目录 1. 项目背景 任务来源 工作过程 成立标准编制工作小组 查询国内外相关标准和文献资料 开题汇报, 确定标准制订技术路线, 制订原则 实验室内部方法开发

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1 广东省地方标准 水质抗生素类化合物的测定固相萃取 - 高效液相色谱 - 串联质谱法 编制说明 ( 征求意见稿 ) 水质抗生素类化合物的测定固相萃取 - 高效液相色谱 - 串联质谱法 编制组 2017 年 6 月

2 目录 1. 项目背景 任务来源 工作过程 成立标准编制工作小组 查询国内外相关标准和文献资料 开题汇报, 确定标准制订技术路线, 制订原则 实验室内部方法开发 编写标准讨论稿和编制说明草稿 方法验证工作 编写标准文本征求意见稿和编制说明 标准制修订的必要性 目标污染物的环境危害 目标污染物的基本性质 抗生素的环境危害 相关环保标准和环保工作的需要 现行环境监测分析方法标准的实施情况和存在问题 现行污染物分析方法标准的局限性 污染物分析仪器 设备 方法等的最新进展 国内外相关分析方法研究 主要国家 地区及国际组织相关分析方法研究 本标准与美国 EPA 1694 方法的异同之处 标准制修订的基本原则和技术路线 标准制修订的基本原则 标准的适用范围和主要技术内容 标准制修订的技术路线 方法研究报告 方法研究的目标 方法原理 试剂和材料 I

3 5.3.1 实验用水 试剂 标准物质 实验器皿 实验用气 仪器和设备 样品保存和预处理 样品预处理 样品保存条件 固相萃取和仪器分析步骤 固相萃取条件选择 仪器分析方法条件优化 标准曲线 实验室空白测试 (LRB) 方法检出限 方法精密度 方法准确度 方法适用性 结果计算和表示 定性分析 定量分析 结果表示 方法验证 参与方法验证的实验室基本情况 方法验证方案 方法验证内容 样品准备 方法验证过程 方法验证结果 精密度数据 准确度数据 参考文献 II

4 水质抗生素类化合物的测定固相萃取 - 高效液相色 谱 - 串联质谱法 编制说明 1. 项目背景 1.1 任务来源 近几年, 水环境中抗生素的污染问题受到研究人员 政府部门和大众的广泛关注 广东省政府对抗生素的污染非常重视, 为配合广东省 南粤水更清行动计划 (2013~2020 年 ), 提升自然水体和废水中抗生素的监测能力, 特制定本标准 2015 年 11 月, 广东省环境保护厅发布了 广东省环境保护标准修订服务采购项目 ( 采购项目编号 :GPCGD151115FG591F), 中国科学院广州地球化学研究所中标该采购项目的包组四 制定水体中抗生素的监测方法标准, 负责进行 水质抗生素类化合物的测定固相萃取 - 高效液相色谱 - 串联质谱法 标准制订 1.2 工作过程 成立标准编制工作小组中国科学院广州地球化学研究所接到广东省环境保护厅关于 广东省环境保护标准修订服务采购项目 ( 采购项目编号 :GPCGD151115FG591F) 中标通知后, 与广东省环境保护厅签订了任务合同书 合同书中规定了内容为 建立适用于污水厂废水 养殖场废水 河流等各类水体中抗生素的监测方法, 研究制定 水体中抗生素的监测方法 标准文本及发布所需资料文件 收到该任务以后, 项目承担单位成立了标准编制工作小组, 由熟悉样品前处理 色谱 - 质谱联用仪的分析人员承担本课题 查询国内外相关标准和文献资料 2015 年 12 月, 项目承担单位接到标准制定任务后, 标准编制工作小组根据有关标准制修订工作管理办法的相关规定, 检索 查询和收集国内外相关标准和文献资料 调研结果显示, 国内外抗生素的检测方法有液相色谱 紫外 荧光 液相色谱与质谱联用技术等, 由于紫外 荧光等检测技术灵敏度低, 检出限较高, 一定程度上影响了结果的准确性和重现性 ; 而近来越来越多的文献研究结果显示, 液相色谱串联质谱法是检测抗生素的一种高效 准确 灵敏的方法, 但目前国内标准中采用 1

