实验一 氨基酸的分离鉴定—纸层析法

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1 生 物 化 学 实 验 讲 义 内 蒙 古 科 技 大 学 生 物 与 化 学 工 程 学 院 基 础 生 物 教 学 部 2010 年 1 月

2 目 录 实 验 一 氨 基 酸 的 分 离 鉴 定 纸 层 析 法 2 实 验 二 琼 脂 糖 电 泳 法 分 离 DNA...3 实 验 三 乳 中 酪 蛋 白 的 分 离.5 实 验 四 3,5 二 硝 基 水 杨 酸 法 测 定 还 原 糖.6 实 验 五 蛋 白 质 等 电 点 测 定 和 沉 淀 反 应.8 实 验 六 蛋 白 质 的 定 量 测 定...11 实 验 七 多 酚 氧 化 酶 的 制 备 和 化 学 性 质...12 实 验 八 影 响 多 酚 氧 化 酶 作 用 的 各 种 因 素...14 实 验 九 醋 酸 纤 维 薄 膜 电 泳 分 离 核 苷 酸...16 实 验 十 维 生 素 C 的 定 量 测 定...18 实 验 十 一 SDS 凝 胶 电 泳 法 测 定 分 子 量 20 附 录 一 生 物 化 学 实 验 室 规 则...23 附 录 二 实 验 室 安 全 及 防 护 知 识

3 实 验 一 氨 基 酸 的 分 离 鉴 定 纸 层 析 法 一 实 验 目 的 1. 学 习 纸 层 析 法 的 基 本 原 理 和 操 作 技 术 2. 掌 握 氨 基 酸 Rf 值 的 计 算 方 法 3. 掌 握 通 过 已 知 氨 基 酸 对 未 知 氨 基 酸 和 未 知 混 合 氨 基 酸 组 分 进 行 鉴 定 二 实 验 原 理 层 析 法 又 称 色 层 分 析 法, 根 据 支 持 物 的 不 同 分 为 吸 附 层 析 离 子 交 换 层 析 分 配 层 析 纸 层 析 是 常 用 的 经 典 的 分 配 层 析 技 术, 支 持 物 是 滤 纸, 固 定 相 是 水, 流 动 相 为 有 机 溶 剂 将 样 品 点 在 滤 纸 上 ( 这 点 称 为 原 点 ), 用 扩 展 剂 进 行 展 层 时, 样 品 中 各 种 的 溶 质 即 在 两 相 溶 剂 中 不 断 的 进 行 分 配, 由 于 个 溶 质 在 两 相 溶 剂 中 的 分 配 系 数 a(a= 溶 质 在 流 动 相 中 的 溶 解 度 / 溶 质 在 固 定 相 中 的 溶 解 度 ) 不 同, 因 而 不 同 溶 质 随 流 动 相 移 动 的 速 率 不 等, 从 而 将 其 分 离 开 来 行 程 距 离 不 等 的 层 析 点 溶 质 在 滤 纸 上 的 位 置 可 用 比 移 值 (Rf) 表 示 : Rf= 原 点 到 层 析 点 中 心 的 距 离 / 原 点 到 扩 展 剂 前 沿 的 距 离 对 同 一 溶 质 来 说, 层 析 条 件 不 变 Rf 是 一 常 数, 所 以 可 以 利 用 溶 质 的 Rf 值 做 出 定 性 分 析 根 据 Rf 值 可 以 用 已 知 氨 基 酸 鉴 别 未 知 氨 基 酸 和 混 合 氨 基 酸 的 组 分 三 实 验 材 料 试 剂 和 仪 器 1. 材 料 试 剂 (1) 扩 展 剂 将 20ml 正 丁 醇 和 5ml 冰 醋 酸 放 入 分 液 漏 斗 中, 与 15ml 水 混 合, 充 分 震 荡, 静 置 后 分 层, 放 出 下 层 水 层 将 漏 斗 内 的 扩 展 液 放 入 磨 口 瓶 中 备 用 (2) 氨 基 酸 溶 液 :0.5% 赖 氨 酸 ;0.5% 脯 氨 酸 ;0.5% 缬 氨 酸 ; 赖 氨 酸 缬 氨 酸 脯 氨 酸 混 合 溶 液 各 组 分 的 浓 度 均 为 0.5% (3) 显 色 剂 :0.1% 水 和 印 三 酮 正 丁 醇 溶 液 2. 仪 器 : 培 养 皿 ; 滤 纸 ; 表 面 皿 ; 毛 细 管 ; 喷 雾 器 四 操 作 步 骤 1. 取 直 径 12.5cm 圆 形 滤 纸 一 张, 用 铅 笔 过 圆 心 作 两 条 相 互 垂 直 的 线, 在 每 条 线 上 距 圆 心 0.5cm 处 做 标 记 ( 画 一 个 点 ) 并 分 别 在 其 边 缘 上 标 上 赖 脯 缬 混 等 字 样 2. 用 毛 细 管 分 别 蘸 取 测 定 液 各 一 滴, 在 滤 纸 的 样 应 点 样 等 一 次 点 样 干 了 之 后 再 点 一 次, 重 复 2 3 次, 点 样 直 径 不 超 过 3mm 3. 用 小 枪 头 或 其 它 在 滤 纸 圆 心 扎 一 小 孔, 另 取 滤 纸 将 其 卷 成 筒 状, 捻 紧 如 灯 芯, 底 部 用 剪 刀 剪 成 碎 条 状, 从 滤 纸 的 点 样 背 面 插 入 小 孔, 突 出 滤 纸 面 约 0.5cm 4. 在 表 面 皿 中 加 入 约 3ml 扩 展 液, 再 将 其 放 入 培 养 皿 正 中, 将 滤 纸 平 放 在 培 养 皿 上, 使 滤 纸 芯 浸 入 到 扩 展 液 中, 盖 上 培 养 皿, 待 扩 展 剂 距 边 缘 1cm 时, 即 可 取 出 停 止 层 析 用 铅 笔 画 出 扩 展 液 前 沿 后, 吹 干 或 烘 干 5. 将 滤 纸 平 放 在 表 面 皿 上, 喷 雾 0.1% 水 和 印 三 酮 正 丁 醇 溶 液 再 吹 干 或 烘 干, 观 察 层 析 出 现 的 弧 形 紫 色 斑 用 铅 笔 标 出 原 点 到 层 析 点 中 心 的 距 离 和 到 扩 展 液 前 沿 的 距 离, 计 算 Rf 值 2

4 实 验 二 琼 脂 糖 电 泳 法 分 离 DNA 一 实 验 目 的 1. 掌 握 琼 脂 糖 电 泳 分 离 DNA 的 基 本 原 理 2. 掌 握 电 泳 的 基 本 操 作 和 琼 脂 糖 电 泳 在 分 离 和 鉴 定 DNA 片 段 上 的 应 用 二 实 验 原 理 琼 脂 糖 电 泳 是 分 离 鉴 定 和 纯 化 DNA 片 段 的 主 要 方 法, 该 技 术 操 作 简 便 快 捷, 且 可 直 接 用 溴 化 已 啶 进 行 染 色, 确 定 DNA 在 凝 胶 中 的 位 置 在 紫 外 灯 下 观 察 DNA 条 带,DNA 的 检 出 范 围 为 1 10ng 琼 脂 糖 是 从 海 藻 中 提 取 出 来 的 一 种 现 状 高 聚 物, 加 热 至 90 左 右 时, 即 可 形 成 清 亮 透 明 的 液 体, 灌 在 模 板 上 冷 却 后 固 化 形 成 凝 胶, 使 用 不 同 浓 度 的 琼 脂 糖 可 以 制 成 各 种 不 同 分 辨 率 能 力 的 凝 胶, 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 对 DNA 的 分 离 作 用 主 要 是 依 据 它 们 的 分 子 大 小 和 分 子 形 状 同 时 与 凝 胶 浓 度 也 有 密 切 关 系, 不 同 浓 度 的 琼 脂 糖 凝 胶 适 宜 分 离 的 DNA 片 段 见 下 表 核 酸 分 子 带 负 电, 在 电 场 作 用 下 DNA 分 子 由 负 极 向 正 极 移 动, 在 一 定 浓 度 的 凝 胶 中 较 小 的 DNA 片 段 迁 移 的 速 度 比 较 大 片 段 快 DNA 片 段 迁 移 距 离 与 其 分 子 量 对 数 成 反 比 因 此 通 过 已 知 大 小 的 标 准 物 质 的 迁 移 距 离 与 未 知 的 片 段 迁 移 距 离 进 行 比 较, 便 可 测 出 未 知 片 段 的 大 小 不 同 构 型 的 DNA 在 琼 脂 糖 凝 胶 中 的 电 泳 速 度 差 别 较 大, 其 共 价 闭 环 DNA> 线 状 DNA > 开 环 的 双 链 环 形 DNA 除 凝 胶 浓 度 外, 电 压 大 小 缓 冲 液 组 成 及 离 子 浓 度 也 影 响 DNA 分 子 的 迁 移 速 度 和 电 泳 分 辨 率 琼 脂 糖 凝 胶 浓 度 (%) 可 分 辨 的 线 性 DNA(kb) 三 实 验 材 料 试 剂 和 仪 器 1. 材 料 试 剂 (1) 琼 脂 糖 (2) 电 泳 缓 冲 液 ( 储 存 液 )5*TBE: 每 1000ml 含 54gTris;27.5g 硼 酸 ;20ml0.5M 的 EDTA(pH8.0) (3) 电 泳 工 作 液 :0.5*TBE (4) 上 样 缓 冲 液 :0.25% 溴 酚 兰 和 40% 蔗 糖 水 溶 液 (5) 样 品 DNA 2. 仪 器 : 电 泳 仪 和 水 平 电 泳 槽 ; 紫 外 投 射 发 射 分 析 仪 ; 胶 带 纸 ; 微 波 炉 四 操 作 步 骤 1. 用 胶 带 将 干 净, 干 燥 的 制 胶 板 两 端 开 口 封 好, 在 制 胶 板 里 放 置 好 梳 子 并 把 电 泳 槽 水 平 放 在 工 作 台 上 2. 用 0.5TBE 电 泳 缓 冲 液 配 制 0.8% 琼 脂 糖 溶 液, 冷 却 至 大 约 60, 倒 入 制 胶 板 中, 胶 的 厚 度 约 为 3 5mm, 倒 胶 时 要 避 免 产 生 气 泡, 若 有 气 泡 立 即 用 滴 定 管 在 胶 尚 未 凝 固 时 吸 去 3. 待 胶 凝 固 后, 小 心 移 去 梳 子 和 胶 带, 将 制 胶 板 连 同 凝 固 的 琼 脂 糖 胶 放 入 电 泳 槽 3

5 中 4. 加 入 电 泳 缓 冲 液, 使 液 面 高 出 胶 面 约 1 2mm 5. 将 样 品 与 缓 冲 液 按 5:1 混 合, 对 每 个 上 样 孔 取 样 品 5ul 加 入 1ul 上 样 缓 冲 液 混 合 后 全 部 加 入 即 可 注 样 品 孔 应 处 于 负 极 端 6. 盖 上 电 泳 槽 盖 子, 打 开 电 泳 仪 开 关, 调 节 输 入 电 压 为 5 10 伏 / 厘 米 7. 电 泳 完 毕 后, 切 断 电 源, 取 出 凝 胶 放 入 EB 液 中 染 色 20min. 用 清 水 漂 洗 后, 在 紫 外 灯 下 观 察 结 果 4

