase,pk), 用乳酸测定试剂盒测定 EMP 产物 : 乳酸 2AP 处理 Hep3B 后, 检测 EMP 表达水平变化 3AP 处理细胞后, 检测肝癌细胞 Hep3B 的增殖和迁移能力及对上皮细胞间充质转化 (EMT) 的影响, 方法包括 MTT qpcr 和 Transwel 小室实验 4MTT Transwel 和 qpcr 检测 HK 抑制剂 3 溴丙酮酸 (3 bromopyruvate,3 BrPA) 对肝癌 Hep3B 细胞的活力和迁移能力及 EMT 的影响 5Westernblot 和相关试剂盒检测 AP 与 3 BrPA 分别处理细胞时, 对 EMP 水平及 Akt 通路的影响 6AP 联合 3 BrPA 处理 HepB3 后, 检测 HK 和 Akt 信号通路表达水平及细胞活力和迁移的变化结果 :1 癌细胞 (Hep3B HeLa SW480)EMP 代谢水平均高于正常肝细胞 (HL02), 其中 Hep3B 差异最为显著 2AP 能抑制 HepB 细胞 EMP 代谢水平, 且抑制程度随着 AP 浓度升高而升高, 存在浓度依赖性 3AP 可抑制肝癌细胞 Hep3B 的增殖和迁移, 且抑制 EMT 的发生 AP 浓度为 200mg/ml, 处理时间为 48h 时, 生长抑制率达 (55±2.8)%, 细胞迁移数为对照组的 (32±2.9)%;43 BrPA 可下调 Hep3B 细胞 HK 活性, 并抑制细胞活力与迁移, 且抑制 EMT 的发生 200μmol/L3 BrPA 作用细胞 48h 后, 与对照组相比, 细胞活性下降了 (52±5.8)%(P<0.001), 细胞迁移数下降了 (48±6.1)%(P< 0.01) 5AP 和 3 BrPA 均下调 EMP 代谢水平, 且抑制 Akt 信号通路 6AP 与 3 BrPA 联合处理 Hep3B 后,HK 表达下降, 显著抑制 Akt 信号通路, 细胞活性和迁移能力均较 AP 单用组显著下降 (P<0.05) 结论: 肝癌细胞 Hep3BEMP 代谢水平高于正常肝细胞,AP 可下调 Hep3B 细胞 EMP 代谢水平, 低 EMP 代谢水平可能通过下调 EMT 和 Akt 信号通路抑制 Hep3B 的增殖和迁移当 AP 和 3 BrPA 联合应用时, 抑制肝癌迁移和增殖效果更明显关键词海藻多糖 EMP 途径 Hep3B 细胞细胞增殖细胞迁移中图分类号 Q493.4 海藻多糖 (AP) 是从海藻中提取的一种高分子碳水化合物, 具有丰富的生物活性它的结构是由多个单糖基通过糖苷键相连而成的, 糖基可相同或者不同 [1] 收稿日期 : 修回日期 : 电子信箱 :fy75000@hotmail.com AP 是多糖的一种, 其极端的生存环境让它成为治疗癌症的优化选择目前普遍认为,AP 抗肿瘤的机制有 : 使肿瘤细胞膜特性改变诱导肿瘤细胞凋亡, 通过提高抑癌基因 p53 表达改变细胞形态 ; 从而使细胞间通信恢复, 加强抵御细胞抗自由基的能力 [2] 但糖酵解

2 32 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.37No (EMP) 途径是否参与调节肿瘤细胞活动尚不明确因此, 本文以肝癌细胞为主要研究对象, 探讨海藻多糖对其增殖和迁移的影响及其与 EMP 途径的关系为 AP 抗肿瘤机制的进一步研究提供新的思路肿瘤细胞与大多数正常组织的细胞不同, 其主要通过 EMP 获取能量, 甚至在供氧充足时形成对有氧糖酵解的依赖, 即 Warburg 效应 [3] EMP 的三个限速酶分别已糖激酶 (HK),6 磷酸果糖激酶 1(PFK 10) 丙酮酸激酶 (PK), 糖酵解终产物是乳酸而正常组织获取能量的方式是糖的有氧氧化, 仅在缺氧情况下进行 EMP [4] 目前已发现在胰腺癌肺癌食管癌宫颈癌和前列腺组织癌等癌 [5] 症中,EMP 代谢水平高于正常组织, 肿瘤同时也是一种代谢疾病的观点得到广泛认同 [6] 肝癌 (hepatocelularcarcinoma,hcc) 是全世界最常见的恶性肿瘤之一, 在肿瘤相关死亡中排第 3, 其中全世界 55% 的患者来自中国 [7] 随着科技进步, 免疫疗法基因疗法和分子靶向治疗等生物治疗已成为继传统治疗肿瘤的新型疗法 [8] 治疗恶性肿瘤最大的障碍来源于其侵袭和迁移的能力, 肝癌细胞治疗临床肿瘤患者 (90%) 死亡的原因源于此 [9] 目前临床缺乏有效抗肝癌增殖和迁移的药物, 研制抗增殖迁移药物已成为肿瘤化疗亟待解决的问题 1 材料与方法 1.1 材料细胞 HL02 人正常肝细胞株 Hep3B 人肝癌细胞株 HeLa 宫颈癌细胞株 SW620 结肠癌细胞株均购自美国模式培养物集存库 (AmericanTypeCulture Colection,ATCC) 主要试剂 1640 培养基, 胎牛血清 (fetalbovine serum,fbs) 均购自 Gibco 公司 ;AP 由天津科技大学赠予 ;HK PK 酶活测定试剂和 3 BrPA 均购自 Sigma 公司 ;MTT 和 DMSO 均购自 Sigma 公司 ; 反转录试剂盒 BCA 试剂盒 TRIzol 试剂和 IP 细胞裂解液购自凯基生物 : 抗 GAPDH 抗体抗 