5 液相色谱串联质谱法测定环境水体中的抗生素仍是空白 开题汇报, 确定标准制订技术路线, 制订原则 2016 年 1 月, 编写开题报告, 确定了本标准的具体内容 原则 技术路线等内容 根据我国抗生素的使用量 水体中常见抗生素的检出情况等资料, 确定了我国常用的 32 中抗生素为目标物质, 包括 10 种磺胺类 10 种氟喹诺酮类 6 种大环内酯类 4 种四环素类 及林可霉素和甲氧苄啶, 采用固相萃取前处理 - 液相色谱串联质谱法分析的技术方案, 实现对不同类型的环境水体中痕量抗生素的高效 准确测定 实验室内部方法开发 2016 年 2 月至 9 月, 标准编制工作小组采用固相萃取前处理 - 液相色谱串联质谱仪分析技术方法, 在中国科学院广州地球化学研究所污染物化学与生态毒理学实验室内部开展了检出限 精密度 准确度 方法适用性等系列的方法开发工作 实验结果表明, 当富集水样体积为 1000 ml, 浓缩以后定容体积为 1.0 ml, 进样体积为 5.0 μl 时,32 种抗生素类化合物在地表水中的方法检出限范围为 0.42 ng/l~2.98 ng/l, 测定下限范围为 1.67 ng/l~11.9 ng/l; 在城市污水处理厂废水中的方法检出限范围为 0.90 ng/l~9.26 ng/l, 测定下限范围为 3.60 ng/l~37.0 ng/l; 在养殖场废水中的方法检出限范围为 0.38 ng/l~11.1 ng/l, 测定下限范围为 1.50 ng/l~44.2 ng/l 可实现水体中痕量抗生素的定量分析 编写标准讨论稿和编制说明草稿 2016 年 10 月, 标准编制工作小组汇整前期研究成果, 编写 水质抗生素类化合物的测定固相萃取 - 高效液相色谱 - 串联质谱法 的标准草案及编制说明, 并对草案和编制说明进行修改 方法验证工作 2016 年 9 月 年 4 月期间, 标准编制工作小组组织了外部 5 家具备条件的实验室进行方法验证, 于 2016 年 4 月收回了全部的验证报告, 在此基础上进行了数据的汇总和分析整理工作, 并编写完成了验证汇总报告 编写标准文本征求意见稿和编制说明 2017 年 4 月至 5 月, 编写 水体中抗生素的测定固相萃取高效液相色谱 - 串联质谱法 的标准文本 ( 讨论稿 ) 及编制说明, 并组织专家对标准文本 ( 讨论稿 ) 及编制说明进行了论证 根据专家意见进一步修改, 于 2017 年 6 月形成标准文本 ( 征求意见稿 ) 及编制说明 2

6 2. 标准制修订的必要性 2.1 目标污染物的环境危害 目标污染物的基本性质广义上的抗生素 (antibiotics) 是指能够抑制或杀死微生物的一类天然或人工合成的化学物质 最初的抗生素是由微生物 ( 包括细菌 真菌和放线菌属 ) 在代谢过程中产生的抑制或杀死其它微生物的一类次级代谢产物, 主要用途是抑制其它种类微生物的生长 ( 抑菌作用 ) 或将它们杀死 ( 杀菌作用 ) 1929 年, 英国科学家弗莱明发现落到培养基上的青霉菌能抑制葡萄球菌的生长, 研究后发现青霉菌分泌的一种抗菌物质能抑制葡萄球菌, 他命名为青霉素 (penicillin) 近年来, 随着科技的进步, 又出现合成或半合成抗生素 目前已发现的抗生素已达上万种, 不仅包括微生物产生的, 也包括高等动植物产生的代谢物以及用化学方法合成和半合成的化合物 ; 不仅包括抗细菌的物质, 也包括抗肿瘤 抗原虫 抗病毒 抗真菌 抗藻类 抗寄生虫等的物质 目前常见的抗生素类型主要有 : (1) 磺胺类磺胺类药物是应用最早的一类人工合成抗菌药物 磺胺类药物属于广谱抗菌药物, 因其抗菌谱广 疗效强 方便安全等优点被广泛用于人体和动物 ( 各种畜禽 水产和宠物 ) 常见的磺胺类药物主要有磺胺嘧啶 磺胺甲噁唑 磺胺甲氧嘧啶 磺胺间二甲氧嘧啶 磺胺二甲嘧啶 复方新诺明 ( 磺胺甲噁唑 + 甲氧苄啶 ) 等 磺胺的分子中含有一个苯环, 一个对位氨基和一个磺酰胺基 磺胺类化学物主要是通过各种化学基团来取代磺酰胺基上的氢原子制备的有效衍生物 ( 图 1) 3

7 图 1 常见磺胺类抗生素结构图 (2) 四环素类四环素类抗生素是由放线菌产生的一类广谱抗生素, 主要包括四 环素 氧四环素 ( 土霉素 ) 氯四环素 ( 金霉素 ) 和强力霉素等 四环素类抗生素具 有抑菌作用并在高浓度具有杀菌作用的半合成广谱抗生素 抗生素可与 Ca 2+ Mg 2+ Fe 2+ 和 Al 3+ 等金属离子形成络合物, 影响药效, 同时与 Ca 2+ 形成的不溶络合物会影响 小儿的牙齿变黄和骨骼发育 因此, 小孩和孕妇禁用四环素类抗生素 目前, 四环 素类抗生素多用于养殖业, 如养猪 养鸡和水产养殖等 四环素类抗生素具有共同 的基本结构骈四苯, 仅取代基有所不同 ( 图 2) 4

8 图 2 常见四环素类抗生素结构图 (3) 喹诺酮类喹诺酮类药物按发明年代的先后和抗菌性能的不同, 分为四代 第一代,20 世纪 60 年代开发, 抗菌谱窄, 主要包括萘啶酸 吡咯酸 恶喹酸等 ; 第二代,20 世纪 70 年代开发, 抗菌谱有所扩大, 主要是对革兰氏阴性菌有效的抗菌药物, 主要包括新恶酸 吡哌酸等 ; 第三代, 即氟喹诺酮类药物, 药效远大于前两代, 对链球菌和耐药性葡萄球菌有杀菌作用, 抗菌力强, 价格低廉, 主要包括环丙沙星 诺氟沙星 氧氟沙星 恩诺氟沙星和培氟沙星等 ( 图 3); 第四代, 结构中有新型的 8- 甲氧氟喹诺酮, 甲氧基引入有助于加强抗厌氧菌活性, 而 C-7 位上的氮双环结构则加强抗革兰氏阳性菌活性, 并保持了原来抗革兰氏阴性菌的活性, 副作用更小, 但价格较贵, 主要包括莫西沙星和吉米沙星等 目前, 应用最为广泛的为第三代氟喹诺酮类抗生素, 主要作为人用和兽用抗生素 该类物质相对比较稳定, 溶解度偏低 5