6 实 验 三 乳 中 酪 蛋 白 的 分 离 一 实 验 目 的 掌 握 从 乳 中 制 备 酪 蛋 白 的 原 理 和 方 法 二 实 验 原 理 酪 蛋 白 是 乳 中 存 在 的 主 要 蛋 白 质, 含 量 约 为 35g/l, 酪 蛋 白 不 是 一 中 简 单 的 蛋 白 质, 而 是 一 些 含 磷 蛋 白 质 的 混 合 物 在 某 一 ph 值 下, 氨 基 酸 分 子 所 带 正 负 电 荷 相 等, 本 身 呈 电 中 性 这 时 溶 液 的 ph 值 称 为 氨 基 酸 的 等 电 点 氨 基 酸 在 其 等 电 点 时 溶 解 度 最 小, 易 发 生 沉 淀 利 用 这 一 性 质 将 牛 乳 ph 值 调 到 4.8, 酪 蛋 白 即 可 沉 淀 出 来, 酪 蛋 白 也 不 溶 于 乙 醇, 利 用 这 一 性 质 可 以 从 酪 蛋 白 粗 制 品 中 去 掉 不 需 要 的 脂 类 物 质 三 实 验 材 料 试 剂 和 仪 器 1. 材 料 仪 器 牛 乳 ;100 温 度 计 ; 细 布 ; 布 氏 漏 斗 和 滤 纸 ; 烧 杯 ; 量 筒 ; 玻 璃 漏 斗 ; 电 炉 ; 抽 滤 瓶 ;ph 试 纸 2. 试 剂 醋 酸 钠 缓 冲 液 (0.2N,Ph4.6);95% 乙 醇 ; 乙 醚 ; 乙 醚 : 乙 醇 =1:1 四 操 作 步 骤 1. 把 100ml 牛 乳 放 入 一 个 500ml 烧 杯 中, 并 加 热 至 40 在 搅 拌 下 慢 慢 加 入 100ml 40 的 醋 酸 钠 缓 冲 液 2. 混 合 液 的 最 终 ph 应 为 4.8, 可 用 ph 计 校 正 3. 将 上 面 悬 浮 液 冷 却 至 室 温, 然 后 放 置 5min, 用 细 布 或 纱 布 过 滤 4. 所 得 沉 淀 用 少 量 水 洗 几 次, 然 后 悬 浮 于 大 约 30ml 乙 醇 中 5. 将 上 述 悬 浮 液 倾 入 布 氏 漏 斗 中 过 滤, 然 后 用 等 体 积 的 乙 醇 和 乙 醚 混 合 液 洗 两 次 6. 最 后, 用 50ml 乙 醚 洗 沉 淀 并 抽 干 7. 将 沉 淀 从 布 氏 漏 斗 中 移 去, 摊 开 在 表 面 皿 上 待 乙 醚 挥 发 即 得 酪 蛋 白 纯 品 四 计 算 算 出 每 百 毫 升 牛 乳 中 酪 蛋 白 的 含 量 (%) 若 以 3.5% 为 理 论 产 量, 算 出 回 收 率 (%) 5

7 实 验 四 3,5 二 硝 基 水 杨 酸 法 测 定 还 原 糖 一 实 验 目 的 1. 掌 握 还 原 糖 定 量 测 定 的 原 理 和 方 法 2. 掌 握 分 光 光 度 计 的 使 用 二 实 验 原 理 还 原 糖 的 测 定 是 糖 的 定 量 测 定 的 基 本 方 法 还 原 糖 是 指 含 有 自 由 醛 基 和 酮 基 的 糖 类 单 糖 均 为 还 原 性 糖, 双 糖 不 一 定 是 还 原 性 糖 其 中 乳 糖 和 麦 芽 糖 为 还 原 性 糖, 蔗 糖 和 淀 粉 为 非 还 原 性 糖 利 用 糖 的 溶 解 度 不 同, 可 将 样 品 中 的 单 糖 双 糖 多 糖 分 别 提 取 出 来, 对 没 有 还 原 性 的 双 糖 和 多 糖, 可 用 酸 水 解 法 使 其 降 解 成 有 还 原 性 的 单 糖 进 行 测 定 再 分 别 求 出 样 品 中 还 原 糖 和 总 糖 的 含 量 还 原 糖 在 碱 性 条 件 下 加 热 被 氧 化 成 糖 酸 及 产 物,3,5 二 硝 基 水 杨 酸 则 被 还 原 为 棕 红 色 的 3 氨 基 5 硝 基 水 杨 酸 在 一 定 范 围 内, 还 原 糖 的 量 与 棕 红 色 物 质 颜 色 的 深 浅 成 正 比 关 系, 利 用 分 光 光 度 计 在 540nm 波 长 下 测 定 光 密 度 值 查 对 标 准 曲 线 并 计 算, 便 可 求 出 样 品 中 还 原 糖 和 总 糖 的 含 量 三 实 验 材 料 试 剂 和 仪 器 1. 材 料 仪 器 小 麦 面 粉 ;ph 试 纸 ; 容 量 瓶 ; 玻 璃 漏 斗 ; 移 液 管 ; 量 筒 ; 试 管 ; 恒 温 水 浴 锅 ; 沸 水 浴 锅 2. 试 剂 (1)6mol/l HCl 和 6mol/l NaOH 溶 液 各 100ml; (2) 碘 碘 化 钾 溶 液 : 称 取 5g 碘 和 10g 碘 化 钾, 溶 于 100ml 蒸 馏 水 中 (3)1mg/ml 葡 萄 糖 溶 液 准 确 称 取 80 烘 干 恒 重 的 分 析 纯 葡 萄 糖 100g, 置 于 小 烧 杯 中 加 入 少 量 蒸 馏 水 溶 解 后, 移 到 100ml 容 量 瓶 中, 用 蒸 馏 水 定 溶 至 100ml, 混 匀,4 冰 箱 中 保 存 备 用 (4)3,5 二 硝 基 水 杨 酸 把 6.3g3,5 二 硝 基 水 杨 酸 溶 于 262ml 2 mol/l 的 氢 氧 化 钠 中 将 此 溶 液 与 500ml 含 有 182g 酒 石 酸 钾 钠 的 热 水 混 合, 向 该 溶 液 中 加 入 5g 重 蒸 酚 和 5g 亚 硫 酸 钠, 充 分 搅 拌 溶 解 待 溶 液 冷 却 后, 用 水 稀 释 到 1000ml, 存 储 于 棕 色 瓶 中 四 操 作 步 骤 ( 一 ) 葡 萄 糖 标 准 曲 线 的 绘 制 1. 按 下 表 制 备 9 个 管 管 号 葡 萄 糖 存 储 液 (1mg/ml)ml 水 ml 葡 萄 糖 最 终 浓 度 (ug/ml) 向 九 支 试 管 中 分 别 加 入 0.5mlDNS 试 剂, 充 分 混 合 6

8 3. 将 九 支 试 管 放 入 沸 水 浴 中 加 热 煮 沸 5min 4. 将 试 管 放 入 盛 有 冷 水 的 烧 杯 中 冷 却 5. 向 试 管 中 分 别 加 入 4ml 蒸 馏 水, 充 分 混 合 6. 以 空 白 试 管 试 管 作 对 照, 于 540nm 波 长 下, 分 别 测 定 各 管 OD 值 并 记 录 7. 以 每 管 的 吸 收 值 即 OD 值 为 纵 坐 标, 相 对 应 管 的 葡 萄 糖 浓 度 为 横 坐 标 作 图, 得 到 一 条 直 线, 该 直 线 通 过 零 点 ( 二 ) 还 原 糖 抽 提 液 的 制 备 1. 称 取 2g 小 麦 粉, 把 它 放 入 一 个 100ml 的 烧 杯 中, 然 后 加 入 50 60ml 蒸 馏 水, 搅 拌 均 匀 2. 把 烧 杯 放 入 一 个 50 水 浴 中 保 温 30min 3. 拿 出 烧 杯, 将 烧 杯 内 含 物 转 入 一 个 100ml 容 量 瓶 中, 加 水 至 刻 度, 充 分 混 匀, 过 滤 之,( 滤 出 液 用 于 测 定 还 原 糖 ) 即 得 还 原 糖 抽 提 液 ( 三 ) 样 品 的 酸 水 解 和 总 糖 抽 提 液 的 制 备 1. 把 1g 小 麦 粉 溶 于 15ml 水 中 并 加 入 10ml6N 的 盐 酸 溶 液 混 合 2. 将 烧 杯 放 入 沸 水 浴 中 加 热 煮 沸 30min 3. 拿 出 烧 杯, 冷 却 之 4. 加 入 6N 的 氢 氧 化 钠 中 和 烧 杯 内 含 物 5. 将 中 和 后 的 溶 液 转 入 一 个 100ml 的 容 量 瓶 中, 加 水 至 刻 度, 充 分 混 匀 6. 将 容 量 瓶 中 的 溶 液 过 滤 7. 取 1ml 滤 出 液 加 水 至 10ml, 即 得 总 糖 的 抽 提 液 ( 四 ) 小 麦 样 品 中 总 糖 和 还 原 糖 的 测 定 1. 取 五 支 试 管, 编 号 分 别 为 1 5 按 下 表 向 每 支 试 管 中 加 入 试 剂 2. 用 试 管 1 作 对 照, 测 定 每 管 在 540nm 下 的 OD 值, 将 结 果 记 录 表 中 试 剂 管 号 还 原 糖 抽 提 液 (ml) 总 糖 抽 提 液 (ml) DNS(ml) 水 (ml) OD 根 据 还 原 糖 和 总 糖 的 OD 值, 使 用 葡 萄 糖 的 标 准 工 作 曲 线, 计 算 还 原 糖 和 总 糖 的 百 分 含 量 : 即 : 还 原 糖 %= 从 曲 线 查 出 还 原 糖 浓 度 *N*100*2/ 样 品 重 mg 数 总 糖 %= 从 曲 线 中 查 出 总 糖 的 浓 度 mg/ml*n*100*0.9*2/ 样 品 重 mg 数 N: 稀 释 倍 数 注 : 由 于 多 糖 水 解 为 单 糖 时, 每 断 裂 一 个 糖 苷 键 需 加 入 一 个 水 分 子, 所 以 在 计 算 多 糖 含 量 时 应 乘 以 0.9 7

