376 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 26 卷控的重要途径研究表明 CSCs 和 EMT 在甲状腺肿瘤中具有关联性 [2-3] [4] [5] 人群研究和体外研究都提示了 1,25 二羟维生素 D 3 的抗肿瘤作用然而 1,25 二羟维生素 D 3 对甲状腺 CSCs 的增殖以及 EMT

Size: px

Start display at page:

Download "376 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 26 卷控的重要途径研究表明 CSCs 和 EMT 在甲状腺肿瘤中具有关联性 [2-3] [4] [5] 人群研究和体外研究都提示了 1,25 二羟维生素 D 3 的抗肿瘤作用然而 1,25 二羟维生素 D 3 对甲状腺 CSCs 的增殖以及 EMT"

婉宏洪
5 years ago
Views:

1 第 26 卷第 5 期 2016 年 9 月江苏大学学报 ( 医学版 ) JournalofJiangsuUniversity(MedicineEdition) Vol.26 No.5 Sept ,25 二羟维生素 D 3 在甲状腺未分化癌肿瘤干细胞增殖和上皮细胞间质转化中的作用王丽, 彭雯, 陈小罗, 吴晨光 ( 江苏大学附属人民医院内分泌科, 江苏镇江 ) [ 摘要 ] 目的 : 研究 1,25 二羟维生素 D 3 在甲状腺未分化癌肿瘤干细胞 (cancerstemcels,cscs) 的增殖及上皮细胞间质转化 (epithelial mesenchymaltransition,emt) 中的作用方法 : 以甲状腺未分化癌细胞株 HTh74 为研究对象, 采用体外细胞增殖实验观察 1,25 二羟维生素 D 3 对野生型 HTh74 及其多柔比星耐药株的作用采用细胞球形成实验观察 1,25 二羟维生素 D 3 对甲状腺 CSCs 增殖能力的作用实时荧光定量 PCR 检测 HTh74 野生型细胞 HTh74 类 CSCs 以及 1,25 二羟维生素 D 3 干预后的 HTh74 类 CSCs 中 EMT 相关基因的表达结果 :1,25 二羟维生素 D 3 抑制 HTh74 野生型和多柔比星耐药株细胞的增殖, 并且对耐药株具有更明显的生长抑制作用 1,25 二羟维生素 D 3 抑制 HTh74 类 CSCs 的增殖, 并显著下调 HTh74 类 CSCs 中 EMT 相关基因 N 钙黏蛋白和 Slug 的表达 (P<0.05) E 钙黏蛋白在 HTh74 类 CSCs 中未检出结论 :1,25 二羟维生素 D 3 抑制甲状腺 CSCs 的增殖, 并抑制甲状腺 CSCs 的 EMT 过程 [ 关键词 ] 1,25 二羟维生素 D 3 ; 甲状腺癌 ; 肿瘤干细胞 ; 上皮细胞间质转化 [ 中图分类号 ] R736.1 [ 文献标志码 ] A [ 文章编号 ] (2016) DOI: /j.isn y Efectof1,25dihydroxyvitaminD 3 ontheproliferationandepithelial mesenchymal transitionincancerstem celsderivedfrom anaplasticthyroidcarcinoma WANGLi,PENGWen,CHENXiao luo,wuchen guang (DepartmentofEndocrinology,theAfiliatedPeople shospitalofjiangsuuniversity,zhenjiangjiangsu212001,china) [Abstract] Objective:Toinvestigatetheroleof1,25dihydroxyvitaminD 3 (calcitriol)intheprolifera tionandepithelial mesenchymaltransition(emt)ofcancerstemcels(cscs)derivedfromanaplasticthy roidcarcinoma.methods:humananaplasticthyroidcancercellinehth74anditsdoxorubicin resistant cellinewerechosenascelmodelsandcelviabilityasaywasusedtoevaluatethecelularproliferation. SphereformationasaywasutilizedtoexploretheefectofcalcitriolonthegrowthofCSCs.Quantitativere al timepcrwasusedtocomparethemrnaexpresionofemtrelatedgenesinthyroidcancerstem like celswithorwithoutcalcitrioltreatment.results:calcitriolinhibitedtheproliferationofwildtypehth74 anditsdoxorubicin resistantcelline,andtheanti proliferationefectwasmorepronouncedintheresistant celline.furthermore,calcitriolinhibitedthegrowthofcscsderivedfrom HTh74,down regulatedthe mrnaexpresionofn cadherinandslug,whichareemtrelatedgenes(p<0.05).conclusion:calcitri olinhibitedtheproliferationandemtofthyroidcscs. [Key words] 1,25 dihydroxyvitamin D 3 ; thyroid carcinoma; cancer stem cels; epithelial mesenchymaltransition 甲状腺未分化癌预后很差, 这可能与现有的治疗方案不能有效地杀灭甲状腺肿瘤干细胞 (cancer stemcels,cscs) 有关 [1] 上皮细胞间质转化(epi thelial mesenchymaltransition,emt) 是细胞干性调 [ 基金项目 ] 江苏省自然科学基金资助项目 (BK ); 江苏省 2014 年双创人才海外名校博士计划 ; 镇江市社会发展项目 (FZ ) [ 作者简介 ] 王丽 (1983 ), 女, 山西长治人, 主治医师 ; 吴晨光 ( 通讯作者 ), 主任医师, 硕士生导师,E mail:wcgzj1128@aliyun.com