HK I 抗体抗 p AKT 抗体抗 Akt 抗体均购自 CST 公司 ; 乳酸化学法分析试剂盒购自 Pierce 公司 ; 实时荧光定量 PCRMix 购自 Toyobo 公司 ; 蛋白质转膜设备和紫外分光光度计均购自 Bio Rad 公司其他试剂均为国产分析纯 1.2 方法细胞培养 HL02 Hep3B HeLa SW480 均为贴壁生长, 复苏后将细胞平铺在细胞培养瓶中, 培养基为含 10% FBS 的 RPMI1640 完全培养基, 轻轻铺平后放入培养箱, 使细胞贴壁生长, 培养箱参数为 37 恒温, 5% 二氧化碳饱和传代频率 3 天一次, 选用生长状态佳的细胞进行实验实验分组按上述方法培养细胞后取第 3~8 代细胞进行实验当细胞密度达 80% ~90% 时, 将 RPMI1640 完全培养基更换为 RPMI1640 无血清培养继续培养 24h, 使细胞同步化后再进行 AP 或 3 BrPA 干预实验实验分为 6 组, 分别为对照组 ( 不做任何干预 ) 和不同终浓度 AP 浓度剂量组 [ 加入不同 AP 浓度 (10mg/ml 20mg/ml 50mg/ml 100mg/ml 200mg/ml)] 培养 24h 48h 72h 后, 进行下一步实验总蛋白质量测定裂解液裂解细胞后, 低温 4,12000r/min 离心 30min, 取上清液中的总蛋白质绘制标准曲线将细胞裂解后的上清液依次稀释, 使其蛋白质浓度在标准曲线可信区间 MTT 测定细胞生长抑制率和细胞活性取对数生长期细胞接种于 96 孔板, 每孔 4000 细胞数 12h 后, 细胞贴壁生长, 加入新鲜完全培养基和不同浓度的 AP, 分为 5 个处理组 ( 终浓度为 10mg/ml 20mg/ml 50mg/ml 100mg/ml 和 200mg/ml) 另有不给 AP 作为对照组, 无细胞作为空白组作用 48h 后, 用 MTT 法在自动酶标仪上测定 490nm 吸光度细胞生长抑制率 (%) 定义为 :( 对照组 OD 值 - 处理组 OD 值 )/( 对照组 OD 值 - 空白组 OD 值 ) 100%; 细胞活力 (%) 定义为 :( 处理组 OD 值 - 空白组 OD 值 )/( 对照组 OD 值 - 空白组 OD 值 ) Westernblot 测定细胞总蛋白质浓度后, 根据实验设计使用 LoadingBufer 制样加样 100V 电泳 1.5h 后停止 100V 200mA 电转膜 1~2h, 将膜放入含 5% 脱脂奶粉的 TBST 中孵育 1h 后加一抗, 与摇床上 4 孵育过夜 TBST 洗涤 3 次, 每次 10min 加二抗, 于摇床上室温孵育 2h,TBST 洗涤 3 次, 每次 10min 用显影液显影, 应用凝胶成像系统拍摄, 对所得图像进行灰度值分析, 以 GAPDH 为内参照用 ImageJ 软件定量分析酶活性测定 HK PK 活性测定用酶耦连比色法, 具体操作遵循试剂盒说明书加入酶提取液启动反应, 酶活测定在 25 恒温下进行, 在 1cm 宽的石英比色皿中用分光光度计于 340nm 下隔 5s 读取吸光值 (B), 共读取 3min 以 B 对时间作图, 取反应最初线性部分斜率计算酶活乳酸含量测定乳酸测定用化学比色法, 具体

3 2017,37(9) 冯源等 : 海藻多糖通过下调肝癌细胞 Hep3B 糖酵解途径抑制细胞增殖和迁移 33 操作遵循试剂盒说明书 Transwel 法检测细胞侵袭能力用胰酶消化对数期细胞后, 制成为 /L 细胞悬液将 100μl 细胞悬液加入 Transwel 小室上层中, 下室加入 400μl 完全培养基, 每组设置三个平行复孔于培养箱中培养 48h 后取出 Transwel 小室, 用棉签轻轻擦去上室未穿透的细胞, 冰预冷 PBS 缓冲液轻洗 3 次,4% 多聚甲醛室温固定 10min,0.1% 结晶紫染色 30min, 在显微镜下随机选取 5 个视野计数穿膜细胞数目, 取平均值, 放大倍数为 100 倍实时荧光定量 PCR 细胞的总 RNA 使用 Trizol 提取后测浓度, 取其中 1μg 反转录成 cdna, 以其为模板进行 qpcr, 将肝癌 Hep3B 加入不同浓度 AP 后, 对细胞内 EMT 信号通路中 MarkermRNA 表达水平进行检测 PCR 反应条件为 :94 预变性 3min;94 变性 40s;55 退火 40s;72 延伸 40s;40 个循环 ; 最后,65 5s, 每次升高 0.5, 直至 95 BioRad 软件进行分析划痕修复实验对数期细胞在 12 孔板中培养, 第二天用 10μl 枪头沿直线在孔低划线,PBS 清洗两次, 加入含相应浓度 AP 3 BrPA 和 2.5%FBS 的新鲜培养基培养, 在倒置显微镜下拍照 ( 100), 在划痕边缘等距离取距离培养, 培养 24h 后, 再拍照在同样的位置取距离划痕修复率 (%)=(0h 划痕宽度 -24h 划痕宽度 )/0h 划痕宽度 100% 统计学方法实验均独立重复三次, 实验数据用均数 ± 标准差表示 ; 利用 SPSS17.0 和 GraphPad Prism5 软件进行统计学分析 ; 多组间均数比采用 Ttest, P<0.05 表示差异具有统计学意义 