9 实 验 五 蛋 白 质 等 电 点 测 定 和 沉 淀 反 应 一 蛋 白 质 的 等 电 点 测 定 1. 实 验 目 的 (1) 了 解 蛋 白 质 的 两 性 解 离 性 质 (2) 学 习 测 定 蛋 白 质 等 电 点 的 一 种 方 法 2. 实 验 原 理 蛋 白 质 是 两 性 电 解 质 蛋 白 质 分 子 的 解 离 状 态 和 解 离 程 度 受 溶 液 酸 碱 度 的 影 响 当 溶 液 的 ph 达 到 一 定 数 值 时, 蛋 白 质 颗 粒 上 的 正 负 电 荷 的 数 目 相 等, 在 电 场 中, 蛋 白 质 既 不 向 阴 极 移 动 也 不 向 阳 极 移 动 此 时 溶 液 的 ph 称 为 此 种 蛋 白 质 的 等 电 点 不 同 蛋 白 质 各 有 其 特 异 的 等 电 点 在 等 电 点 时, 蛋 白 质 的 理 化 性 质 都 有 变 化, 可 利 用 此 种 性 质 的 变 化 测 定 各 种 蛋 白 质 的 等 电 点 最 常 用 的 方 法 是 测 定 其 溶 解 度 最 低 时 的 溶 液 的 ph 值 本 实 验 借 观 察 在 不 同 ph 溶 液 中 的 溶 解 度 以 测 定 酪 蛋 白 的 等 电 点 用 醋 酸 与 醋 酸 钠 ( 醋 酸 钠 混 合 在 酪 蛋 白 溶 液 中 ) 配 制 成 各 种 不 同 ph 值 的 缓 冲 液 向 诸 缓 冲 液 中 加 入 酪 蛋 白 后, 沉 淀 出 现 最 多 的 缓 冲 液 的 ph 值 即 为 酪 蛋 白 的 等 电 点 3. 实 验 材 料 试 剂 和 仪 器 (1) 材 料 仪 器 恒 温 水 浴 锅 ;200ml 锥 形 瓶 ;100ml 容 量 瓶 ; 移 液 管 ; 试 管 ; 试 管 架 ; 乳 钵 (2) 试 剂 0.4% 酪 蛋 白 醋 酸 溶 液 取 0.4g 酪 蛋 白, 加 少 量 水 在 乳 钵 中 仔 细 研 磨, 将 所 得 的 蛋 白 质 悬 浮 液 移 入 200ml 锥 形 瓶 中, 用 少 量 温 水 洗 涤 乳 钵, 将 洗 涤 液 也 移 入 锥 形 瓶 内 加 入 10ml 1mol/l 醋 酸 溶 液 把 锥 形 瓶 放 入 50 水 浴 中, 并 小 心 的 地 旋 转 锥 形 瓶, 直 到 酪 蛋 白 完 全 溶 解 为 止 将 锥 形 瓶 内 溶 液 全 部 移 至 100ml 容 量 瓶 内, 加 水 至 刻 度, 塞 紧 瓶 塞, 混 匀 1.0mol/l 醋 酸 溶 液 0.1mol/l 醋 酸 溶 液 0.01mol/l 醋 酸 溶 液 4. 操 作 步 骤 (1) 取 同 样 规 格 的 试 管 4 支, 按 下 表 顺 序 分 别 精 确 地 加 入 各 试 剂, 然 后 混 匀 试 管 号 蒸 馏 水 (ml) 0.01mol/l 醋 酸 0.1mol/l 醋 酸 1.0mol/l 醋 酸 (2) 向 以 上 试 管 中 加 入 酪 蛋 白 的 醋 酸 钠 溶 液 1ml, 加 一 管, 摇 匀 一 管 此 时 管 的 ph 值 依 次 为 观 察 其 浑 浊 度 静 置 10min 后, 再 观 察 其 浑 浊 度 最 浑 浊 的 一 管 的 ph 值 即 为 酪 蛋 白 的 等 电 点 二 蛋 白 质 的 沉 淀 和 变 形 1. 实 验 目 的 (1) 加 深 对 蛋 白 质 胶 体 溶 液 稳 定 因 素 的 认 识 (2) 了 解 沉 淀 蛋 白 质 的 几 种 方 法 及 其 实 用 意 义 (3) 了 解 蛋 白 质 变 性 和 沉 淀 的 关 系 2. 实 验 原 理 8

10 在 水 溶 液 中 蛋 白 质 分 子 由 于 表 面 生 成 水 化 层 和 双 电 层 而 成 为 稳 定 的 亲 水 胶 体 颗 粒, 在 一 定 的 理 化 因 素 影 响 下, 蛋 白 质 颗 粒 可 因 失 去 电 荷 和 脱 水 而 沉 淀 蛋 白 质 的 沉 淀 反 应 可 分 成 两 类 (1) 可 逆 的 沉 淀 反 应 : 此 时 蛋 白 质 的 分 子 结 构 尚 未 发 生 显 著 变 化, 除 去 引 起 沉 淀 的 因 素 后, 蛋 白 质 的 沉 淀 仍 能 溶 解 于 原 来 的 溶 剂 中, 并 保 持 其 天 然 性 质 而 不 变 性 如 大 多 数 蛋 白 质 的 盐 析 作 用 或 在 低 温 下 用 乙 醇 短 时 间 作 用 于 蛋 白 质 提 纯 蛋 白 质 时, 常 利 用 此 类 反 应 (2) 不 可 逆 的 沉 淀 反 应 : 此 时 蛋 白 质 分 子 内 部 结 构 发 生 重 大 改 变, 蛋 白 质 变 性 而 沉 淀, 不 在 溶 于 原 来 的 溶 剂 中 加 热 引 起 的 蛋 白 质 沉 淀 与 凝 固, 蛋 白 质 与 重 金 属 离 子 或 某 些 有 机 酸 的 反 应 都 属 此 类 蛋 白 质 变 性 后, 有 时 由 于 维 持 溶 液 的 稳 定 性 的 条 件 仍 然 存 在 ( 如 电 荷 ), 并 不 析 出 因 此 蛋 白 质 并 不 一 定 都 表 现 为 沉 淀, 而 沉 淀 的 蛋 白 质 也 未 必 都 变 性 3. 试 剂 与 材 料 (1) 蛋 白 质 溶 液 :5% 卵 清 蛋 白 溶 液 或 鸡 蛋 清 水 溶 液 ( 新 鲜 鸡 蛋 清 : 水 =1:9) (2)pH4.7 醋 酸 醋 酸 钠 的 缓 冲 溶 液 (3)3% 硝 酸 银 溶 液 (4)5% 三 氯 乙 酸 溶 液 (5)95% 乙 醇 (6) 饱 和 硫 酸 铵 溶 液 (7) 硫 酸 铵 结 晶 粉 末 (8)0.1mol/l HCl 溶 液 (9)0.1 mol/l 氢 氧 化 钠 溶 液 (10)0.1 mol/l 醋 酸 溶 液 (11) 甲 基 红 溶 液 (12)2% 氯 化 钡 溶 液 4. 操 作 方 法 (1) 蛋 白 质 的 盐 析 无 机 盐 ( 硫 酸 铵 硫 酸 钠 氯 化 钠 ) 浓 溶 液 能 析 出 蛋 白 质 盐 的 浓 度 不 同, 析 出 的 蛋 白 质 也 不 同 如 球 蛋 白 可 在 半 饱 和 硫 酸 铵 中 析 出, 而 清 蛋 白 则 在 饱 和 硫 酸 铵 溶 液 才 能 析 出 由 盐 析 获 得 的 蛋 白 质 沉 淀, 当 降 低 其 盐 类 浓 度 时, 又 能 再 溶 解, 故 蛋 白 质 的 盐 析 是 可 逆 的 加 5% 卵 清 蛋 白 溶 液 5ml 于 试 管 中, 再 加 等 量 的 饱 和 硫 酸 铵 溶 液, 混 合 后 静 置 数 分 钟 则 析 出 球 蛋 白 沉 淀 倒 出 少 量 浑 浊 溶 液, 加 少 量 水, 是 否 溶 解, 为 什 么? 将 管 内 容 物 过 滤, 向 管 中 添 加 硫 酸 铵 粉 末 到 不 再 溶 解 为 止, 此 时 析 出 的 沉 淀 为 清 蛋 白 取 出 部 分 清 蛋 白, 加 少 量 蒸 馏 水 观 察 沉 淀 再 溶 解 (2) 重 金 属 离 子 沉 淀 蛋 白 质 重 金 属 离 子 与 蛋 白 质 合 成 不 溶 于 水 的 复 合 物 取 一 支 试 管, 加 入 蛋 白 质 溶 液 2 毫 升, 再 加 3% 的 硝 酸 银 溶 液 1-2 滴, 振 荡 试 管, 有 沉 淀 产 生 放 置 片 刻, 倾 出 上 清 液, 向 沉 淀 中 加 入 少 量 水, 沉 淀 是 否 溶 解? 为 什 么? (3) 某 些 有 机 酸 沉 淀 蛋 白 质 取 一 支 试 管, 加 入 蛋 白 质 2 毫 升, 再 加 入 1 毫 升 三 氯 乙 酸 溶 液, 振 荡 试 管, 9

11 观 察 沉 淀 的 生 成 放 置 片 刻, 倾 出 上 清 液, 向 沉 淀 加 入 少 量 水 观 察 沉 淀 是 否 溶 解? (4) 有 机 溶 剂 沉 淀 蛋 白 质 取 一 支 试 管, 加 入 蛋 白 质 溶 液 2 毫 升, 再 加 入 2 毫 升 95% 乙 醇 混 匀, 观 察 沉 淀 的 生 成 (5) 乙 醇 引 起 的 变 性 与 沉 淀 取 三 支 试 管, 编 号 以 下 表 顺 序 加 入 试 剂 : 试 剂 ( 毫 升 ) 管 号 5% 卵 清 蛋 白 溶 液 0.1mol/l 氢 氧 化 钠 溶 液 0.1mol/l 盐 酸 溶 液 95% 乙 醇 ph4.7 的 缓 冲 溶 液 振 荡 摇 匀 后, 观 察 各 管 有 何 变 化 放 置 片 刻 向 各 管 中 加 入 8 毫 升 水, 然 后 再 2 3 管 中 个 加 一 滴 甲 基 红, 再 分 别 用 0.1mol/l 醋 酸 溶 液 及 0.1mol/l 碳 酸 钠 溶 液 中 和 之, 观 察 各 管 颜 色 的 变 化 和 沉 淀 的 生 成 每 管 再 加 0.1mol/l 盐 酸 溶 液 数 滴, 观 察 沉 淀 的 再 溶 解 解 释 各 管 发 生 的 全 部 现 象 10

12 实 验 六 蛋 白 质 的 定 量 测 定 一 实 验 目 的 学 习 双 缩 脲 法 测 定 蛋 白 质 含 量 的 原 理 和 方 法 二 实 验 原 理 含 两 个 或 两 个 以 上 肽 键 的 化 合 物 如 蛋 白 质 与 碱 性 硫 酸 铜 反 应 产 生 一 种 紫 红 色 的 化 合 物 颜 色 的 深 浅 与 蛋 白 质 中 所 含 的 肽 键 的 数 目 有 关 反 应 的 名 称 就 是 从 双 缩 脲 这 一 物 质 的 名 称 来 的 它 产 生 典 型 的 正 反 应 有 色 复 合 物 可 能 是 铜 离 子 和 四 个 氮 原 子 共 同 络 合 而 成 的 其 中 四 个 氮 原 子 是 由 两 条 肽 链 中 的 每 一 个 各 提 供 两 个 氮 原 子 构 成 的 双 缩 脲 反 应 对 任 何 蛋 白 质 的 测 定 都 是 适 合 的 其 缺 点 是 蛋 白 质 样 品 的 需 要 量 大 此 外, 双 缩 脲 反 应 对 肽 键 不 是 完 全 专 一 的, 因 而 含 有 一 个 氮 原 子 或 含 有 一 个 碳 原 子 相 连 接 的 两 个 羟 基 的 任 何 化 合 物 都 有 双 缩 脲 反 应 这 样, 用 双 缩 脲 法 测 定 蛋 白 质 的 含 量 尽 管 方 便 快 速 但 灵 敏 度 较 低 三 实 验 材 料 试 剂 和 仪 器 1. 材 料 仪 器 试 管 试 管 架 吸 量 管 分 光 光 度 计 2. 试 剂 (1) 标 准 酪 蛋 白 溶 液 (5mg/ml) 以 0.05 的 氢 氧 化 钠 制 备 (2) 双 缩 脲 试 剂 把 1.5 克 硫 酸 铜 和 6 克 酒 石 酸 钾 钠 溶 解 于 大 约 500 毫 升 热 水 中, 在 不 断 搅 拌 下 加 入 300 毫 升 新 鲜 制 备 的 无 水 碳 酸 盐 的 10% 的 氢 氧 化 钠 中, 最 后 加 水 到 1000 毫 升 此 溶 液 克 较 长 期 保 存, 如 发 现 有 微 红 色 或 黑 色 的 沉 淀 出 现, 不 应 再 用 (3) 卵 清 蛋 白 四 实 验 操 作 步 骤 ( 一 ) 酪 蛋 白 标 准 曲 线 的 制 备 试 管 号 标 准 酪 蛋 白 液 (ml) 水 (ml) 双 缩 脲 试 剂 (ml) 在 室 温 下 静 置 30 分 钟 546nmOD 值 测 每 管 的 吸 光 值 (OD), 以 OD 为 纵 坐 标, 酪 蛋 白 质 浓 度 为 横 坐 标 绘 制 标 准 曲 线 ( 二 ) 未 知 样 品 中 蛋 白 质 浓 度 的 测 定 1. 取 卵 清 蛋 白 8 克, 用 蒸 馏 水 定 容 到 100 毫 升 2. 取 2 支 试 管 分 别 加 入 1 毫 升 稀 释 蛋 白, 加 1 毫 升 蒸 馏 水 和 4 毫 升 双 缩 脲 试 剂, 混 合 均 匀, 室 温 放 置 30 分 钟 3. 从 标 准 曲 线 找 出 对 应 的 蛋 白 质 含 量 4. 计 算 卵 清 蛋 白 的 百 分 含 量 11