2 376 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 26 卷控的重要途径研究表明 CSCs 和 EMT 在甲状腺肿瘤中具有关联性 [2-3] [4] [5] 人群研究和体外研究都提示了 1,25 二羟维生素 D 3 的抗肿瘤作用然而 1,25 二羟维生素 D 3 对甲状腺 CSCs 的增殖以及 EMT 的作用尚不明确本研究以甲状腺未分化癌细胞株为研究对象, 观察 1,25 二羟维生素 D 3 对甲状腺 CSCs 的增殖和 EMT 的作用, 旨在为根治甲状腺未分化癌提供潜在的靶点 1 材料和方法 1.1 主要材料人甲状腺未分化癌细胞株 HTh74 及其多柔比星耐药株由德国柏林洪堡大学夏洛特医学院 Mi chaelderwahl 教授惠赠 HTh74 的多柔比星耐药株由 Derwahl 教授实验室生成 [6] DMEM F12 培养基和胎牛血清 ( 美国 Gibco 公司 ); 多柔比星 1,25 二羟维生素 D 3 四甲基偶氮唑蓝 (MTT) 及吉姆萨染液 ( 美国 Sigma 公司 ); 碱性成纤维生长因子 (b fibroblastgrowthfactor,bfgf), 表皮细胞生长因子 (epidermalgrowthfactor,egf) B27( 美国 Invitrogen 公司 ); 反转录及实时定量 PCR 试剂盒 ( 日本 TaKaRa 公司 ) 1.2 方法细胞培养人甲状腺未分化癌细胞株 HTh74 及其耐药株贴壁生长在含 10% 胎牛血清的 DMEM 中, 置于 37,5% CO 2 培养箱中培养体外增殖实验收集对数期的 HTh74 和 HTh74 耐药株细胞, 每孔加入 200μL 细胞悬液, 个 / 孔接种于 96 孔板 37,5% CO 2 孵育 24h 后, 予无血清继续培养, 并加入不同浓度的 1,25 二羟维生素 D 3 (1,10,100nmol/L) 或其溶剂二甲基亚砜 (DMSO), 继续培养 24,48 或 72h 每孔加入 20μLMTT 溶液 (5mg/mL), 继续培养 4h 弃上清液, 每孔加入 150μLDMSO, 置于摇床上低速振荡 10min 应用酶联免疫检测仪于 492nm 处测量各孔光密度值每组设 6 个复孔, 重复 3 次溶剂组的细胞作为对照组, 细胞存活率设为 100% 细胞球形成实验将 HTh74 细胞 ( 个 /ml) 种植于无血清的 DMEM/F12( 体积比 1 1) 培养液中, 加入 B27(1 50 稀释 ) bfgf(20ng/ ml) 和 EGF(20ng/mL), 并加入 1,25 二羟维生素 D 3 (10nmol/L 和 100nmol/L) 或溶剂每 2~3d, 再次添加 B27 bfgf 和 EGF 5d 后, 计数肿瘤细胞球的数目, 并拍摄照片细胞球形成率 = 球形结构的数目 ( 长径 >30μm)/ 初始种植细胞的个数重复 4 次溶剂组的细胞作为对照组二次传代的甲状腺类 CSCs 为了建立二次传代的甲状腺 CSCs/ 祖细胞, 应用机械吹打和化学酶解的方法将 HTh74 肿瘤细胞球分解成单个细胞 [7-8], 并将的单个细胞 ( 命名为 HTh74 类 CSCs) 种植于 6cm 培养皿中, 予无血清 DMEM/F12 单层培养经 24h 的饥饿和贴壁后, 加入 B27 bf GF 和 EGF, 同时加入 1,25 二羟维生素 D 3 (10nmol/ L 或 100nmol/L) 或溶剂孵育 72h 后, 拍摄细胞照片, 收集细胞, 用作后续实验溶剂组的细胞作为对照组 PCR 检测维生素 D 受体 mrna PCR 检测维生素 D 受体 mrna 在 HTh74 HTh74 多柔比星耐药株及 HTh74 细胞球中的存在 β 肌动蛋白作为内参维生素 D 受体的引物序列 : 上游 5 CTGAC CCTGGAGACTTTGAC 3, 下游 5 TTCCTCTGCACT TCCTCATC 3 β 肌动蛋白的引物序列 : 上游 5 ACCAACTGGGACGACATGGAGAAA 3, 下游 5 TA GCACAGCCTGGATAGCAACGTA 实时荧光定量 PCR 检测 EMT 相关基因提取 HTh74 野生型细胞 HTh74 类 CSCs 以及经 100 nmol/l 的 1,25 二羟维生素 D 3 孵育 72h 的 HTh74 类 CSCs 的 RNA, 使用 TaKaRa 公司反转录试剂盒将 RNA 反转录为 cdna 实时定量 PCR 的反应条件 : 94 预变性 5min,94 变性 30s, 退火 30s,72 延伸 30s, 共 30 个循环, 最后 72 延伸 10min 各引物序列如下, E 钙黏蛋白 : 上游 5 TT GAAAGAGAAACAGGATGGCTG 3, 下游 5 TCAT TCTGATCGGTTACCGTGAT 3 ;N 钙黏蛋白 : 上游 5 CGAGCCGCCTGCGCTGCCAC 3, 下游 5 CGAGC CGCCTGCGCTGCCAC 3 ; 波形蛋白 : 上游 5 CCG AAAACACCCTGCAATCTTTC 3, 下游 5 CACATC GATTTGGACATGCTGT 3 ;Slug: 上游 5 ACAGCGA ACTGGACACACATAC 3, 下游 5 GTATCCGGAAA GAGGAGAGAGG 3 ;snail: 上游 5 TCTTTCCTCGT CAGGAAGC 3, 下游 5 ACTGAACCTGACCGTACA CTGCTGGAAGGTAAACTCTG 3 ;18srRNA( 对照 ): 上游 5 CTCAACACGGGAAACCTCAC 3, 下游 5 CGCTCCACCAACTAAGAACG 3 采用相对定量方法 (2 ΔΔCT ) 进行分析, 实验重复 3 次 1.3 统计学方法应用 SPSS20.0 统计软件, 计量资料以均数 ±