2 结果 2.1 癌细胞 EMP 表达水平高于正常细胞选用正常人肝细胞 HL02 肝癌细胞 Hep3B 宫颈癌细胞 HeLa 和结肠癌细胞 SW480 进行实验用分光光度计测定细胞内 HK 和 PK 活性, 标准曲线如图 1(a) 所示 HK 和 PK 分别是 EMP 途径的第一和第三个限速酶, 测定酶活性分别如图 1(b) (c) 所示癌细胞 HK 和 PK 活性均高于正常细胞 HL02, 差异具有统计学意义 (P<0.05) 乳酸是 EMP 途径产物, 在癌细胞中含量均高于 HL02(P<0.05), 见图 1(d) 肝癌细胞 Hep3B 差异最显著, 故将其选为后续实验细胞株 2.2 AP 能抑制 Hep3B 的 EMP 代谢水平 AP 不同浓度处理 Hep3B 细胞 48h 后收集细胞, 测定 HK 酶活力 PK 酶活力和乳酸含量结果表明,AP 浓度为 10~100mg/ml 时,HK 和 PK 酶活力随着 AP 浓度升高而降低在 AP 浓度为 100mg/ml 时,HK 和 PK 酶活力与对照组相比, 分别降低了 (74±3.9)% 和 (76± 8.9)%, 差异具有统计学意义 (P<0.01,P<0.001), 结果见图 2(a) (b) AP 浓度为 10~200mg/ml 时, 细胞内乳酸含量随着 AP 浓度升高而降低在 AP 浓度为 200mg/ml 时, 乳酸浓度为 (36±4.2)μmol/L, 比对照组降低了 (60 ±5.8)%, 差异具有统计学意义 (P<0.01) 2.3 AP 抑制肝癌细胞 Hep3B 的增殖和迁移, 且抑制 EMT 发生不同浓度 AP(10~200mg/ml) 分别处理 Hep3B 细胞 24h 48h 和 72h 后, 细胞生长均得到抑制处理 48h, 效果最显著以 48h 为例, 随着海藻糖的浓度增加 (10mg/ml 20mg/ml 50mg/ml 100mg/ml 200mg/ml), 肝癌细胞增长抑制率显著升高, 分别为 (3.8±1.1)% (15±2.1)% (30±3.3)% (56±3.9)% (55± 2.8)%, 结果见图 3(a) Transwel 小室实验结果显示, 不同浓度 AP(10~200mg/ml) 处理 HepB3 细胞 48h 后, 细胞迁移数均能得到抑制, 与 AP 浓度呈现依赖相关性 (P<0.05) AP 浓度为 200mg/ml 时,Hep3B 细胞迁移数为对照组的 32±2.9%(P<0.01), 见图 3(c) 利用 qpcr 进一步研究与细胞迁移密切相关的 EMT 途径标志蛋白 : 间充质标志物 N cadherin 上皮细胞标志物 Occludin N cadherin 随着 AP 浓度的升高 mrna 表达水平降低 (P<0.05),Occludin 则相反 (P<0.05), 说明 AP 能抑制 EMT 发生, 见图 3(b) 2.4 HK 抑制剂 3 BrPA 下调 Hep3B 细胞活力和迁移, 且抑制 EMT 发生 3 溴丙酮酸是 (3 BrPA) 是二型已糖激酶 (HK I) 抑制剂, 基于可抑制 EMP 代谢水平, 目前已作为一种新型抗肿瘤药物进入临床试验阶段 [10] Westernblot 结果显示, 与对照组相比,3 BrPA(200μmol/L) 处理组的 HK 表达明显下降 (P<0.05) 证明 3 BrPA 有效抑制 HK 表达, 见图 4(a) MTT 实验结果显示,3 BrPA (200μmol/L) 处理组分别加药处理 Hep3B 细胞 24h 48h 和 72h 后,Hep3B 细胞活性与对照组相比分别下降了 (19±4.7)%,(52±5.8)% 和 (31±5.9)% 差异有统计学意义 (P<0.05 P<0.001 P<0.01) 表明降低 HK 活性能抑制 Hep3B 细胞活力, 见图 4(b) Transwel 小室迁移实验表明, 与对照组相比,3 BrPA

4 34 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.37No 图 1 四株细胞内源性 HK 活性 PK 活性和乳酸含量测定比较 Fig.1 TheendogenousenzymeactivityofHK,PK andconcentrationoflacticacidinfourdiferentcellines (a)thestandardcurveofhkandpkenzymeactivity (b)thehkenzymeactivitymeasuredbyuvspectrophotometer (c)thepkenzyme activitymeasuredbyuvspectrophotometer (d)thelacticconcentrationmeasuredbyasaykit Mean±SD.n=3. P<0.05vsHL02; P< 0.01vsHL02; P<0.001vsHL02