9 图 3 常见氟喹诺酮类抗生素结构图 (4)β- 内酰胺类主要指化学结构中具有 β- 内酰胺环的一大类抗生素, 主要包括青霉素类和头孢菌素类 ( 图 4), 以及一些非典型 β- 内酰胺类 β- 内酰胺类抗生素的作用主要是作用于青霉素结合蛋白 (PBPs), 抑制细菌细胞壁的合成, 菌体失去渗透屏障而膨胀 裂解, 同时借助细菌的自溶酶溶解而产生抗菌作用 青霉素类由母核 6- 氨基青霉烷酸 (6-APA) 及侧链 (R-CO-) 组成,6-APA 中的 β- 内酰胺环是维持抗菌活性的最基本结构 侧链上的 R 接上不同基团, 就形成了各种半合成青霉素类 按抗菌谱和耐药性分为 5 类 :(I) 窄谱青霉素类 : 以注射用青霉素 G 和口服用青霉素 V 为代表 ;(II) 耐酶青霉素类 : 以注射用甲氧西林和科普副 注射用氯唑西林 氟氯西林为代表 ;(III) 广谱青霉素类 : 以注射 口服氨苄西林和口服用阿莫西林为代表 ;(IV) 抗铜绿假单胞菌广谱青霉素类 : 以注射用羧苄西林 哌拉西林为代表 ;(V) 革兰阴性菌青霉素类 : 以注射用美西林和口服用匹美西林为代表 青霉素类水溶液不稳定, 极易失效 ; 不耐热 ; 酸 碱 重金属及青霉素酶可使其 β- 内酰胺环破裂, 导致失效 头孢菌素类为 7- 氨基头孢烯酸 (7-ACA) 衍生物, 具有抗菌谱广 杀菌 6

10 力强 对 β- 内酰胺酶较稳定以及过敏反应少等特点, 比青霉素类稳定 ( 图 4) 目前, β- 内酰胺类抗生素使用非常广泛 图 4 常见头孢菌素类抗生素结构图 (5) 大环内酯类由链霉菌产生一类具有大环内脂结构的弱碱性抗菌药 ( 图 5), 对革兰氏阳性菌及支原体抑菌活性较高 主要包括红霉素 罗红霉素 竹桃霉素 交沙霉素等 图 5 常见大环内脂类抗生素结构图 (6) 聚醚类离子载体类聚醚类抗生素因其分子中有很多环醚结构而得名 ( 图 6) 7

11 具有抗球虫谱广 作用方式独特 耐药性形成缓慢 安全范围窄等特点 目前市场上使用的聚醚类离子载体抗生素品种主要有 : 莫能菌素 盐霉素 拉沙洛菌素 马杜拉霉素 甲基盐霉素等 聚醚类离子载体抗生素对家禽有较显著的增重效果, 作为常用的兽药进行使用 (7) 多肽类包括万古霉素类 多粘菌素类和杆菌肽类 (bacitracin) 万古霉素是从链霉菌培养液中分离获得, 化学性质稳定 近年却因能够杀灭 MRSA 和耐氧甲氧西林表皮葡萄球菌 (MRSE) 而得到广泛应用 包括万古霉素 (vancomycin) 去甲万古霉素 (norvancomycin) 和替考拉宁 多粘菌素类主要包括多粘菌素 B(polymyxin B) 粘菌素( 多粘菌素 E(polymyxin E)), 毒性大, 仅作局部使用 杆菌肽类 (Bacitracin) 主要包括杆菌肽和短杆菌肽, 常用作兽药 ( 图 6) (8) 林可霉素类包括林可霉素和氯林可霉素等 ( 图 6) 用于急 慢性敏感菌引起的骨及关节感染 对于厌氧菌引起的感染也有较好疗效 (9) 氯霉素类氯霉素的化学结构含有对硝基苯基 丙二醇与二氯乙酰胺三个部分 ( 图 6), 其抗菌活性主要与丙二醇有关 性质稳定, 能耐热 包括氯霉素 甲砜霉素及无味氯霉素等 因氯霉素的毒副作用较强, 我国在 2002 年已禁用氯霉素 (10) 氨基糖苷脂类氨基糖苷类抗生素 (aminoglycosides) 都由氨基糖分子和非糖部分的甙元结合而成, 它包括链霉素 庆大霉素 卡那霉素 西索米星以及人工半合成的妥布霉素 阿米卡星 奈替米星等 氨基糖苷类抗生素对于需氧革兰阴性杆菌所致的严重感染疗效较好, 且价格便宜, 常被一些基层医疗机构过多使用 但有研究表明, 氨基糖苷类抗生素不但造成耐药菌株的增加, 其毒副作用 不良反应所带来的后遗症都较为严重 (11) 硝基咪唑类具有咪唑基团结构 硝基咪唑类对厌氧菌及原虫有独特的杀灭作用, 与其它抗生素联合应用于临床的各个领域 主要包括甲硝唑和替硝唑 (12) 硝基呋喃类具有 5- 硝基呋喃基本结构 硝基呋喃类抗菌剂原型药在生物体内代谢迅速, 无法检测 ; 而其代谢物因和蛋白质结合而相当稳定 国内临床应用的呋喃类药物包括呋喃妥因 呋喃唑酮和呋喃西林 (13) 其它其它作用于革兰氏阴性细菌的其它抗生素, 如磷霉素 卷霉素 环丝氨酸和利福平等, 抗真菌的灰黄霉素, 抗肿瘤的丝裂霉素 防线菌素 D 博莱霉素和阿霉素等 8