13 实 验 七 多 酚 氧 化 酶 的 制 备 和 化 学 性 质 一 实 验 目 的 1. 学 习 从 组 织 细 胞 中 制 备 酶 的 方 法 2. 掌 握 多 酚 氧 化 酶 的 作 用 和 化 学 性 质 二 实 验 原 理 多 酚 氧 化 酶 是 一 种 含 铜 的 酶, 其 最 适 ph 为 6-7 由 多 酚 氧 化 酶 催 化 的 氧 化 还 原 反 应 可 通 过 颜 色 的 变 化 鉴 定 之, 这 个 反 应 在 自 然 界 是 常 见 的 如 去 皮 的 土 豆 和 碰 破 的 水 果 变 成 褐 色 就 是 由 于 该 酶 作 用 的 结 果 多 酚 氧 化 酶 的 最 适 底 物 是 邻 苯 二 酚, 间 苯 二 酚 和 对 苯 二 酚 与 邻 苯 二 酚 的 结 构 相 似, 它 们 也 可 以 被 氧 化 成 各 种 有 色 化 合 物 三 实 验 材 料 试 剂 和 仪 器 1. 材 料 仪 器 土 豆, 匀 浆 机, 烧 杯, 纱 布, 试 管, 试 管 架, 恒 温 水 浴, 小 刀 2. 试 剂 (1)0.1mol/l 的 氟 化 钠 溶 液 (2)0.01mol/l 邻 苯 二 酚 溶 液 (3) 柠 檬 酸 缓 冲 液 ph4.8,0.05mol/l (4)0.01mol/l 间 苯 二 酚 溶 液 (5)0.01mol/l 对 苯 二 酚 溶 液 (6) 饱 和 的 硫 酸 铵 溶 液 四 实 验 操 作 步 骤 ( 一 ) 酶 抽 提 掖 的 制 备 1. 取 一 块 土 豆 洗 去 上 面 的 泥 土, 把 土 豆 切 成 小 块 2. 称 25 克 小 土 豆 快 放 入 匀 浆 机 中, 再 加 入 氟 化 钠 溶 液 25 毫 升 3. 在 匀 浆 器 中 匀 浆 30 秒 4. 把 匀 浆 物 通 过 几 层 纱 布 虑 入 一 个 100 毫 升 的 烧 杯 中 5. 加 等 体 积 的 饱 和 硫 酸 铵 溶 液, 混 合 后 于 4 放 置 30 分 钟 6. 在 4000 转 / 分 钟 下 离 心 15 分 钟 倒 掉 上 清 液 7. 将 沉 淀 物 用 大 约 15 毫 升 的 柠 檬 酸 缓 冲 液 溶 解, 即 得 该 酶 的 粗 制 品 ( 二 ) 多 酚 氧 化 酶 的 作 用 1. 将 三 支 干 净 的 试 管 编 号 按 下 面 要 求 制 备 各 管 管 1: 加 入 15 滴 酶 抽 提 液 和 15 滴 0.01mol/l 的 邻 苯 二 酚 溶 液 管 2: 加 入 15 滴 酶 抽 提 液 和 15 滴 水 混 合 均 匀 管 3: 加 入 15 滴 0.01 mol/l 的 邻 苯 二 酚 溶 液 和 15 滴 水 混 合 3. 将 三 支 试 管 放 于 37 水 浴 上 4. 每 隔 5 分 钟 振 荡 试 管 并 观 察 每 管 中 溶 液 的 颜 色 变 化, 记 录 反 应 颜 色 共 反 应 25 分 钟 12

14 反 应 时 间 ( 分 ) 管 1 管 2 管 ( 三 ) 多 酚 氧 化 酶 的 化 学 性 质 1. 取 三 支 试 管, 编 号 向 管 1 中 加 入 15 滴 酶 抽 提 液 和 15 滴 0.01mol/l 的 邻 苯 二 酚 溶 液, 振 荡 混 合 放 于 37 水 浴 中 10 分 钟 3. 向 管 2 中 加 入 10 滴 酶 抽 提 液 和 10 滴 5% 的 三 氯 乙 酸, 混 合 均 匀, 放 置 2 分 钟 加 入 10 滴 0.01mol/l 的 邻 苯 二 酚 溶 液 混 合 均 匀 放 于 37 水 浴 10 分 钟, 观 察 溶 液 的 颜 色 变 化 ( 四 ) 底 物 专 一 性 1. 取 3 支 试 管, 编 号 1,2,3 2. 向 3 支 试 管 中 分 别 加 入 15 滴 酶 抽 提 液 3. 按 下 面 的 要 求 加 入 试 剂, 向 管 1 中 加 入 15 滴 0.01mol/l 的 邻 苯 二 酚 溶 液 ; 向 管 2 中 加 入 15 滴 0.01mol/l 的 间 苯 二 酚 溶 液 ; 向 管 3 中 加 入 15 滴 0.01mol/l 对 苯 二 酚 溶 液 4. 混 合 各 试 管 中 溶 液, 把 管 放 于 37 水 浴 中 5. 以 5 分 钟 时 间 间 隔, 观 察 溶 液 的 颜 色 的 变 化, 其 保 温 10 分 钟 使 用 符 号 表 示 各 管 中 颜 色 的 深 浅, 即 表 示 酶 的 活 性 底 物 酶 活 性 5 分 钟 10 分 钟 邻 苯 二 酚 间 苯 二 酚 对 苯 二 酚 确 定 多 酚 氧 化 酶 的 最 适 底 物 是 那 一 个? 13

15 实 验 八 影 响 多 酚 氧 化 酶 作 用 的 各 种 因 素 一 实 验 目 的 学 习 不 同 因 素 对 于 酶 催 化 反 应 速 度 的 影 响 二 实 验 原 理 细 胞 环 境 中 各 种 因 素 直 接 影 响 酶 的 催 化 活 性 因 为 酶 是 蛋 白 催 化 剂 它 易 受 到 这 些 因 素 的 影 响, 例 如 : 温 度,pH, 底 物 浓 度, 酶 浓 度 要 测 定 这 些 因 素 对 于 酶 反 应 的 影 响 时, 应 通 过 一 系 列 实 验, 仅 在 被 研 究 的 因 素 是 变 化 的 情 况 下, 测 定 他 对 于 反 应 速 度 的 影 响, 而 其 它 的 试 验 条 件 应 保 持 一 致 三 实 验 材 料 试 剂 和 仪 器 1. 材 料 仪 器 试 管 试 管 架 恒 温 水 浴 吸 量 管 (2ml 5ml 10ml) 2. 试 剂 (1)0.01mol/l 的 邻 苯 二 酚 溶 液 (2) 多 酚 氧 化 酶 的 抽 提 液 (3)0.4% 的 盐 酸 溶 液 (4)0.5% 的 碳 酸 钠 溶 液 (5)0.1% 的 乳 酸 溶 液 (6)0.01% 碳 酸 钠 溶 液 四 实 验 操 作 步 骤 ( 一 ) 对 酚 氧 化 酶 的 制 备 ( 参 看 上 试 验 ) ( 二 ) 底 物 浓 度 1. 取 3 支 试 管, 编 号 向 试 管 1 中 加 入 0.1 号 升 0.01mol/l 的 邻 苯 二 酚 溶 液 和 3.9 毫 升 水, 混 合 3. 向 试 管 2 中 加 入 1.0 毫 升 0.01 mol/l 的 邻 苯 二 酚 溶 液 和 3 毫 升 水, 混 合 4. 向 3 支 试 管 中 吸 取 4 毫 升 0.01mol/l 邻 苯 二 酚 5. 向 3 支 试 管 中 分 别 加 入 0.5 毫 升 酶 抽 提 掖, 混 合 之 6. 把 三 支 试 管 放 于 37 水 浴 中 保 温 1 分 钟 观 察 溶 液 颜 色 的 变 化, 记 录 之 ( 三 ) 酶 浓 度 1. 取 2 支 试 管 编 号 1,2 2. 向 试 管 1 中 加 入 15 滴 0.01mol/l 邻 苯 二 酚 和 15 滴 酶 抽 提 掖, 混 合 之 3. 向 试 管 2 中 加 入 15 滴 0.01mol/l 邻 苯 二 酚 和 1 滴 酶 抽 提 掖,14 滴 水, 混 合 之 4. 把 2 支 试 管 放 于 37 水 浴 中 保 温 2 分 钟 观 察 每 管 中 溶 液 颜 色 的 变 化, 记 录 之 ( 四 ) 氢 离 子 浓 度 1. 取 5 支 试 管, 编 号 按 下 面 要 求 制 备 各 管 管 1: 加 入 2 毫 升 0.4% 的 盐 酸 管 2: 加 入 2 毫 升 0.1% 的 乳 酸 管 3: 加 入 2 毫 升 蒸 馏 水 管 4: 加 入 2 毫 升 0.01% 碳 酸 钠 溶 液 管 5: 加 入 2 毫 升 0.5% 碳 酸 钠 溶 液 每 管 的 ph 为 1,3,5,7,9 3. 向 5 支 试 管 中 分 别 加 入 15 滴 0.01mol/l 邻 苯 二 酚 溶 液 14

16 4. 向 5 支 试 管 中 分 别 加 入 15 滴 酶 抽 提 掖 5. 混 合 均 匀, 把 各 管 放 入 37 水 浴 中 保 温 5 分 钟 观 察 每 管 中 溶 液 的 颜 色 变 化 并 确 定 其 最 适 ph 值 15