5 2017,37(9) 冯源等 : 海藻多糖通过下调肝癌细胞 Hep3B 糖酵解途径抑制细胞增殖和迁移 35 图 2 海藻多糖对 Hep3B 细胞内源 HK 酶活力 PK 酶活力和乳酸含量的影响 Fig.2 Theefectofdiferentconcentrationofalgalpolysaccharides(AP)onHK enzymeactivity, PK enzymeactivityandlacticacidconcentrationinhep3bcel (a)theproteinlevelofhkandpkinthehep3bceltreatedwithap (b)theviabilityofthehep3bceltreatedwithap (c)theimmigration ofthehep3bceltreatedwithap Mean±SD.n=3. P<0.05vsControl; P<0.01vsControl; P<0.001vsControl 图 3 不同浓度 AP 对肝癌细胞 Hep3B 迁移增殖及 EMT 的影响 Fig.3 Theefectofdiferentconcentrationalgalpolysaccharides(AP)onmigaration, proliferationofhep3bcelandemtpathway (a)thehep3bgrowthinhibitionratetestedbymttasay (b)therelativegenemrnaexpresionofn cadherinandoccludinafteralgal polysaccharides(ap)treatmenttestedusingqpcrinhep3b (c)theimmigrationofthehep3bceltreatedwithdiferentconcentrationalgal polysaccharides(ap)accordingtotranswel P<0.01vscontrol; # P<0.05vsoccludincontrol; ## P<0.01vsoccludincontrol (200μmol/μl) 处理组细胞迁移数下降了 (48±6.1)%, 差异具有统计学意义 (P<0.01), 表明 3 BrPA 有效下调 HK 活性并且能抑制 Hep3B 细胞迁移能力, 见图 4 (d) 利用 qpcr 进一步研究与细胞迁移相关的 EMT

6 36 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.37No 途径标志蛋白 : 间充质标志物 N cadherin 和上皮细胞标志物 Occludin 3 BrPA 处理组与对照组相比,N cadherinmrna 表达水平下降 (P<0.01),Occludin 则相反 (P<0.01), 见图 4(c) 图 4 HK 抑制剂 3 BrPA 对 Hep3B 细胞活力迁移作用和 EMT 的影响 Fig.4 Theefectonviability,migrationandEMToftheHep3BceltreatedwithHK inhibitor3 BrPA (a)theproteinlevelofhkinthehep3bceltreatedwith3 BrPA (b)theviabilityofthehep3bceltreatedwith3 BrPA (c)therelative genemrnaexpresionofemtmarkerincludingn cadherinandoccludinafter3 BrPA treatmenttestedusingqpcr inhep3b (d)the immigrationofthehep3bceltreatedwith3 BrPA Mean±SD.n=3. P<0.05vsControl; P<0.01vsControl; P<0.001vsControl 2.5 AP 和 3 BrPA 均下调 EMP 代谢水平, 且抑制 Akt 信号通路 Westernblot 结果显示,AP 或 3 BrPA 分别处理 Hep3B 后, 肝癌细胞 EMP 限速酶 HK 和 PK 的活性产物乳酸量均下降,Hep3B 的 EMP 水平得到抑制, 见图 5 (b) HK I 蛋白和 p Akt 表达水平较对照组均下降, 且 Akt 蛋白水平没有发生变化,Akt 信号通路受到抑制, 见图 5(a) 证明 AP 与 3 BrPA 药物类似, 都能下调 EMP 代谢水平, 且抑制 Akt 信号通路 2.6 AP 与 3 BrPA 联合应用后, 进一步抑制细胞的活力和迁移, 且抑制 Akt 信号通路 WesternBlot 结果显示,AP 与 3 BrPA 联合处理 Hep3B 后 HK 蛋白表达水平较 AP 单用组要低, 当 3 BrPA 浓度为 200μmol/L AP 浓度为 200mg/ml 时,HK 表达水平最低 (P<0.01), 且显著抑制 p Akt 表达, 见图 6(a) AP 与 3 BrPA 联合处理后,Hep3B 细胞的活性和迁移能力均较 AP 单用组下降 (P<0.01), 见图 6 (b) (c)

(b)theempmetaboliclevelsofthe Hep3BceltreatedwithAPor3 BrPA Mean±SD.n=3. P<0.05vsControl; P<0.01vsControl 图 6 AP 与 3 BrPA 联合应用对 Hep3B 细胞活力迁移及 Akt 信号通路的影响 Fig.