01, 与对照组 (100%) 比较图 2 不同浓度 1,25 二羟维生素 D 3 对 HTh74 及其多柔比星耐药株细胞存活率的影响图 1 维生素 D 受体 mrna 在 HTh74 细胞及细胞球中的表达 2.

3 第 5 期王丽, 等.1,25 二羟维生素 D 3 在甲状腺未分化癌肿瘤干细胞增殖和上皮细胞间质转化中的作用 377 标准差 ( x±s) 珋表示两组间比较采用 t 检验 ; 多组比较采用单因素方差分析, 组间两两比较采用 Bon feroni 法 P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 维生素 D 受体 mrna 在 HTh74 细胞及细胞球中的表达 PCR 结果显示,HTh74 HTh74 多柔比星耐药株以及 HTh74 细胞球中均有维生素 D 受体 mrna 的表达见图 1 a:p<0.05,b:p<0.01, 与对照组 (100%) 比较图 2 不同浓度 1,25 二羟维生素 D 3 对 HTh74 及其多柔比星耐药株细胞存活率的影响图 1 维生素 D 受体 mrna 在 HTh74 细胞及细胞球中的表达 2.2 1,25 二羟维生素 D 3 对 HTh74 及其多柔比星耐药株体外增殖能力的影响 1,25 二羟维生素 D 3 对 HTh74 及 HTh74 多柔比星耐药株体外增殖能力作用的结果如图 2 1,25 二羟维生素 D 3 显著抑制 HTh74 和 HTh74 耐药株的增殖, 且这种抑制作用呈现出剂量和时间的依赖性, 最大抑制作用出现于最大浓度 (100nmol/L) 和最长孵育时间 (72h) 与 HTh74 细胞比较,1,25 二羟维生素 D 3 对 HTh74 耐药株的生长抑制作用更加明显在 100nmol/L 的 1,25 二羟维生素 D 3 孵育 72 h 后, 与对照组相比,HTh74 细胞被抑制 13% (P< 0.05), 而 HTh74 多柔比星耐药株被抑制 36% (P< 0.01) 2.3 1,25 二羟维生素 D 3 对 HTh74 细胞球形成率的作用在 1,25 二羟维生素 D 3 共孵育 120h 后,HTh74 细胞球形成率显示出下降趋势, 并且在 100nmol/L 的 1,25 二羟维生素 D 3 作用下, 细胞球形成率的下降具有统计学意义 ( 图 3) 与此同时,1,25 二羟维生素 D 3 干预后细胞球的体积也在缩小 ( 图 4) 结果表明 1,25 二羟维生素 D 3 对 HTh74 细胞球的形成显示出了抑制作用 a:p<0.05, 与对照组比较图 3 不同浓度 1,25 二羟维生素 D 3 对 HTh74 细胞球形成率的影响图 4 不同浓度 1,25 二羟维生素 D 3 对 HTh74 细胞球体积的影响