12 图 6 其他常见的抗生素结构图 可以看出, 抗生素包括的种类多种多样, 而环境水体的基质复杂, 难以对全部抗生素进行有效测定 鉴于此, 本标准依据我国抗生素的使用量 环境水体检出情况及方法的有效检测情况, 选取常见抗生素 据项目负责人所在的研究组调研资料, 常见 36 种目标化学品总使用量为 吨, 其中兽用抗生素占总量的 84.3%, 人用抗生素占总量的 15.6% 阿莫西林, 氟苯尼考, 林可霉素, 青霉素和诺氟沙星是我国使用量排名前五的抗生素 尽管阿莫西林 青霉素等 β- 内酰胺类抗生素的使用量最高, 超过 1000 吨 / 年, 但 β- 内酰胺类抗生素非常容易水解, 在环境中这类抗生素很少检测到, 因此没有包含在本标准的目标化合物中 人们对氧氟沙星, 四环素和诺氟沙星的使用量超过了 1000 吨 / 年, 因此这几种抗生素都包含在目标化合物中 此外, 莫能菌素 盐霉素等离子载体类抗生素由于检测方法的绝对回收率不高, 难以满足有效检测, 也没有包含在本标准的目标化合物中 最终, 选取了 32 种抗生素类化合物作为目标物质, 包括 10 种磺胺类 10 种氟喹诺酮类 6 种大环内酯类 4 种四环素类 以及林可霉素和甲氧苄啶 32 种目标化合物的基本信息详见表 1 9

13 表 1 目标抗生素的基本性质 化合物英文英文名称中文名称简写 所属种类 CAS 号 分子量 分子式 Log Kow pka 卡巴多 Carbadox CAR 氟喹诺酮类 C 11 H 10 N 4 O 氯四环素 Chlortetracycline CTC 四环素类 C 22 H 23 ClN 2 O , 7.55, 9.33 环丙沙星 Ciprofloxacin CFX 氟喹诺酮类 C 17 H 18 FN 3 O , 6.14, 8.70, 克拉霉素 Clarithromycin CTM 大环内酯类 C 38 H 69 NO 二氟沙星 Difloxacin DIF 氟喹诺酮类 C 21 H 19 F 2 N 3 O 强力霉素 Doxycycline DC 四环素类 C 22 H 24 N 2 O , 7.97, 9.15 恩诺氟沙星 Enrofloxacin EFX 氟喹诺酮类 C 19 H 22 FN 3 O , 6.19 脱水红霉素 Erythromycin-H 2 O ETM-H 2O 大环内酯类 C 37 H 65 NO 12 氟罗沙星 Fleroxacin FL 氟喹诺酮类 C 17 H 18 F 3 N 3 O 北里霉素 Leucomycin LCM 大环内酯类 C 39 H 65 NO 14 林可霉素 Lincomycin LIN 其他 C 18 H 34 N 2 O 6 S 0.56 罗美沙星 Lomefloxacin LFX 氟喹诺酮类 C 17 H 19 F 2 N 3 O 马波沙星 Marbofloxacin MAR 氟喹诺酮类 C 17 H 19 FN 4 O 4 甲烯土霉素 Methacycline MT 四环素类 C 22 H 22 N 2 O , 6.87, 9.59 诺氟沙星 Norfloxacin NFX 氟喹诺酮类 C 16 H 18 FN 3 O , 8.6 氧氟沙星 Ofloxacin OFX 氟喹诺酮类 C 18 H 20 FN 3 O , 8.28 竹桃霉素 Oleandomycin ODM 大环内酯类 C 35 H 61 NO , 7.50 氧四环素 Oxytetracycline OTC 四环素类 C 22 H 24 N 2 O /7.46/8.94 罗红霉素 Roxithromycin RTM 大环内酯类 C 41 H 76 N 2 O 沙拉沙星 Sarafloxacin SAR 氟喹诺酮类 C 20 H 17 F 2 N 3 O , 8.6 磺胺氯哒嗪 Sulfachloropyridazine SCP 磺胺类 C 10H 9ClN 4O 2S 1.87, 5.45 磺胺嘧啶 Sulfadiazine SDZ 磺胺类 C 10 H 10 N 4 O 2 S , 6.4 磺胺二甲氧哒嗪 Sulfadimethoxine SDM 磺胺类 C 12 H 14 N 4 O 4 S , 6.08 磺胺甲基嘧啶 Sulfamerazine SMR 磺胺类 C11H12N4O2S 磺胺对甲氧嘧啶 Sulfameter SM 磺胺类 C 11 H 12 N 4 O 3 S 0.41 磺胺二甲嘧啶 Sulfamethazine SMZ 磺胺类 C 12 H 14 N 4 O 2 S , 7.49 磺胺甲噁唑 Sulfamethoxazole SMX 磺胺类 C 10 H 11 N 3 O 3 S , 5.6 磺胺间甲氧嘧啶 Sulfamonomethoxine SMM 磺胺类 C 11 H 12 N 4 O 3 S 0.7 磺胺吡啶 Sulfapyridine SPD 磺胺类 C 11 H 11 N 3 O 2 S , 8.43 磺胺喹喔啉 Sulfaquinoxaline SQX 磺胺类 C 14 H 12 N 4 O 2 S 1.68 四环素 Tetracycline TC 四环素类 C 22 H 24 N 2 O /7.78/9.58 甲氧苄啶 Trimethoprim TMP 其他 C 14 H 18 N 4 O , 6.76 泰勒素 Tylosin TYL 大环内酯类 C 46 H 77 NO 抗生素的环境危害我国在抗生素使用方面缺乏规范性文件, 在人用或兽用抗生素上均存在滥用的情况, 据估计我国每年使用的抗生素达到 16 万吨 [1] 抗生素使用后, 大部分以母体 10