7 2017,37(9) 冯源等 : 海藻多糖通过下调肝癌细胞 Hep3B 糖酵解途径抑制细胞增殖和迁移 37 图 5 AP 与 3 BrPA 分别处理细胞时, 对 EMP 代谢水平及 Akt 通路的影响 Fig.5 TheefectofontheEMPpathwayandaktsignalingpathwayinHep3Bcelwith algalpolysaccharides(ap)or3 BrPAtreatment (a)theproteinlevelofhk I p Akt,AktandGAPDH inthehep3bceltreatedwithapor3 BrPA (b)theempmetaboliclevelsofthe Hep3BceltreatedwithAPor3 BrPA Mean±SD.n=3. P<0.05vsControl; P<0.01vsControl 图 6 AP 与 3 BrPA 联合应用对 Hep3B 细胞活力迁移及 Akt 信号通路的影响 Fig.6 Theefectofalgalpolysaccharides(AP)and3 BrPAco treatmentonthecelviability, celmigrationandaktsignalingpathwayinhep3bcel (a)theproteinlevelofhk I Akt p AktandGAPDH inthehep3bceltreatedwithapand3 BrPA (b)theviabilityofthehep3bcel treatedwithapand3 BrPA (c)theimmigrationofthehep3bceltreatedwithapand3 BrPA Mean±SD.n=3. P<0.05vsControl; P<0.01vsControl; P<0.001vsControl

8 38 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.37No 讨论肿瘤细胞作为一种代谢异常疾病, 在缺氧环境中能利用 EMP 产生能量, 能量代谢中 50% ~70% 依赖的是 EMP EMP 途径的三个重要限速酶分别是 HK 磷酸果糖激酶 (PFK) PK 基于此, 抑制 EMP 代谢水平也是临床药物开发的靶点 [11] 例如, 葡萄糖转运体 (Glut1) 抑制剂 :Phloretin Quercetin STF31 和 WZB117 等, 靶向为 HK I 的 3 BrPA 2 DG 和 Lonidamine 等, 靶向为 PFK2 的 3PO 等, 靶向为为 PK 的 TT 232 等 [12] 本文实验结果表明, 不同来源癌细胞 EMP 代谢水平均高于正常细胞 HK, 尤其以肝癌细胞 Hep3B 最为显著, AP 抑制 EMP 代谢水平因此,AP 能调节 EMP 代谢水平抑制 Hep3B 迁移和增殖目前了解的 AP 的功能有 : 增加机体免疫力抗病毒抗肿瘤抗氧化抗辐射等它的抗肿瘤作用机制, 主要认为与加强细胞免疫能力有关它既可以激活 T 细胞 B 细胞 NK 细胞 CTL 细胞 LAK 细胞等免疫细胞的活性 [13], 也可以促进 IL 1 TNF C3 等效应因子的生成, 还能调节血象, 抑制红细胞膜上 Na +,K +, ATPase 活性, 发挥强大的免疫网络功能, 提高机体的整体抗肿瘤能力 [14] 在本课题前期实验的结果表明,AP 可双向调节面包酵母菌株 (SacharomycescerevisiaeBY 6) 的单倍体菌株 9α 的 EMP 代谢水平所以我们提出设想 :AP 与 EMP 代谢水平在肿瘤细胞中是否存在调节关系, 进而调节癌症细胞活动? 本文实验结果首次证明,AP 能抑制肝癌 Hep3B 细胞 EMP 代谢水平, 存在浓度依赖性 Hep3B 细胞活性和迁移率, 随着 AP 浓度的上升而下降, 也存在浓度依赖性暗示新的 AP 抗肿瘤机制可能通过调节 EMP 代谢水平完成基于 AP 对肝癌细胞迁移能力影响显著, 我们检测了与细胞迁移密切相关的 EMT 标志物,EMT 是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程并发现, 随着 AP 浓度提升, 上皮标志物 OccludinmRNA 表达水平上升, 间质标志物 N CadherinmRNA 表达水平下降提示 AP 可抑制肝癌细胞 EMP 代谢水平, 低 EMP 代谢水平通过抑制 EMT 发生, 从而下调 Hep3B 的迁移能力我们本次实验采用 AP 混合物, 下一步将具体鉴定是哪一种 AP 发挥功效在上一步实验中, 我们证实 AP 对 EMP 代谢水平起抑制作用, 且对癌细胞活性和迁移能力产生一定抑制效果为了进一步研究 EMP 代谢水平下降是否可以直接抑制癌细胞的细胞活性和迁移能力我们采用了已知能调节癌症 EMP 水平的药物 3 BrPA HK I 抑制剂 3 BrPA 抑制 EMP 第一个限速酶的表达,3 BrPA 可以直接烷基化 HK I 