17 实 验 九 醋 酸 纤 维 薄 膜 电 泳 分 离 核 苷 酸 一 实 验 目 的 学 习 核 糖 核 酸 碱 水 解 法 的 原 理 和 方 法, 掌 握 核 糖 核 苷 酸 的 醋 酸 纤 维 薄 膜 电 泳 的 原 理 和 方 法 二 实 验 原 理 RNA 在 稀 碱 条 件 下 水 解, 先 生 成 中 间 产 物 2,3 环 状 核 苷 酸, 进 一 步 水 解 得 到 2 和 3 核 苷 酸 的 混 合 物 在 ph3.5 时, 各 核 苷 酸 的 第 一 磷 酸 基 完 全 解 离, 第 二 磷 酸 基 和 烯 醇 基 不 解 离, 而 含 氮 环 的 解 离 差 别 很 大 因 此 在 ph3.5 条 件 下 进 行 电 泳 可 将 四 种 核 苷 酸 分 离 开 来 四 种 核 苷 酸 在 ph3.5 时 的 离 子 化 程 度 核 苷 酸 含 氮 环 的 pk 离 子 化 程 度 净 负 电 荷 AMP GMP CMP UMP 1.00 本 实 验 先 用 稀 氢 氧 化 钾 溶 液 将 RNA 水 解, 再 加 高 氯 酸 将 水 解 液 调 至 ph3.5, 同 时 生 成 高 氯 酸 钾 沉 淀 除 去 钾 离 子, 然 后 用 电 泳 分 离 水 解 液 中 各 核 苷 酸, 并 在 紫 外 灯 下 确 定 RNA 碱 水 解 液 的 电 泳 图 谱 三 实 验 材 料 试 剂 和 仪 器 1. 材 料 仪 器 1) 电 热 恒 温 水 浴 2) 紫 外 分 析 灯 3) 电 泳 仪 电 泳 槽 4) 离 心 机 5) 点 样 器 2. 试 剂 1)0.3 mol/l 氢 氧 化 钾 溶 液 2)200g/l 高 氯 酸 溶 液 3) 核 糖 核 酸 ( 粉 末 ) 4)0.02mol/lpH3.5 柠 檬 酸 溶 液 5) 醋 酸 纤 维 薄 膜 四 实 验 操 作 步 骤 1. RNA 的 碱 水 解 称 取 0.2 克 RNA, 溶 于 10 毫 升 0.3 mol/l 氢 氧 化 钾 溶 液 中, 使 RNA 浓 度 达 到 毫 克 / 毫 升 在 37 下 保 温 18 小 时 或 沸 水 浴 30 分 钟, 然 后 将 水 解 液 移 入 锥 形 瓶 中 在 冰 浴 中 用 高 氯 酸 溶 液 滴 定 到 水 解 液 的 ph 值 为 转 / 分 离 心 10 分 钟 除 去 沉 淀, 上 清 液 即 为 样 品 液 2. 点 样 将 醋 酸 纤 维 薄 膜 在 ph3.5,0.02 mol/l 柠 檬 酸 缓 冲 溶 液 中 浸 湿 后, 用 滤 纸 吸 取 多 余 的 缓 冲 液 然 后 将 膜 条 无 光 泽 面 向 上 平 铺 在 玻 璃 板 上, 用 点 样 器 在 距 离 膜 条 一 端 2-3 厘 米 处 点 样 3. 电 泳 将 点 好 样 品 的 薄 膜 小 心 放 入 电 泳 槽 中, 注 意 点 样 的 一 端 要 放 在 负 极 调 节 电 16

18 压 至 160 伏, 电 流 强 度 为 0.4 毫 安 / 厘 米 电 泳 25 分 钟 电 泳 后 将 膜 条 放 在 滤 纸 上, 于 紫 外 灯 下 观 察, 用 铅 笔 将 吸 收 紫 外 光 的 暗 斑 圈 出 在 记 录 本 上 绘 制 RNA 水 解 液 的 醋 酸 纤 维 薄 膜 电 泳 图 谱 并 根 据 附 表 中 的 数 据 分 析 确 定 各 斑 点 代 表 那 种 核 苷 酸 17

19 实 验 十 维 生 素 C 的 定 量 测 定 一 实 验 目 的 1. 学 习 定 量 测 定 维 生 素 C 的 原 理 和 方 法 2. 进 一 步 掌 握 滴 定 法 的 基 本 操 作 技 术 3. 了 解 松 针 及 水 果 中 维 生 素 C 的 含 量 二 原 理 维 生 素 C 是 人 类 最 重 要 的 维 生 素 之 一, 缺 乏 时 会 产 生 坏 血 病, 因 此 又 称 为 抗 坏 血 酸 它 是 具 有 L 系 糖 构 型 的 不 饱 和 多 羟 化 合 物, 属 于 水 溶 性 维 生 素 维 生 素 C 分 布 很 广, 植 物 的 绿 色 部 分 及 许 多 水 果 ( 桔 类 草 莓 辣 椒 等 ) 的 含 量 更 为 丰 富 维 生 素 C 具 有 很 强 的 还 原 性 在 碱 性 溶 液 中 加 热 并 有 氧 化 剂 存 在 时, 抗 坏 血 酸 易 被 氧 化 而 破 坏 在 中 性 和 微 酸 性 环 境 中, 抗 坏 血 酸 将 染 料 2,6- 二 氯 酚 靛 酚 还 原 成 无 色 的 还 原 型 2,6- 二 氯 酚 靛 酚 同 时 将 抗 坏 血 酸 氧 化 成 脱 氢 抗 坏 血 酸 分 子 式 氧 化 型 的 2,6- 二 氯 酚 靛 酚 在 酸 性 溶 液 中 呈 红 色, 在 中 性 或 碱 性 溶 液 中 呈 蓝 色 因 此, 当 用 2,6- 二 氯 酚 靛 酚 滴 定 含 抗 坏 血 酸 的 酸 性 溶 液 时, 在 抗 坏 血 酸 尚 未 全 部 被 氧 化 时, 滴 下 的 2,6- 二 氯 酚 靛 酚 立 即 被 还 原 成 无 色 但 溶 液 中 的 抗 坏 血 酸 一 旦 被 氧 化 时, 则 滴 下 的 2,6- 二 氯 酚 靛 酚 立 即 使 溶 液 呈 现 红 色 所 以, 当 溶 液 从 无 色 转 变 成 为 红 色 时, 即 表 示 溶 液 中 的 抗 坏 血 酸 则 刚 刚 全 部 被 氧 化, 此 时 即 为 滴 定 终 点 从 滴 定 时 2,6- 二 氯 酚 靛 酚 标 准 溶 液 的 消 耗 量, 可 以 计 算 出 被 检 测 样 品 中 抗 坏 血 酸 的 含 量 该 法 简 便 易 行, 但 有 下 列 缺 点 :1. 在 生 物 组 织 内 和 组 织 撮 物 内, 抗 坏 血 酸 还 能 以 脱 氢 抗 坏 血 酸 及 结 合 抗 坏 血 酸 的 形 式 存 在 它 们 同 样 的 具 有 维 生 素 C 的 胜 利 作 用, 但 不 能 将 2,6- 二 氯 酚 靛 酚 还 原 脱 色 2. 生 物 组 织 撮 物 和 生 物 体 液 中 常 含 有 其 他 还 原 性 物 质, 其 中 有 些 也 可 在 同 样 实 验 条 件 下 使 2,6- 二 氯 酚 靛 酚 还 原 脱 色 3. 在 生 物 组 织 提 取 物 中, 常 有 色 素 类 物 质 存 在, 给 滴 定 终 点 的 观 察 造 成 困 难 三 实 验 材 料 试 剂 和 器 材 ( 一 ) 试 剂 及 材 料 (1) 松 针 桔 皮 水 果 或 蔬 菜 (2)2,6- 二 氯 酚 靛 酚 钠 溶 液 : 将 50mg 2,6- 二 氯 酚 靛 酚 溶 解 于 约 200ml 含 有 52mg 碳 酸 钠 的 热 水 中 冷 却 后, 稀 释 到 250ml 装 入 棕 色 瓶 内, 于 冰 箱 中 保 存 2,6- 二 氯 酚 靛 酚 不 稳 定, 每 周 必 须 重 新 配 制, 使 用 前 需 按 照 下 法 标 定 : 取 5ml 标 准 抗 坏 血 酸 溶 液 加 1% 草 酸, 以 2,6- 二 氯 酚 靛 酚 滴 定 呈 粉 红 色, 并 在 15 秒 内 不 褪 色 为 终 点 计 算 2,6- 二 氯 酚 靛 酚 溶 液 的 浓 度 最 后 将 2,6- 二 氯 酚 靛 酚 溶 液 调 节 至 每 毫 升 相 当 于 抗 坏 血 酸 毫 克 (3)1% 盐 酸 溶 液 (4) 标 准 抗 坏 血 酸 溶 液 : 溶 解 100mg 纯 抗 坏 血 酸 粉 末 结 晶 于 1% 草 酸 中, 然 后 稀 释 到 500ml 在 使 用 前 临 时 配 制 ( 二 ) 器 材 (1) 锥 形 瓶 (50ml) 18

20 (2) 小 研 钵 (3) 吸 量 管 (10ml) (4) 漏 斗 (5) 滤 纸 (6) 容 量 瓶 (50ml) (7) 微 量 滴 定 管 (5ml) 四 实 验 操 作 方 法 ( 一 ) 样 品 处 理 1. 松 针 : 把 松 针 必 须 预 先 用 温 水 洗 去 泥 土, 并 在 空 气 中 风 干 用 分 析 天 平 准 确 称 取 松 针 约 0.5g, 放 入 研 钵 中, 加 1% 盐 酸 溶 液 5-10ml, 一 起 研 磨 放 置 片 刻, 将 提 取 液 滤 入 50ml 容 量 瓶 如 此 反 复 抽 提 2-3 次, 最 后 用 1% 盐 酸 溶 液 稀 释 到 刻 度 并 混 匀 每 次 量 取 5 或 10ml 放 入 小 锥 形 瓶 内 滴 定 2. 新 鲜 蔬 菜 和 水 果 : 用 水 洗 净 后 用 纱 布 或 吸 水 纸 吸 干 表 面 水 分 然 后 称 取 20.0g, 加 2% 草 酸 ( 草 酸 可 抑 制 抗 坏 血 酸 氧 化 酶, 偏 磷 酸 有 同 样 效 果 )100ml 置 组 织 搅 拌 机 中 打 成 浆 状 称 取 浆 状 物 5.0g, 倒 入 50ml 容 量 瓶 中 以 2% 草 酸 溶 液 稀 释 至 刻 度 静 置 10min, 过 滤 或 离 心 ( 最 初 数 毫 升 滤 液 弃 去 ) 滤 液 备 用, 当 滤 液 颜 色 太 深, 则 可 以 用 白 陶 土 脱 色 ( 二 ) 滴 定 与 计 算 1. 滴 定 : 用 微 量 滴 定 管 ( 样 品 液 的 取 量 大 时 可 用 常 量 滴 定 管 ), 以 0.001N2,6- 二 氯 酚 靛 酚 钠 溶 液 ( 蓝 色 ) 滴 定 至 提 取 液 呈 现 出 淡 粉 红 色, 并 保 持 秒 不 褪 滴 定 过 程 必 须 迅 速, 不 要 超 过 2min 因 为 本 滴 定 条 件 下, 一 些 非 维 生 素 还 原 物 的 还 原 作 用 较 迟 缓, 快 速 滴 定 可 以 避 免 减 少 它 们 的 影 响 要 使 结 果 准 确, 滴 定 使 用 的 2,6- 二 氯 酚 靛 酚 钠 的 消 耗 量 应 该 在 1-4ml 之 间, 如 果 滴 定 的 结 果 超 出 此 范 围, 则 必 须 增 减 样 品 量 或 将 提 取 液 适 当 稀 释 另 取 5 或 10ml 1% 盐 酸 溶 液 作 对 照 滴 定 提 取 液 和 空 白, 对 照 各 做 三 份, 滴 定 结 果 取 平 均 值 进 行 计 算 2. 计 算 : (VA-VB) C 维 生 素 C 毫 克 数 /100 克 样 品 = 式 中 :VA 为 滴 定 样 品 提 取 液 D W 所 消 耗 的 2,6- 二 氯 酚 靛 酚 的 平 均 毫 升 数 ;VB 为 滴 定 空 白 对 照 所 消 耗 的 2,6- 二 氯 酚 靛 酚 的 平 均 毫 升 数 ;C 为 样 品 提 取 液 的 总 毫 升 数 ;D 为 滴 定 时 所 取 的 样 品 提 取 液 毫 升 数 ;W 为 被 检 样 品 的 重 量 为 1ml 0.001N 2,6- 二 氯 酚 靛 酚 溶 液 相 当 于 维 生 素 C 的 毫 克 数 19