14 或者活性代谢产物随粪便和尿液排出体外, 直接或间接进入环境体系, 对人体健康和生态环境造成潜在的危害 抗生素进入地表水系统 ( 河流 湖泊和近海等 ), 会对水生生物产生不利效应, 如对藻类生长和光合作用 大型溞生长和繁殖能力等方面产生一定的抑制和干扰 除此常规毒性外, 抗生素残留及其引起的细菌耐药性问题已引起国际和国内社会的高度重视, 成为全球性环境与人体健康问题 世界卫生组织将细菌耐药性作为 21 世纪人类面临的最严峻的问题之一, 号召全球共同抑制耐药性的发展, 并于 2015 年提出了全球行动计划, 号召各成员国也制定相应的控制抗生素耐药行动计划 我国也于 2016 年 9 月由 14 个部委联合发布了 遏制细菌耐药国家行动计划, 旨在控制抗生素的使用和抗生素耐药性的传播 2.2 相关环保标准和环保工作的需要 尽管抗生素在自然环境中大量存在, 但是各国目前很少有针对抗生素的排放标准 我国在污水综合排放标准 (GB ) 中, 对制药工业废水最高允许排放量进行了规定, 如生产四环素的企业废水排放不超过为 1900 m 3 /t 但目前对抗生素的其他污染源的废水排放还没有相关排放标准 随着抗生素的环境危害受到越来越多的重视, 以及我国 遏制细菌耐药国家行动计划 的出台, 有必要建立我国水体中抗生素的监测方法和和地表水环境质量等相关标准, 为抗生素的管理提供技术支撑 2.3 现行环境监测分析方法标准的实施情况和存在问题 现行污染物分析方法标准的局限性国内外抗生素的标准检测方法有液相色谱 (LC) 紫外 荧光检测技术 以及 LC 与质谱的联用技术等 由紫外 荧光检测技术的灵敏度低, 对测定结果的精确性和重现性影响较大 污染物分析仪器 设备 方法等的最新进展液相色谱串联质谱 ( 以下简称 LC-MS/MS) 是继气质联用和液质联用以后发展起来的又一新型分离检测技术 其具有分离效率高 分析速度快 灵敏度高 易排除杂质干扰 定性定量精准等众多特点, 非常适合于多组分快速检测 近年来, 国内外众多学者也开始选用 LC-MS/MS 进行各种基质样品中抗生素的分析检测, 灵敏度高, 选择性和特异性较好, 能有效地去除基质的干扰, 定性定量准确 11

15 3. 国内外相关分析方法研究 3.1 主要国家 地区及国际组织相关分析方法研究 抗生素为一类新型污染物, 国内和国际有关抗生素的标准和方法十分有限 当前主要国家 地区和国际组织关于抗生素的标准检测方法详见表 2 表 2 主要国家和地区及国际组织相关标准检测方法方法出处方法号目标化合物前处理分析方法检出限适用范围 中华人民共和国卫生部 GB/T 四环素族抗生素 Mcllvaine 缓冲液提取,C 18 柱净化 微生物管碟法 / 水体和固体 中华人民共和国卫生部 GB/T 抗生素 未处理 微生物抑菌法 / 鲜乳 美国环保署 (USEPA) Method 1694 约 40 种抗生素 HLB 柱固相萃取 LC-MS/MS 0.1~170 ng/l 水体和固体 3.2 本标准与美国 EPA 1694 方法的异同之处 由表 3 可知, 我国目前尚无关于水中抗生素检测的标准方法 在国内的方法中, 一般采用微生物方法定性检测抗生素, 这些方法大都由中华人民共和国卫生部发布 美国 EPA 1694 方法 ( 水 土壤 沉积物和污泥中药物和个人护理品的测定 HPLC/MS/MS 方法 ) 是采用固相萃取结合液相色谱串联质谱法进行水和固体样品中药物和个人护理品 (PPCPs) 的检测 [2] 该方法主要针对 45 种抗生素和其他 29 种药物和个人护理品活性成分的检测, 方法采用 LC-MS/MS 中的多反应监测模式 (MRM) 以提高检测灵敏度, 并从样品保存 内标物选择 固相萃取条件 液相条件 质谱条件以及质控措施等方面进行了大量的验证实验 结果表明, 水相中各目标化合物的检出限 (MDL) 为 0.1~170 ng/l, 对地表水等实际样品的回收率范围在 6% ~ 180% 美国 EPA 方法为指导性文件, 目的为分析不同环境介质中的常见 PPCPs 类化合物提供方法文件 本标准则针对我国水体中抗生素污染严重的特点, 以水环境中常见抗生素为研究对象, 制定环境水体中中抗生素的监测方法标准, 为国家开展抗生素化学品的管理提供支撑 因此, 本标准在制定过程中, 一方面参考了美国 EPA 1694 中样品保存 内标物选择 质控措施等相关研究成果和要求 另一方面, 根据我国 12