中的硫基使 HK I 失活, 从而下调 EMP 代谢水平 [15] 目前 3 BrPA 作为抗癌药物已进入二期临床试验阶段将 3 BrPA 作用于肝癌 Hep3B 细胞时,EMP 代谢水平降低, 且伴随着肝癌细胞 Hep3B 细胞活性和迁移下降因此提示, 当癌症细胞中 EMP 水平发生变化时, 会影响肿瘤发生的活动, 如迁移和增殖我们同时检测了与细胞迁移密切相关的 EMT 标志物, 并发现,3 BrPA 处理组上皮标志物 OccludinmRNA 表达水平上升而间质标志物 N CadherinmRNA 表达水平下降提示 3 BrPA 通过下调 HK 活性抑制 EMP 代谢水平,EMP 代谢水平的降低抑制 EMT 发生, 从而导致 Hep3B 迁移能力下降这与 AP 抑制 Hep3B 迁移和增殖的可能机制类似虽然肿瘤细胞需通过 EMP 获取能量, 对 EMP 具有高度依赖性, 但是只抑制 EMP 往往不能有效杀死肿瘤细胞, 将机制不同的多种 ATP 耗竭联合是提高疗效的方式之一 [16] 本文实验将 AP 和 3 BrPA 联用后, 抑制细胞活性百分比和抑制细胞迁移率显著高于单用 AP 组 PI3K/Akt 是细胞内重要的生存信号通路, 关键分子是 Akt 研究表明, 激活后的 Akt 在高 EMP 的癌细胞中起到很强的抗凋亡作用 [17] Akt 的持续性稳定表达能诱导 EMT 发生, 使癌细胞的迁移能力增强 [18] 因此, 我们提出设想,PI3K/Akt 信号是否参与 AP 和 3 BrPA 介导下调 EMP 代谢水平, 从而抑制肝癌细胞迁移 Westernblot 显示,AP 单独处理组和 3 BrPA 单独处理组, 肝癌细胞 EMP 代谢水平下降, 且伴随着 Akt 的磷酸化水平下降, 总 Akt 水平保持不变在 AP+3 BrPA 处理组中,Akt 的磷酸化水平显著下降证明 AP 和 3 BrPA 介导下调 Hep3B 的 EMP 代谢水平, 而低 EMP 代谢水平抑制 Hep3B 迁移和增殖能力的机制可能与抑制 PI3K/Akt 信号通路有关总之, 癌细胞中,EMP 代谢水平高于正常细胞 AP 能下调肝癌细胞 Hep3B 的 EMP 代谢水平, 低 EMP 代谢水平可抑制细胞的增殖细胞活力和迁移活动而 EMP 低水平代谢抑制肝癌细胞活动的机制, 可能与抑制 EMT 发生和 PI3K/Akt 信号通路相关 EMT 和 PI3K/Akt 信号通路对 EMP 低代谢水平时抑制癌细胞迁移能力和增殖能力, 存在生物叠加效应还是触发其他信号通路还需进一步验证本文为阐述 AP 新的抗

9 2017,37(9) 冯源等 : 海藻多糖通过下调肝癌细胞 Hep3B 糖酵解途径抑制细胞增殖和迁移 39 肿瘤机制累计实验数据, 也为治疗肝癌提供了潜在的治疗方法和药物参考文献 [1]WijesekaraI,PangestutiR,Kim SK.Biologicalactivitiesand potentialhealthbenefitsofsulfatedpolysaccharidesderivedfrom marinealgae.carbohydratepolymers,2011,84(1): [2]LeeJC,HouM F,HuangH W,etal.Marinealgalnatural productswithanti oxidative,anti inflammatory,andanti cancer properties.cancercelinternational,2013,13(1):55. [3] Kim J,DangC V.Cancer smolecularsweettoothandthe Warburgefect.CancerResearch,2006,66(18): [4]PorporatoPE,DhupS,DadhichRK,etal.Anticancertargets intheglycolyticmetabolism oftumors:acomprehensivereview. FrontiersinPharmacology,2011,7(2):2. [5]AltenbergB,GreulichKO.Genesofglycolysisareubiquitously overexpresedin24cancerclases.genomics,2004,84(6): [6]GatenbyRA,GiliesRJ.Glycolysisincancer:apotentialtarget fortherapy.theinternationaljournalofbiochemistry& Cel Biology,2007,39(7): [7]HeimbachJ,KulikLM,FinnR,etal.Aasldguidelinesforthe treatmentofhepatocelularcarcinoma.hepatology,2017,209 (78): [8] BruixJ, Reig M, Sherman M. Evidence based diagnosis, staging,andtreatmentofpatientswithhepatocelularcarcinoma. Gastroenterology,2016,150(4): [9] NoyR, Polard