21 实 验 十 一 SDS 凝 胶 电 泳 法 测 定 分 子 量 一 实 验 目 的 学 习 测 定 蛋 白 质 分 子 量 的 原 理 及 方 法 二 实 验 原 理 凝 胶 过 滤 和 凝 胶 电 泳 都 具 有 分 子 筛 的 作 用 目 前, 凝 胶 层 析 法 已 经 广 泛 地 应 用 在 测 定 分 子 量 的 工 作 上 了 SDS 凝 胶 电 泳 法 测 定 分 子 量 已 经 比 较 成 功, 这 个 方 法 测 定 时 间 短, 分 辨 率 高, 所 需 样 品 量 极 少 缺 点 是 :(1) 它 只 适 用 于 球 形 或 基 本 呈 球 形 的 蛋 白 质 (2) 某 些 蛋 白 质 不 易 与 SDS 结 合, 如 木 瓜 蛋 白 酶 等, 因 此 测 定 结 果 就 不 准 确 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 法 将 不 同 组 分 分 离 是 由 于 两 个 效 应 同 时 在 起 作 用 :(1) 分 子 的 大 小 差 异, 即 分 子 分 子 量 的 差 异 (3) 分 子 带 电 荷 量 的 差 异 它 可 以 将 具 有 相 同 分 子 量, 但 带 不 同 电 荷 量 的 分 子 分 开 ; 也 可 以 将 点 相 同 电 荷 量 而 分 子 量 不 同 的 物 质 分 开 因 此, 这 个 方 法 的 分 辨 率 高 但 是, 对 于 测 定 分 子 量 来 说, 上 述 第 三 个 效 应 即 电 荷 效 应 会 妨 碍 测 定 工 作, 要 设 法 去 除 用 阴 离 子 表 面 活 性 剂 SDS( 十 二 烷 基 磺 酸 钠 ) 和 蛋 白 质 分 子 结 合 成 带 有 大 量 负 电 荷 的 复 合 物 因 此 它 带 有 很 大 数 量 的 负 电 荷, 媛 媛 超 过 了 蛋 白 质 分 子 原 有 的 电 荷 差 别 也 就 是 说 蛋 白 质 分 子 全 部 带 上 相 同 数 量 的 负 电 荷 这 样 蛋 白 质 分 子 泳 动 率 的 差 别 就 仅 仅 反 映 了 分 子 量 的 差 别 选 择 一 系 列 不 同 分 子 量 的 球 形 或 基 本 呈 球 形 的 蛋 白 质 作 为 标 准 物 质, 使 其 形 成 SDS 复 合 物 把 这 些 复 合 物 分 装 在 各 个 相 同 条 件 ( 指 相 同 高 度 相 同 凝 胶 浓 度 形 态 缓 冲 条 件 ) 的 电 泳 管 ( 或 平 板 电 泳 凝 胶 ) 内 进 行 电 泳 分 离 分 子 量 小 的 物 质 的 泳 动 距 离 大, 分 子 量 大 的 物 质 泳 动 距 离 小 以 该 条 件 下 最 大 的 泳 动 距 离 作 为 相 对 泳 动 率 的 标 准, 定 为 1.0. 根 据 这 个 标 准 标 出 其 他 分 子 的 相 对 泳 动 率 例 如 血 红 蛋 白 的 泳 动 距 离 如 果 是 65mm, 定 其 相 对 泳 动 率 Rm=22/65=0.34 用 相 对 泳 动 率 对 蛋 白 质 分 子 量 的 对 数 值 作 用, 在 一 定 范 围 内 呈 直 线 关 系 因 此 可 作 为 标 准 曲 线 来 检 验 样 品 蛋 白 质 的 分 子 量 SDS 在 水 溶 液 中 以 单 体 和 分 子 团 两 种 形 式 存 在 只 有 单 体 才 能 和 蛋 白 质 分 子 形 成 复 合 物, 在 低 离 子 强 度 的 溶 液 中, 提 高 SDS 总 浓 度, 也 可 以 提 高 其 单 体 浓 度, 而 单 体 浓 度 却 不 会 增 加 因 此, 蛋 白 质 样 品 溶 液 的 离 子 强 度 必 须 低 于 有 亚 基 组 成 的 蛋 白 质 分 子, 与 SDS 结 合 后 解 离 成 为 亚 基 三 实 验 试 剂 与 器 材 1.10%SDS 水 溶 液 10ml 2.25% 甘 油 溶 液 10ml 3.10% 巯 基 乙 醇 ( 临 时 配 制 ) 10ml 4.0.2M 磷 酸 缓 冲 液 (PH7.2) 5. 凝 胶 储 备 液 丙 烯 酰 胺 (Acr) 29.2g N,N- 亚 甲 基 双 丙 烯 酰 胺 (Bis) 0.8g 加 无 离 子 水 到 100ml 6.25%N,N,N- 四 甲 基 乙 二 胺 (TEMED) 7. 过 硫 酸 铵 (NH 4 ) 2 S 2 O 3 临 用 时 配 制 8. 考 马 斯 亮 蓝 G g 无 离 子 水 44ml 20

22 甲 醇 44ml 冰 乙 酸 11ml 9. 脱 色 液 甲 醇 50ml 冰 乙 酸 50ml 蒸 馏 水 400ml 10. 电 极 缓 冲 液 (PH7.2) 磷 酸 缓 冲 液 (PH7.2) 50ml 蒸 馏 水 940ml 10%SDS 溶 液 11. 活 性 炭 ( 粉 末 状 ) 12. 固 定 液 40% 甲 醇 7% 乙 酸 ( 三 ) 仪 器 : 中 压 电 泳 仪, 圆 盘 电 泳 槽, 精 密 酸 度 计, 电 导 仪, 分 析 天 平, 扭 力 天 平, 真 空 泵, 恒 温 水 浴 锅, 恒 温 箱 四 实 验 操 作 步 骤 1. 将 内 径 5mm 的 细 玻 璃 管 截 成 10cm 长 电 泳 玻 璃 的 管 16 个, 两 端 在 细 砂 纸 上 磨 平 用 坐 标 纸 作 尺 子, 从 电 泳 玻 璃 管 一 端 起 量 到 80mm 处 做 一 个 标 记, 再 用 细 锉 刀 在 该 处 刻 一 条 线 根 据 电 泳 槽 上 装 电 泳 玻 璃 管 孔 的 大 小, 选 合 适 的 橡 皮 塞 16 个, 并 在 中 间 打 上 孔, 将 电 泳 玻 璃 管 插 入 塞 内 另 取 4-5 号 橡 皮 塞 16 个, 用 同 样 孔 径 的 打 孔 器 打 孔, 打 到 塞 子 一 半 深 度 拔 出 打 孔 器, 再 将 已 切 开 的 部 分 用 镊 子 拉 出 切 断, 作 为 底 座 将 玻 璃 橡 胶 塞 洗 净,80 烘 干 使 用 时, 在 底 座 盲 孔 内 稍 涂 以 25% 蔗 糖 (10% 甘 油 ) 溶 液, 可 使 凝 胶 不 粘 在 橡 胶 塞 上 然 后 装 配 在 一 起, 并 在 校 橡 皮 塞 下 用 玻 璃 蜡 笔 标 上 号 码 2. 凝 胶 管 (T=5%,C=2.67%) 在 150ml 的 小 烧 杯 内 装 入 : PH7.2 磷 酸 缓 冲 液 50ml 凝 胶 储 备 液 3.4ml 25%TEMED 0.2ml,25ul 无 离 子 水 11.3ml,11.5ml 混 匀 后 置 真 空 器 抽 气 5min, 然 后 加 入 : 10%SDS 溶 液 0.2ml 10% 过 硫 酸 铵 溶 液 0.1ml 混 匀 后 立 即 用 滴 管 分 装 到 16 个 电 泳 玻 璃 管 内, 使 凝 胶 液 面 弯 月 底 恰 好 在 80mm 刻 度 线 上 用 夹 头 滴 管 沿 电 泳 管 玻 璃 壁 慢 慢 地 加 入 少 量 无 离 子 水 ( 高 度 约 2-3mm), 可 使 凝 胶 表 面 平 整 大 约 10min 后, 可 以 再 无 离 子 水 与 凝 胶 层 之 间 见 到 界 面 30min 后 聚 合 完 全 3. 蛋 白 标 准 溶 液 的 制 备 (1) 选 择 几 种 已 知 分 子 量 的 球 形 或 接 近 于 球 形 的 蛋 白 质 作 为 标 准 品, 本 实 21

23 验 选 用 : a. 牛 血 红 蛋 白 M=15,500 b. 胃 蛋 白 酶 M=35,000 c. 卵 清 白 蛋 白 M=45,000 d. 牛 血 清 白 蛋 白 M=67,000 e. 人 丙 种 球 蛋 白 M=160,000 将 标 准 蛋 白 质 分 别 配 制 成 0.5% 的 溶 液, 用 PH M 磷 酸 盐 缓 冲 液 作 溶 剂, 并 在 容 器 上 编 上 号 码 同 时 配 0.5% 的 样 品 溶 液, 编 号 为 6 取 6 支 试 管, 编 号 分 别 装 入 : 标 准 蛋 白 溶 液 ( 其 中 之 一 为 样 品 溶 液,0.4ml) 25% 甘 油 0.4ml 10%SDS 0.1ml 无 离 子 水 0.1ml 轻 轻 混 匀, 放 在 50 恒 温 水 浴 中 处 理 2h(37 温 箱 中 3h, 或 在 100 沸 水 浴 中 3min) 4. 加 样 用 微 量 滴 管 或 微 量 进 样 器 吸 取 标 准 蛋 白 溶 液 16ul, 沿 壁 加 到 相 应 的 凝 胶 管 内 再 慢 慢 用 电 极 缓 冲 液 装 满 凝 胶 管 5. 电 泳 将 凝 胶 管 插 入 电 极 槽 底 部 的 圆 孔 内, 上 下 电 极 槽 各 装 入 ml 的 电 极 缓 冲 液 接 上 电 源 ( 下 槽 接 正 极, 上 槽 接 负 极 ), 在 开 始 通 电 的 2min 内, 按 每 个 凝 胶 管 1mA 电 流 供 电,2min 后 慢 慢 调 高 电 压 至 V, 电 流 每 管 4-6mA 注 意, 电 压 不 可 过 高 3-4h 后, 当 血 红 蛋 白 带 离 管 底 约 10mm 时, 停 止 通 电, 取 出 凝 胶 管 6. 固 定 与 染 色 (1) 将 注 射 器 吸 满 无 离 子 水, 装 上 长 注 射 针 头 将 针 沿 管 壁 插 入 凝 胶 管, 边 转 动 凝 胶 管 边 插 边 注 水, 凝 胶 柱 便 可 以 从 管 壁 剥 离, 使 其 滑 入 编 有 相 应 号 码 的 培 养 皿 中 (2) 倾 去 培 养 皿 内 的 水, 加 入 10-20ml 的 固 定 液, 并 不 断 摇 动 (3)1-2h 后 倾 去 固 定 液, 加 入 考 马 斯 亮 蓝 G250 染 色 液, 染 色 2h (4) 倾 去 染 色 液, 用 脱 色 液 刷 洗 2-3 次 后, 再 用 脱 色 液 浸 泡 脱 色, 直 至 蛋 白 质 显 示 出 来, 中 间 更 换 几 次 脱 色 液 7. 测 量 相 对 泳 动 率 Rm 值 以 血 红 蛋 白 色 带 的 相 对 泳 动 率 为 1.0, 计 算 其 他 各 种 蛋 白 质 色 带 的 Rm 值 8. 作 标 准 曲 线 图, 推 算 样 品 分 子 量 以 Rm 值 为 纵 坐 标, 以 分 子 量 的 对 数 值 (logmw) 为 横 坐 标, 将 各 标 准 蛋 白 质 的 坐 标 连 成 一 条 直 线 根 据 样 品 的 Rm 值, 从 标 准 曲 线 上 查 出 其 分 子 量 的 对 数 值, 在 算 出 样 品 的 分 子 量 22