4 378 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 26 卷 2.4 1,25 二羟维生素 D 3 诱导 HTh74 类 CSCs 的形态改变在 72h 孵育后, 经 1,25 二羟维生素 D 3 干预的 HTh74 类 CSCs 显示出扁平多边的形态, 并且贴壁更加紧密这种形态改变在 100nmol/L 干预组更加明显而对照组的细胞多为圆形, 折光性强, 贴壁不紧密 ( 图 5) 图 5 不同浓度 1,25 二羟维生素 D 3 对 HTh74 类 CSCs 形态的作用 2.5 1,25 二羟维生素 D 3 干预后 HTh74 类 CSCs 中 EMT 相关基因的表达实时定量 PCR 结果显示, 与野生型 HTh74 细胞相比,HTh74 类 CSCs 中 N 钙黏蛋白波形蛋白 Slug 和 snail 的 mrna 表达均显著上调将 HTh74 类 CSCs 与 100nmol/L 的 1,25 二羟维生素 D 3 共孵育 72h 后, 与未干预的类 CSCs 相比, 干预后的类 CSCs 中 N 钙黏蛋白波形蛋白和 Slug 的 mrna 表达均有不同程度下调, 其中 N 钙黏蛋白和 Slug 的下调具有统计学意义 Snail 在干预组类 CSCs 及未干预组类 CSCs 中的表达差异无统计学意义 ( 图 6) E 钙黏蛋白在 3 组细胞中均未检出 a:p<0.05,b:p<0.01;1: 野生型 HTh74 细胞 ;2:HTh74 类 CSCs;3:HTh74 类 CSCs+100nmol/L 的 1,25 二羟维生素 D 3 图 6 实时定量 PCR 分析 HTh74 类 CSCs 中 EMT 相关基因的表达 3 讨论本研究中, 我们首先证实了维生素 D 受体 mr NA 在 HTh74 野生型细胞,HTh74 多柔比星耐药株以及 HTh74 细胞球中均有表达, 说明 1,25 二羟维生素 D 3 可能通过维生素 D 受体对上述细胞起作用在比较 1,25 二羟维生素 D 3 对野生型和耐药株细胞存活率的作用时,1,25 二羟维生素 D 3 对耐药株的最大抗增殖作用几乎是野生型的 3 倍 (36% 与 13%), 而耐药株中有 70% ~80% 的细胞是 CSCs 及其祖细胞 [6,9] 这一结果提示 CSCs 及其祖细胞可能比野生型细胞对 1,25 二羟维生素 D 3 更加敏感细胞球形成实验表明,1,25 二羟维生素 D 3 干预后, HTh74 细胞球形成率显著下降, 同时细胞球的体积减小, 提示 CSCs 的子细胞的数目减少这一结果与文献报道的 1,25 二羟维生素 D 3 抑制前列腺来源的干细胞 / 祖细胞或者间质多能细胞的结果相一致 [10-11] 在结肠乳腺前列腺等癌细胞中,1,25 二羟维生素 D 3 可以诱导或增强肿瘤治疗中的促分化作用 [12] 而促分化作用和 EMT 过程密切相关本实验显示,1,25 二羟维生素 D 3 干预 HTh74 类 CSCs 后, 干预组的部分细胞呈现出分化上皮样细胞的形态特征, 而干预组类 CSCs 中 N 钙黏蛋白波形蛋白和 Slug 的 mrna 表达不同程度下调, 其中 N 钙黏蛋白和 Slug 的下调具有统计学意义 EMT 的标志事件是 E 钙黏蛋白的消失,N 钙黏蛋白和波形蛋白的出现而 Slug 和 Snail 是 EMT 过程中重要的转录因子在甲状腺癌中,EMT 和 CSCs 细胞分化是紧密相连的 [2,13] 干预后的类 CSCs 中 N 钙黏蛋白,