16 抗生素的使用情况, 增加我国养殖业常用的兽用抗生素, 建立废水中不同种类抗生素的监测方法标准 在方法优化过程中, 对固相萃取洗脱溶剂 液相分离流动相 质谱条件等重要方面均进行了全新的探索和试验, 建立一套适用于我国水中抗生素同时检测的固相萃取 - 液相色谱 - 串联质谱标准检测方法 4. 标准制修订的基本原则和技术路线 4.1 标准制修订的基本原则 标准在编写过程中满足以下几个原则 : (1) 方法的检出限和测定范围满足相关环保标准和环保工作的要求 (2) 方法准确可靠, 满足各项方法特性指标的要求 (3) 方法具有普遍适用性, 易于推广使用 (4) 按照 GB/T 标准化工作导则第 1 部分 : 标准的结构和编写 GB/T 标准编写规则第 4 部分 : 化学分析方法 和 HJ 环境监测分析方法标准制修订技术导则 的要求编写 4.2 标准的适用范围和主要技术内容 本标准适用于地表水 污水处理厂废水和养殖废水中 32 种抗生素类化合物的测定 通过调节样品 ph 值, 并根据目标组分的化学性质选择合适的固相萃取小柱 合适的乙二胺四乙酸四钠 (Na 4 EDTA) 加入量 洗脱溶剂, 设置合理的上样速度 洗脱体积 洗脱流速等重要参数 通过对液相色谱柱 流动相 梯度分离程序以及质谱中毛细管电压 离子源 锥孔电压 碰撞能量等关键参数进行筛选和调节, 建立合适的液相和质谱方法 固相萃取前处理富集后的样品经 C 18 色谱分析柱分离, 通过 LC-MS/MS 的多重反应监测模式 (MRM) 进行测定, 以实现水体中 32 种抗生素的同时 高效 灵敏 准确的测定 13

17 4.3 标准制修订的技术路线 水中抗生素 固相萃取 样品的 采集和保存 样品固相萃取 前处理方法研究 仪器分析 方法研究 参照文献及相关 标准, 确定采样 与保存技术 优化固相萃取参数 :ph 条件 上样体积和速度 固相萃取小柱类型 洗脱液种类 建立液相色谱 : 流动相 色谱柱 梯度条件建立质谱条件 : 母离子和子离子选取 条件优化 建立水体中抗生素的固相萃取 - 高效液相色谱 - 串联质谱分析方法 实验室内标指标测试 : 标曲 检出限 回收率 方法适用性 研究 选取 3 家具有资质的 实验室进行方法验证 形成广东省地方标准 图 7 本标准制定过程的技术路线 5. 方法研究报告 5.1 方法研究的目标 建立适用于地表水 污市政污水处理厂废水和养殖废水等水体中抗生素测定的 固相萃取 - 高效液相色谱 - 串联质谱法, 实现不同环境水体中痕量抗生素的定量分析 14

18 5.2 方法原理 采集的水样经滤膜过滤除去颗粒物, 过滤后水样经固相萃取小柱对目标污染物进行富集, 固相萃取柱以溶剂洗脱, 经氮气吹干并以混合溶液 ( 甲醇 :0.2% 甲酸和 2 mm 乙酸铵 =30:70 v/v) 重新定容, 达到净化和浓缩目的 以缓冲液 (0.2% 甲酸和 2 mm 乙酸铵 ) 和乙腈为流动相,C 18 反向色谱柱分离, 然后以串联质谱 ESI+ 源进行电离, 多重反应监测 (MRM) 进行分析 根据保留时间和特征离子峰定性, 以 8 种稳定同位素标记物和一种四环素结构类似物为内标, 进行内标法定量 5.3 试剂和材料 实验用水分析时均使用符合国家标准的优级纯试剂, 实验用水为新制备的不含目标物的纯水 本实验室采用空白水进行测试的结果表明, 未检出任何待测目标物 试剂 (1) 甲醇 : 色谱纯 (2) 乙腈 : 色谱纯 (3) 甲酸 : 色谱纯 (4) 乙酸铵 : 色谱纯 (5) 硫酸 :ρ(h 2 SO 4 )=1.84 g/ml, 分析纯 (6)NaOH 溶液 :1.0 mol/l; (7) 硫酸溶液 :4.0 mol/l; (8) 甲酸 - 乙酸铵水 / 甲醇混合液 :0.20% 甲酸 (V/V)-2.0 mmol/l 乙酸铵水溶液 : 甲醇 (7:3, V/V) 标准物质 (1) 本标准中所用的标准物质购于 Dr Ehrenstorfer( 德国 ) Sigma-Aldrich( 美国 ) US Pharmacopoeia( 美国 ) 的有证标准溶液, 为粉末状物质 参照美国 EPA 1694 方法要求 (7.7 节 ) [1], 对于纯度大于 98% 的固体物质, 可直接称量, 无需进行额外的校正 准确称取相应的标准物质, 溶解于甲醇 (5.3.2) 中, 配制成 100 mg/l 的单标储液 对于喹诺酮类抗生素, 则溶于含 0.5% 1.0 mol/l NaOH 的甲醇溶液中 (2) 2.0 mg/l 脱水红霉素单标溶液 : 参照 Xu 等人报道的方法进行制备 [3] 推荐的制备方法为 : 取 400 μl100 mg/l 红霉素储液于 20 ml 棕色瓶中, 加入 19.6 ml 甲醇 (5.3.2), 向其中加入 10 μl 的 4 mol/l 硫酸 (5.3.2) 至 ph 为 3, 于室温静止 4 h 15