24 附 录 一 生 物 化 学 实 验 室 规 则 一 实 验 室 是 师 生 进 行 科 学 实 验, 教 研 活 动 的 专 门 场 所, 不 得 挪 作 它 用 二 实 验 操 作 前, 要 认 真 预 习 有 关 内 容, 明 确 实 验 目 的 要 求 原 理 和 仪 器 药 品 的 性 能 规 格, 掌 握 实 验 步 骤 和 方 法 三 进 入 实 验 室 必 须 保 持 肃 静, 按 指 定 的 位 置 就 坐, 不 随 意 挪 动 实 验 仪 器 药 品 和 其 它 设 备 认 真 听 取 教 师 讲 解 有 关 事 项 四 实 验 操 作 时, 要 遵 守 操 作 规 程, 严 格 按 实 验 步 骤 动 手 动 脑, 仔 细 观 察 实 验 现 象, 祥 细 记 录 实 验 资 料, 认 真 完 成 实 验 报 告, 并 做 到 爱 护 仪 器 设 备 节 约 水 电 和 药 品 五 实 验 中 的 废 液 废 纸 废 渣 动 植 物 残 体 以 及 玻 璃 碎 片 等 物, 不 得 随 便 抛 弃 或 倒 入 水 槽, 应 倒 入 废 液 缸 和 垃 圾 箱 里, 以 确 保 安 全 和 卫 生 六 实 验 中 损 坏 仪 器, 应 主 动 向 教 师 报 告, 并 填 写 仪 器 损 坏 报 告 单 因 违 章 操 作 而 造 成 仪 器 损 坏, 应 酌 情 赔 偿 七 实 验 操 作 完 毕, 应 及 时 将 仪 器 清 洁 收 拾 清 点 摆 放 归 位, 做 好 实 验 室 清 洁 卫 生, 关 好 水 源 电 源 门 窗 23

25 附 录 二 实 验 室 安 全 及 防 护 知 识 ( 一 ) 实 验 室 安 全 知 识 在 生 物 化 学 实 验 室 中, 经 常 与 毒 性 很 强 有 腐 蚀 性 易 燃 烧 和 具 有 爆 炸 性 的 化 学 药 品 直 接 接 触, 常 常 使 用 易 碎 的 玻 璃 和 瓷 质 器 皿 以 及 在 煤 气 水 电 等 高 温 电 热 设 备 的 环 境 下 进 行 着 紧 张 而 细 致 的 工 作, 因 此, 必 须 十 分 重 视 安 全 工 作 1. 进 入 实 验 室 开 始 工 作 前 应 了 解 煤 气 总 阀 门 水 阀 门 及 电 闸 所 在 处 离 开 实 验 室 时, 一 定 要 将 室 内 检 查 一 遍, 应 将 水 电 煤 气 的 开 关 关 好, 门 窗 锁 好 2 使 用 煤 气 灯 时, 应 先 将 火 柴 点 燃, 一 手 执 火 柴 紧 靠 近 灯 口, 一 手 慢 开 煤 气 门 不 能 先 开 煤 气 门, 后 燃 火 柴 灯 焰 大 小 和 火 力 强 弱, 应 根 据 实 验 的 需 要 来 调 节 用 火 时, 应 做 到 火 着 人 在, 人 走 火 灭 3. 使 用 电 器 设 备 ( 如 烘 箱 恒 温 水 浴 离 心 机 电 炉 等 ) 时, 严 防 触 电 ; 绝 不 可 用 湿 手 或 在 眼 睛 旁 视 时 开 关 电 闸 和 电 器 开 关 应 该 用 试 电 笔 检 查 电 器 设 备 是 否 漏 电, 凡 是 漏 电 的 仪 器, 一 律 不 能 使 用 4. 使 用 浓 酸 浓 碱, 必 须 极 为 小 心 地 操 作, 防 止 溅 出 用 移 液 管 量 取 这 些 试 剂 时, 必 须 使 用 橡 皮 球, 绝 对 不 能 用 口 吸 取 若 不 慎 溅 在 实 验 台 上 或 地 面, 必 须 及 时 用 湿 抹 布 擦 洗 干 净 如 果 触 及 皮 肤 应 立 即 治 疗 5. 使 用 可 燃 物, 特 别 是 易 燃 物 ( 如 乙 醚 丙 酮 乙 醇 苯 金 属 钠 等 ) 时, 应 特 别 小 心 不 要 大 量 放 在 桌 上, 更 不 要 在 靠 近 火 焰 处 只 有 在 远 离 火 源 时, 或 将 火 焰 熄 灭 后, 才 可 大 量 倾 倒 易 燃 液 体 低 沸 点 的 有 机 溶 剂 不 准 在 火 上 直 接 加 热, 只 能 在 水 浴 上 利 用 回 流 冷 凝 管 加 热 或 蒸 馏 6. 如 果 不 慎 倾 出 了 相 当 量 的 易 燃 液 体, 则 应 按 下 法 处 理 : (1) 立 即 关 闭 室 内 所 有 的 火 源 和 电 加 热 器 (2) 关 门, 开 启 小 窗 及 窗 户 (3) 用 毛 巾 或 抹 布 擦 拭 洒 出 的 液 体, 并 将 液 体 拧 到 大 的 容 器 中, 然 后 再 倒 入 带 塞 的 玻 璃 瓶 中 7. 用 油 浴 操 作 时, 应 小 心 加 热, 不 断 用 温 度 计 测 量, 不 要 使 温 度 超 过 油 的 燃 烧 温 度 8. 易 燃 和 易 爆 炸 物 质 的 残 渣 ( 如 金 属 钠 白 磷 火 柴 头 ) 不 得 倒 入 污 物 桶 或 水 槽 中, 应 收 集 在 指 定 的 容 器 内 9. 废 液, 特 别 是 强 酸 和 强 碱 不 能 直 接 倒 在 水 槽 中, 应 先 稀 释, 然 后 倒 入 水 槽, 再 用 大 量 自 来 水 冲 洗 水 槽 及 下 水 道 10. 毒 物 应 按 实 验 室 的 规 定 办 理 审 批 手 续 后 领 取, 使 用 时 严 格 操 作, 用 后 妥 善 处 理 ( 二 ) 实 验 室 灭 火 法 实 验 中 一 旦 发 生 了 火 灾 切 不 可 惊 慌 失 措, 应 保 持 镇 静 首 先 立 即 切 断 室 内 一 切 火 源 和 电 源 然 后 根 据 具 体 情 况 正 确 地 进 行 抢 救 和 灭 火 常 用 的 方 法 有 : 1. 在 可 燃 液 体 燃 着 时, 应 立 即 拿 开 着 火 区 域 内 的 一 切 可 燃 物 质, 关 闭 通 风 器, 防 止 扩 大 燃 烧 若 着 火 面 积 较 小, 可 用 抹 布 湿 布 铁 片 或 沙 土 覆 盖, 隔 绝 空 气 使 之 熄 灭 但 覆 盖 时 要 轻, 避 免 碰 坏 或 打 翻 盛 有 易 燃 溶 剂 的 玻 璃 器 皿, 导 致 更 多 的 溶 剂 流 出 而 再 着 火 2. 酒 精 及 他 可 溶 于 水 的 液 体 着 火 时, 可 用 水 灭 火 3. 汽 油 乙 醚 甲 苯 等 有 机 溶 剂 着 火 时, 应 用 石 棉 布 或 砂 土 扑 灭 绝 对 不 能 用 水, 否 则 反 而 会 扩 大 燃 烧 面 积 4. 金 属 钠 着 火 时, 可 把 砂 子 倒 在 它 的 上 面 5. 导 线 着 火 时 不 能 用 水 及 二 氧 化 碳 灭 火 器, 应 切 断 电 源 或 用 四 氯 化 碳 灭 火 器 24

26 6. 衣 服 烧 着 时 切 忌 奔 走, 可 用 衣 服 大 衣 等 包 裹 身 体 或 躺 在 地 上 滚 动, 以 灭 火 7. 发 生 火 灾 时 应 注 意 保 护 现 场 较 大 的 着 火 事 故 应 立 即 报 警 ( 三 ) 实 验 室 急 救 在 实 验 过 程 中 不 慎 发 生 受 伤 事 故, 应 立 即 采 取 适 当 的 急 救 措 施 1. 受 玻 璃 割 伤 及 其 他 机 械 损 伤 : 首 先 必 须 检 查 伤 口 内 有 无 玻 璃 或 金 属 等 物 碎 片, 然 后 用 硼 酸 水 洗 净, 再 擦 碘 酒 或 紫 药 水, 必 要 时 用 纱 布 包 扎 若 伤 口 较 大 或 过 深 而 大 量 出 血, 应 迅 速 在 伤 口 上 部 和 下 部 扎 紧 血 管 止 血, 立 即 到 医 院 诊 治 2. 烫 伤 : 一 般 用 浓 的 (90%~95%) 酒 精 消 毒 后, 涂 上 苦 味 酸 软 膏 如 果 伤 处 红 痛 或 红 肿 ( 一 级 灼 伤 ), 可 用 橄 榄 油 或 用 棉 花 沾 酒 精 敷 盖 伤 处 ; 若 皮 肤 起 泡 ( 二 级 灼 伤 ), 不 要 弄 破 水 泡, 防 止 感 染 ; 铬 伤 处 皮 肤 呈 棕 色 或 黑 色 ( 三 级 灼 伤 ), 应 用 干 燥 而 无 菌 的 消 毒 纱 布 轻 轻 包 扎 好, 急 送 医 院 治 疗 3. 强 碱 ( 如 氢 氧 化 钠, 氢 氧 化 钾 ) 钠 钾 等 触 及 皮 肤 而 引 起 灼 伤 时, 要 先 用 大 量 自 来 水 冲 洗, 再 用 5% 乙 酸 溶 液 或 2% 乙 酸 溶 液 涂 洗 4. 强 酸 溴 等 触 及 皮 肤 而 致 灼 伤 时, 应 立 即 用 大 量 自 来 水 冲 洗, 再 以 5% 碳 酸 氢 钠 溶 液 或 5% 氢 氧 化 铵 溶 液 洗 涤 5. 如 酚 触 及 皮 肤 引 起 灼 伤, 应 该 用 大 量 的 水 清 洗, 并 用 肥 皂 和 水 洗 涤, 忌 用 乙 醇 6. 若 媒 气 中 毒 时, 应 到 室 外 呼 吸 新 鲜 空 气, 若 严 重 时 应 立 即 到 医 院 诊 治 7. 水 银 容 易 由 呼 吸 道 进 入 人 体, 也 可 以 经 皮 肤 直 接 吸 收 而 引 起 积 累 性 中 毒 严 重 中 毒 的 征 象 是 口 中 有 金 属 气 味, 呼 出 气 体 也 有 气 味 ; 流 唾 液, 牙 床 及 嘴 唇 上 有 硫 化 汞 的 黑 色 ; 淋 巴 腺 及 唾 液 腺 肿 大 若 不 慎 中 毒 时, 应 送 医 院 急 救 急 性 中 毒 时, 通 常 用 碳 粉 或 呕 吐 剂 彻 底 洗 胃, 或 者 食 入 蛋 白 ( 如 1 升 牛 奶 加 3 个 鸡 蛋 清 ) 或 蓖 麻 油 解 毒 并 使 之 呕 吐 8. 触 电 : 触 电 时 可 按 下 述 方 法 之 一 切 断 电 路 : 25