5 第 5 期王丽, 等.1,25 二羟维生素 D 3 在甲状腺未分化癌肿瘤干细胞增殖和上皮细胞间质转化中的作用 379 波形蛋白和 Slug 的下调表明,1,25 二羟维生素 D 3 抑制了 EMT 过程, 这也解释了干预组类 CSCs 的形态呈现出分化上皮细胞的特征有文献报道,1,25 二羟维生素 D 3 也促进了间质干细胞的成骨及脂肪干细胞的分化过程 [14-15] 在结肠癌细胞,1,25 二羟维生素 D 3 则通过对肿瘤生长因子的作用抑制 EMT 过程 [16] 在我们的研究中,1,25 二羟维生素 D 3 的抗肿瘤作用及抗 CSCs 作用都呈现出了剂量依赖性如果考虑临床应用, 大剂量维生素 D 对钙代谢的干扰不容忽视因此, 对临床应用而言, 需要开发具有抗肿瘤活性却不干扰钙代谢的维生素 D 复合物此外, 一些临床前期研究已经证实,1,25 二羟维生素 D 3 可以增强一些细胞毒性药物的抗肿瘤能力 [17], 这些也提示了维生素 D 在抗肿瘤中的潜在应用综上所述, 本研究显示 1,25 二羟维生素 D 3 抑制了 CSCs 的增殖和肿瘤细胞球的形成, 提示 1,25 二羟维生素 D 3 具有抗甲状腺 CSCs 的作用同时, 1,25 二羟维生素 D 3 可以抑制甲状腺类 CSCs 的 EMT 的转化, 抑制甲状腺肿瘤细胞的干性而 EMT 和 CSCs 的关联提示我们,EMT 过程或许可以作为维生素 D 抗甲状腺 CSCs 的潜在靶点, 提高未分化型甲状腺癌的临床疗效, 改善患者预后 [ 参考文献 ] [1] JordanCT,GuzmanML,NobleM.Cancerstem cels [J].NEnglJMed,2006,355(12): [2] LanL,LuoY,CuiD,etal.Epithelial mesenchymal transitiontriggerscancerstem celgenerationinhuman thyroidcancercels[j].intjoncol,2013,43(1): [3] MaR,MinskyN,MorshedSA,etal.Stemnesinhu manthyroidcancersandderivedcellines:theroleofa symmetricalydividing cancerstem celsresistantto chemotherapy[j].jclinendocrinolmetab,2014,99 (3):E400-E409. [4] StepienT,KrupinskiR,SopinskiJ,etal.Decreased 1 25 dihydroxyvitamin D 3 concentration in peripheral bloodserum ofpatientswiththyroidcancer[j].arch MedRes,2010,41(3): [5] BennetRG,WakeleySE,HamelFG,etal.Geneex presionofvitamindmetabolicenzymesatbaselineand inresponsetovitamindtreatmentinthyroidcancercel lines[j].oncology,2012,83(5): [6] ZhengX,CuiD,XuS,etal.Doxorubicinfailstoerad icatecancerstem celsderivedfrom anaplasticthyroid carcinomacels:characterizationofresistantcels[j]. IntJOncol,2010,37(2): [7] LanL,CuiD,NowkaK,etal.Stemcelsderivedfrom goitersinadultsform spheresinresponsetointense growthstimulationandrequirethyrotropinfordiferentia tionintothyrocytes[j]. JClin EndocrinolMetab, 2007,92(9): [8] XuS,ChenG,PengW,etal.Oestrogenactiononthy roidprogenitorcels:relevantforthepathogenesisof thyroidnodules?