JW. Tumor asociated macrophages: from mechanismstotherapy.immunity,2014,41(1): [10]NilsonH,LindgrenD,ForsbergAM,etal.Primaryclearcel renalcarcinomacelsdisplayminimalmitochondrialrespiratory capacityresultinginpronouncedsensitivitytoglycolyticinhibition by3 Bromopyruvate. CelDeath & Disease,2015,6(1): e1585. [11]XintaropoulouC,WardC,WiseA,etal.Acomparativeanalysis ofinhibitorsoftheglycolysispathwayinbreastandovariancancer cellinemodels.oncotarget,2015,6(28): [12]Ganapathy KanniappanS,GeschwindJFH.Tumorglycolysisas atargetforcancertherapy:progresandprospects.molecular Cancer,2013,12(1):152. [13]CostaLS,FidelisGP,CordeiroSL,etal.Biologicalactivities ofsulfatedpolysaccharidesfromtropicalseaweeds.biomedicine& Pharmacotherapy,2010,64(1): [14] ZongA,CaoH, WangF. Anticancerpolysaccharidesfrom naturalresources: A review ofrecentresearch. Carbohydrate Polymers,2012,90(4): [15]ShoshanMC.3 Bromopyruvate:targetsandoutcomes.Journalof BioenergeticsandBiomembranes,2012,44(1):7 15. [16]ZhengJ.Energymetabolismofcancer:Glycolysisversusoxidative phosphorylation(review). OncologyLeters,2012,4(6): [17]LiuZ,ZhangYY,ZhangQW,etal.3 Bromopyruvateinduces apoptosisinbreastcancercelsbydownregulatingmcl 1through thepi3k/aktsignalingpathway.anti cancerdrugs,2014,25 (4): [18]HaGH,ParkJS,BreuerEKY.TACC3promotesepithelial mesenchymaltransition(emt)throughtheactivationofpi3k/ AktandERK signalingpathways.cancerleters,2013,332 (1): AlgalPolysaccharidesInhibitsProliferationandMigrationof LiverCancerCelHep3BViaDown regulationofemppathway FENGYuan TANGYun XULei TANHai gang (1KeyLaboratoryofFunctionalProteinResearchofGuangzhouHigherEducationInstitutes, InstituteofLifeandHealthEngineering,JinanUniversity,Guangzhou ,China) (2KeyLaboratoryofFoodandNutritionSafetyofMinistryofEducation,ColegeofFoodScienceand Biotechnology,TanjinUniversityofScienceandTechnology,Tianjin ,China) (3ColegeofLifeScienceandTechnology,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai ,China) (4ColegeofFoodScienceandEngineering,QingdaoAgriculturalUnviersity,Qingdao ,China) Abstract Objective:Toinvestigatetheefortofalgalpolysaccharides(AP)ontheabilityofproliferation