19 于 10 下保存 2 个月 (3) 2.0 mg/l 氟喹诺酮类 10 种混标溶液 : 采用 100 mg/l 的氟喹诺酮类单标储液, 以甲醇稀释, 配制混标储液 于 10 下可稳定保存 2 个月 (4) 2.0 mg/l 磺胺类 大环内酯类和四环素类等其他 21 种混标溶液 : 采用 100 mg/l 的氟喹诺酮类单标储液, 以甲醇稀释, 配制混标储液 于 10 下可稳定保存 2 个月 (5) 内标物的选择 : 本实验选用美国 EPA 1694 方法中建议的内标, 并结合文献中报道的常用内标, 最终选取磺胺甲基嘧啶 -d4 磺胺甲噁唑-d4 脱水红霉素-13C-d3 噻苯咪唑 -d4 环丙沙星-d8 甲氧苄啶-d3 林可霉素-d3 磺胺甲嘧啶-13C6 甲氯环素作为内标 标准物质对应的内标见表 3 表 332 种抗生素的英文名称 CAS 号及其对应的内标物质 序号化合物英文名称 CAS 号分子式所属类别内标物质 1 磺胺氯哒嗪 Sulfachloropyridazine C 10 H 9 ClN 4 O 2 S 磺胺类磺胺甲噁唑 -d 4 2 磺胺嘧啶 Sulfadiazine C 10 H 10 N 4 O 2 S 磺胺类磺胺二甲嘧啶 - 13 C 6 3 磺胺二甲氧哒嗪 Sulfadimethoxine C 12 H 14 N 4 O 4 S 磺胺类磺胺甲噁唑 -d 4 4 磺胺甲基嘧啶 Sulfamerazine C 11 H 12 N 4 O 2 S 磺胺类磺胺甲基嘧啶 -d 4 5 磺胺对甲氧嘧啶 Sulfameter C 11 H 12 N 4 O 3 S 磺胺类磺胺二甲嘧啶 - 13 C 6 6 磺胺二甲嘧啶 Sulfamethazine C 12 H 14 N 4 O 2 S 磺胺类磺胺二甲嘧啶 - 13 C 6 7 磺胺甲噁唑 Sulfamethoxazole C 10 H 11 N 3 O 3 S 磺胺类磺胺甲噁唑 -d 4 8 磺胺间甲氧嘧啶 Sulfamonomethoxine C 11 H 12 N 4 O 3 S 磺胺类磺胺甲噁唑 -d 4 9 磺胺吡啶 Sulfapyridine C 11 H 11 N 3 O 2 S 磺胺类磺胺二甲嘧啶 - 13 C 6 10 磺胺喹喔啉 Sulfaquinoxaline C 14 H 12 N 4 O 2 S 磺胺类磺胺甲噁唑 -d 4 11 卡巴多 Carbadox C 11 H 10 N 4 O 4 氟喹诺酮类噻苯咪唑 -d 4 12 环丙沙星 Ciprofloxacin C 17 H 18 FN 3 O 3 氟喹诺酮类环丙沙星 -d 8 13 二氟沙星 Difloxacin C 21 H 19 F 2 N 3 O 3 氟喹诺酮类环丙沙星 -d 8 14 恩诺氟沙星 Enrofloxacin C 19 H 22 FN 3 O 3 氟喹诺酮类环丙沙星 -d 8 15 氟罗沙星 Fleroxacin C 17 H 18 F 3 N 3 O 3 氟喹诺酮类环丙沙星 -d 8 16 罗美沙星 Lomefloxacin C 17 H 19 F 2 N 3 O 3 氟喹诺酮类环丙沙星 -d 8 17 马波沙星 Marbofloxacin C 17 H 19 FN 4 O 4 氟喹诺酮类环丙沙星 -d 8 18 诺氟沙星 Norfloxacin C 16 H 18 FN 3 O 3 氟喹诺酮类环丙沙星 -d 8 19 氧氟沙星 Ofloxacin C 18 H 20 FN 3 O 4 氟喹诺酮类环丙沙星 -d 8 20 沙拉沙星 Sarafloxacin C 20 H 17 F 2 N 3 O 3 氟喹诺酮类环丙沙星 -d 8 21 克拉霉素 Clarithromycin C 38 H 69 NO 13 大环内酯类红霉素 - 13 C-d 3 16