27 (1) 关 闭 电 源 ; (2) 用 干 木 棍 使 导 线 与 被 害 者 分 开 ; (3) 使 被 害 者 和 土 地 分 离, 急 救 时 急 救 者 必 须 做 好 防 止 触 电 的 安 全 措 施, 手 或 脚 必 须 绝 缘 ( 四 ) 实 验 室 常 识 1. 挪 动 干 净 玻 璃 仪 器 时, 勿 使 手 指 接 触 仪 器 内 部 2. 量 瓶 是 量 器, 不 要 用 量 瓶 作 盛 器 带 有 磨 口 玻 璃 塞 的 量 瓶 等 仪 器 的 塞 子, 不 要 盖 错 带 玻 璃 塞 的 仪 器 和 玻 璃 瓶 等, 如 果 暂 时 不 使 用, 要 用 纸 条 把 瓶 塞 和 瓶 口 隔 开 3. 洗 净 的 仪 器 要 放 在 架 上 或 干 净 纱 布 上 晾 干, 不 能 用 抹 布 擦 拭 ; 更 不 能 用 抹 布 擦 拭 仪 器 内 壁 4. 除 微 生 物 实 验 操 作 要 求 外, 不 要 用 棉 花 代 替 橡 皮 塞 或 木 塞 堵 瓶 口 或 试 管 口 5. 不 要 用 纸 片 覆 盖 烧 杯 和 锥 形 瓶 等 6. 不 要 用 滤 纸 称 量 药 品, 更 不 能 用 滤 纸 作 记 录 7. 不 要 用 石 蜡 封 闭 精 细 药 品 的 瓶 口, 以 免 掺 混 8. 标 签 纸 的 大 小 应 与 容 器 相 称, 或 用 大 小 相 当 的 白 纸, 绝 对 不 能 用 滤 纸 标 签 上 要 写 明 物 质 的 名 称 规 格 和 浓 度 配 制 的 日 期 及 配 制 人 标 签 应 贴 在 试 剂 瓶 或 烧 杯 的 2/3 处, 试 管 等 细 长 形 容 器 则 贴 在 上 部 9. 使 用 铅 笔 写 标 记 时, 要 在 玻 璃 仪 器 的 磨 砂 玻 璃 处 如 用 玻 璃 蜡 笔 或 水 不 溶 性 油 漆 笔, 则 写 在 玻 璃 容 器 的 光 滑 面 上 10. 取 用 试 剂 和 标 准 溶 液 后, 需 立 即 将 瓶 塞 严, 放 回 原 处 取 出 的 试 剂 和 标 准 溶 液, 如 未 用 尽, 切 勿 倒 回 瓶 内, 以 免 带 入 杂 质 11. 凡 是 发 生 烟 雾 有 毒 气 体 和 有 臭 味 气 体 的 实 验, 均 应 在 通 风 橱 内 进 行 橱 门 应 紧 闭, 非 必 要 时 不 能 打 开 12. 用 实 验 动 物 进 行 实 验 时, 不 许 戏 弄 动 物 进 行 杀 死 或 解 剖 等 操 作, 必 须 按 照 规 定 方 法 进 行 绝 对 不 能 用 动 物 手 术 器 械 或 药 物 开 玩 笑 3. 使 用 贵 重 仪 器 如 分 析 天 平 比 色 计 分 光 光 度 计 酸 度 计 冰 冻 离 心 机 层 析 设 备 等, 应 十 分 重 视, 加 倍 爱 护 使 用 前, 应 熟 知 使 用 方 法 若 有 问 题, 随 时 请 指 导 实 验 的 教 师 解 答 使 用 时, 要 严 格 遵 守 操 作 规 程 发 生 故 障 时, 应 立 即 关 闭 仪 器, 请 告 知 管 理 人 员, 不 得 擅 自 拆 修 14. 一 般 容 量 仪 器 的 容 积 都 是 在 20 下 校 准 的 使 用 时 如 温 度 差 异 在 5 以 内. 容 积 改 变 不 大, 可 以 忽 略 不 计 ( 五 ) 玻 璃 仪 器 的 洗 涤 及 各 种 洗 液 的 配 制 法 实 验 中 所 使 用 的 玻 璃 仪 器 清 洁 与 否, 直 接 影 响 实 验 结 果, 往 往 由 于 仪 器 的 不 清 洁 或 被 污 染 而 造 成 较 大 的 实 验 误 差, 甚 至 会 出 现 相 反 的 实 验 结 果 因 此, 玻 璃 仪 器 的 洗 涤 清 洁 工 作 是 非 常 重 要 的 1. 初 用 玻 璃 仪 器 的 清 洗 新 购 买 的 玻 璃 仪 器 表 面 常 附 着 有 游 离 的 碱 性 物 质, 可 先 用 洗 涤 灵 稀 释 液 肥 皂 水 或 去 污 粉 等 洗 刷 再 用 自 来 水 洗 净, 然 后 浸 泡 在 1%~2% 盐 酸 溶 液 中 过 夜 ( 不 少 于 4 小 时 ), 再 用 自 来 水 冲 洗, 最 后 用 蒸 馏 水 冲 洗 2~3 次, 在 80~100 烘 箱 内 烤 干 备 用 2. 使 用 过 的 玻 璃 仪 器 的 清 洗 (1) 一 般 玻 璃 仪 器 : 如 试 管 烧 杯 锥 形 瓶 等 ( 包 括 量 筒 ), 先 用 自 来 水 洗 刷 至 无 污 物 ; 再 选 用 大 小 合 适 的 毛 刷 沾 取 洗 涤 灵 稀 释 液 或 浸 入 洗 涤 灵 稀 释 液 内, 将 器 皿 内 外 ( 特 别 是 内 壁 ) 细 心 刷 洗, 用 自 来 水 冲 洗 干 净 后, 蒸 馏 水 冲 洗 2~3 次, 烤 干 或 倒 置 在 清 洁 处, 干 后 备 用 凡 洗 净 的 玻 璃 器 皿, 不 应 在 器 壁 上 带 有 水 珠, 26

28 否 则 表 示 尚 未 洗 干 净, 应 再 按 上 述 方 法 重 新 洗 涤 若 发 现 内 壁 有 难 以 去 掉 的 污 迹, 应 分 别 试 用 下 述 各 种 洗 涤 剂 予 以 清 除, 再 重 新 冲 洗 (2) 量 器 : 如 移 液 管 滴 定 管 量 瓶 等 使 用 后 应 立 即 浸 泡 于 凉 水 中, 勿 使 物 质 干 涸 工 作 完 毕 后 用 流 水 冲 洗, 去 附 着 的 试 剂 蛋 白 质 等 物 质, 晾 干 后 浸 泡 在 铬 酸 洗 液 中 4~6 小 时 ( 或 过 夜 ), 再 用 自 来 水 充 分 冲 洗 最 后 用 水 冲 洗 2~4 次, 风 干 备 用 (3) 其 他 : 具 有 传 染 性 样 品 的 容 器, 如 病 毒 传 染 病 患 者 的 血 清 等 沾 污 过 的 容 器, 应 先 进 行 高 压 ( 或 其 他 方 法 ) 消 毒 后 再 进 行 清 洗 盛 过 各 种 有 毒 药 品, 特 别 是 剧 毒 药 品 和 放 射 性 同 位 素 等 物 质 的 容 器, 必 须 经 过 专 门 处 理, 确 知 没 有 残 余 毒 物 存 在 方 可 进 行 清 洗 3. 洗 涤 液 的 种 类 和 配 制 方 法 (1) 铬 酸 洗 液 ( 重 铬 酸 钾 - 硫 酸 洗 液, 简 称 为 洗 液 ) 广 泛 用 于 玻 璃 仪 器 的 洗 涤 常 用 的 配 制 方 法 有 下 述 四 种 : 1 取 100mL 工 业 浓 硫 酸 置 于 烧 杯 内, 小 心 加 热, 然 后 小 心 慢 慢 加 入 5g 重 铬 酸 钾 粉 末, 边 加 边 搅 拌, 待 全 部 溶 解 后 冷 却, 贮 于 具 玻 璃 塞 的 细 口 瓶 内 2 称 取 5g 重 铬 酸 钾 粉 末 置 于 250mL 烧 杯 中, 加 水 5mL, 尽 量 使 其 溶 解 慢 慢 加 入 浓 硫 酸 100mL, 随 加 随 搅 拌 冷 却 后 贮 存 备 用 3 称 取 80g 重 铬 酸 钾, 溶 于 1000mL 自 来 水 中, 慢 慢 加 入 工 业 硫 酸 100mL( 边 加 边 用 玻 璃 棒 搅 动 ) 4 称 取 200g 重 铬 酸 钾, 溶 于 500mL 自 来 水 中, 慢 慢 加 入 工 业 硫 酸 500mL( 边 加 边 搅 拌 ) (2) 浓 盐 酸 ( 工 业 用 ): 可 洗 去 水 垢 或 某 些 无 机 盐 沉 淀 (3)5% 草 酸 溶 液 : 用 数 滴 硫 酸 酸 化, 可 洗 去 高 猛 酸 钾 的 痕 迹 (4)5%~10% 磷 酸 三 钠 (Na3PO4 12H2O) 溶 液 : 可 洗 涤 油 污 物 (5)30% 硝 酸 溶 液 : 洗 涤 CO2 测 定 仪 器 及 微 量 滴 管 (6)5%~10% 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 (EDTA-Na2) 溶 液 : 加 热 煮 沸 可 洗 脱 玻 璃 仪 器 内 壁 的 白 色 沉 淀 物 (7) 尿 素 洗 涤 液 : 为 蛋 白 质 的 良 好 溶 剂, 适 用 于 洗 涤 盛 蛋 白 质 制 剂 及 血 样 的 容 器 (8) 酒 精 与 浓 硝 酸 混 合 液 : 最 适 合 于 洗 净 滴 定 管, 在 滴 定 管 中 加 入 3mL 酒 精, 然 后 沿 管 壁 慢 慢 加 入 4mL 浓 硝 酸 ( 比 重 1.4), 盖 住 滴 定 管 管 口, 利 用 所 产 生 的 氧 化 氮 洗 净 滴 定 管 9. 有 机 溶 剂 : 如 丙 酮 乙 醇 乙 醚 等 可 用 于 洗 去 油 脂 脂 溶 性 染 料 等 污 痕 二 甲 苯 可 洗 脱 油 漆 的 污 垢 10. 氢 氧 化 钾 的 乙 醇 溶 液 和 含 有 高 锰 酸 钾 的 氢 氧 化 钠 溶 液 : 是 两 种 强 碱 性 的 洗 涤 液, 对 玻 璃 仪 器 的 侵 蚀 性 很 强, 清 除 容 器 内 壁 污 垢, 洗 涤 时 间 不 宜 过 长 使 用 时 应 小 心 慎 重 上 述 洗 涤 液 可 多 次 使 用, 但 是 使 用 前 必 须 将 待 洗 涤 的 玻 璃 仪 器 先 用 水 冲 洗 多 次, 除 去 肥 皂 去 污 粉 或 各 种 废 液 若 仪 器 上 有 凡 士 林 或 羊 毛 脂 时, 应 先 用 纸 擦 去, 然 后 用 乙 醇 或 乙 醚 擦 净 后 才 能 使 用 洗 液, 否 则 会 使 洗 涤 液 迅 速 失 效 例 如 : 肥 皂 水, 有 机 溶 剂 ( 乙 醇 甲 醛 等 ) 及 少 量 油 污 都 会 使 重 铬 酸 钾 - 硫 酸 洗 液 变 成 绿 色, 减 低 洗 涤 能 力 27