10 40 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.37No andmigrationinthelivercancercellinehep3bandpotentialmechanism whichmayprovideanewideafor treatmentoflivercancer.methhods:1fourdiferentcellineswereselectedtocomparethemetaboliclevelsof embden meyerhof parnas(emp)pathwayinnormalcelsandcancercels.2todetecttheempmetaboliclevels changesinhep3bwithaptreatment.3 MTT,qPCR andtranswelwereusedtomeasuretheabilityofcel proliferation,emtmarkerandcelmigrationrespectivelyinhep3b celwithaptreatment.4 Measuredthe abilityofcelviability,proliferationandemtpathwaywithinhibitor:3 bromopyruvate(3 BrPA).5Measured EMPlevelsandAktsignalpathwaychangeswithAPor3 BrPAtreatment.6DetectedAktsignalpathway,cel viabilityandmigrationchangeswithapand3 BrPAtreatment.Result:1ThemetaboliclevelsofEMPincancer cels(hep3b,hela,sw480)arehigherthannormalcel(hl02).hep3bcelempmetaboliclevelisthehighest inthreecancercellines.2 APdownregulatedmetaboliclevelsinHep3B celanditwasconcentration dependent.3 APinhibitedtheabilityofproliferationandmigrationinHep3B anddownregulatedtheemt progres.4 3 BrPA inhibitedhk activityanddownregulatedthecelviabilityrateandmigrationability comparedwithcontrolgroup(p<0.01).5apand3 BrPAbothdownregulatedtheEMPlevelsandinhibited Aktsignalpathway.6InAP +3 BrPAgroup,HKactivitywasdepresedobviouslycomparedwithAPgroup, andcelviabilityandwoundhealingrateweredecreasedseriously.conclusion:themetaboliclevelofemp pathwayinhep3bismuchhigherthannormalcel.apcoulddownregulatedhep3bcelempmetabolismlevel. LowmetabolismlevelsofEMPcouldinhibittheproliferationandmigrationofHep3Bviadown regulationofemt progresandaktsignalingpathway.whenhep3bwasco treatedwithapand3 BrPA,thecelabilityand migrationabilityweredepresedmoreobviouslythanonlyap treatment.thesedatashow AP therapywas efectiveonlivercancercelhep3b. Keywords Algalpolysaccharides EMPPathway HepB3 Celproliferation Celmigration

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL

12 (autophagy),imagej,,, 3 [1-4] (self-eating) Transwelinvasion, 20μmol L -1 LY A549 [5] PI3K/AKT 24h,PBS, [6-8],, ml -1 ( ) 600μL ( )2017 57 5JournalofNanchangUniversity(MedicalSciences)2017,Vol.57No.5 11 LY294002, (, 330006) : LY294002 PI3K/AKT 0 10 15 20 25 30μmol L -1 LY294002(LY294002 ) A549,PBS CCK8 LY294002 A549 ; Westernblot