[j].jendocrinol,2013,218(1): [9] DerwahlM.Linkingstemcelstothyroidcancer[J].J ClinEndocrinolMetab,2011,96(3): [10] MaundSL,BarclayWW,HoverLD,etal.Interleukin 1α mediatestheantiproliferativeefectsof1,25 di hydroxyvitamin D 3 in prostate progenitor/stem cels [J].CancerRes,2011,71(15): [11] Artaza JN, Sirad F, FeriniMG, etal. 1,25 (OH) 2 vitamind 3 inhibitscelproliferationbypromoting celcyclearestwithoutinducingapoptosisandmodifies celmorphologyofmesenchymalmultipotentcels[j].j SteroidBiochemMolBiol,2010,119(1/2): [12] GocekE,StudzinskiGP.VitaminDanddiferentiation incancer[j].critrevclinlabsci,2009,46(4): [13] 郑帅, 王晓东, 崔岱, 等. 甲状腺未分化癌耐药和转移中肿瘤干细胞和上皮细胞间质的转化作用 [J]. 南京医科大学学报 : 自然科学版,2014,34(12): [14] SongI,KimBS,KimCS,etal.EfectsofBMP 2and vitamind 3 ontheosteogenicdiferentiationofadipose stemcels[j].biochem BiophysResCommun,2011, 408(1): [15] FengY,SunY,JiaW,etal.Platelet richplasmaand 1,25(OH) 2 vitamind 3 synergisticalystimulateosteo genicdiferentiationofadulthumanmesenchymalstem cels[j].biotechnollet,2010,32(5): [16] ChenS,ZhuJ,ZuoS,etal.1,25(OH) 2 D 3 atenuates TGF β1/β2 inducedincreasedmigrationandinvasion viainhibitingepithelial mesenchymaltransitionincolon cancercels[j]. Biochem BiophysResCommun, 2015,468(1/2): [17] TrumpDL,DeebKK,JohnsonCS.VitaminD:consid erationsinthecontinueddevelopmentasanagentfor cancerpreventionandtherapy[j].cancerj,2010,16 (1):1-9. [ 收稿日期 ] [ 编辑 ] 何承志

, Vol.34, No.21 nm nm nm nm μm μm μm a b c d e

2013, Vol.34, No.21 359 Abstract Key words TS201.2 A 360 2013, Vol.34, No.21 nm nm nm nm μm μm μm a b c d e 2013, Vol.34, No.21 361 362 2013, Vol.34, No.21 ph ph 2013, Vol.34, No.21 363 () (1) (2) (SiO

376 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 26 卷 控的重要途径 研究表明 CSCs 和 EMT 在甲状腺肿瘤中具有关联性 [2-3] [4] [5] 人群研究和体外研究都提示了 1,25 二羟维生素 D 3 的抗肿瘤作用 然而 1,25 二羟维生素 D 3 对甲状腺 CSCs 的增殖以及 EMT

376 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 26 卷控的重要途径研究表明 CSCs 和 EMT 在甲状腺肿瘤中具有关联性 [2-3] [4] [5] 人群研究和体外研究都提示了 1,25 二羟维生素 D 3 的抗肿瘤作用然而 1,25 二羟维生素 D 3 对甲状腺 CSCs 的增殖以及 EMT