20 序号化合物英文名称 CAS 号分子式所属类别内标物质 22 脱水红霉素 Erythromycin-H 2 O C 37 H 65 NO 12 大环内酯类红霉素 - 13 C-d 3 23 北里霉素 Leucomycin C 39 H 65 NO 14 大环内酯类红霉素 - 13 C-d 3 24 竹桃霉素 Oleandomycin C 35 H 61 NO 12 大环内酯类红霉素 - 13 C-d 3 25 罗红霉素 Roxithromycin C 41 H 76 N 2 O 15 大环内酯类红霉素 - 13 C-d 3 26 泰勒素 Tylosin C 46 H 77 NO 17 大环内酯类红霉素 - 13 C-d 3 27 氯四环素 Chlotetracycline C 22 H 23 ClN 2 O 8 四环素类噻苯咪唑 -d 4 28 强力霉素 Doxycycline C 22 H 24 N 2 O 8 四环素类噻苯咪唑 -d 4 29 氧四环素 Oxytetracycline C 22 H 24 N 2 O 8 四环素类噻苯咪唑 -d 4 30 四环素 Tetracycline C 22 H 24 N 2 O 8 四环素类噻苯咪唑 -d 4 31 林可霉素 Lincomycin C 18 H 34 N 2 O 6 S 其他林可霉素 -d 3 32 甲氧苄啶 Trimethoprim C 14 H 18 N 4 O 3 其他甲氧苄啶 -d 3 我们连续考察了检测序列中内标物的响应值与标准系列中内标物响应值的均值之间偏差 经多次测试, 本实验中对于大部分内标, 两者相对偏差除林可霉素 -d3 以外, 基本可稳定保持在 40% 以内, 说明以各内标作为本实验的内标是稳定可靠的 对于林可霉素 -d 3, 其内标在样品中的响应值降低了 85% 以上, 可能与该化合物在固相萃取时绝对回收率不高有关, 这与 USEPA 1694 方法中林可霉素在水样中的响应值和回收率偏低一致 不过对于水样中林可霉素的检测, 采用同位素标记的内标林可霉素 -d 3, 则可以有效校正林可霉素在前处理过程中的损失, 仍然能够达到有效定量 下面列举部分测试结果, 详见表 4 表 4 样品中各内标物的检测结果 内标物质 样品 1 样品 2 样品 3 样品 4 样品 5 标准系列内标平均相对偏差范响应值 (n=7) 围 (%) 磺胺甲基嘧啶 -d ~25.1 磺胺甲噁唑 -d ~28.1 红霉素 - 13 C-d ~14.4 噻苯咪唑 -d ~27.0 环丙沙星 -d ~22.9 甲氧苄啶 -d ~39.6 林可霉素 -d ~88.7 磺胺二甲嘧啶 - 13 C ~ 实验器皿 本实验过程中, 非定量的玻璃器皿使用前均在 450 的马弗炉中烘烧 4 个小时 ; 17

21 定量用的玻璃器皿清洁干净后, 使用前均用甲醇和丙酮分别冲洗 3 遍, 以确保以去除背景有机物的干扰 实验用气本实验用的普通氮气纯度 (V/V) 99.99%, 其它仪器用高纯气体则按照仪器厂家的纯度要求进行准备 5.4 仪器和设备 本标准编制小组采用型号为 Agilent 1200 系列高压液相色谱串联 6460 QQQ MS/MS 的液质联用仪对方法进行优化, 采用电喷雾离子化源 (ESI) 和多重反应模式 (MRM) 水样前处理设备主要为固相萃取装置 氮吹浓缩装置等 5.5 样品保存和预处理 样品预处理采用孔径为 0.7 μm 的玻璃纤维膜过滤, 再按照 和 5.6 的要求进行样品保存和固相萃取前处理 样品保存条件本标准编制小组建议样品预处理后及时添加 4 mol/l 硫酸, 调节样品最终 ph 为 3 左右, 可抑制水体中微生物对目标组分的降解, 同时添加 5% 的甲醇用来增加目标污染物的溶解性 采集的样品应置于棕色玻璃瓶中, 并于 0~4 冰箱避光冷藏保存 本标准编制小组选择添加浓度为 100 ng/l 的样品, 用硫酸酸化至 ph 为 3 进行保存, 一段时间内进行跟踪检测, 详见表 5 检测结果表明, 样品保存 2 天内绝大部分化合物可保持稳定, 样品浓度在第 4 天时克拉霉素 泰勒素等化合物的质量浓度即出现明显的下降, 超过 30%, 而 2 天时的质量浓度基本保持稳定, 因此样品应在采集后 48 小时内处理完毕 表 5 水体中抗生素加标 ng/l 的样品检测结果 不同样品保存时间下的抗生素的加标检测 ( 平均值 ± 标准偏差 ) 化合物名称 0 天 1 天 2 天 4 天 9 天 14 天 卡巴多 92.7± ± ± ± ± ±3.98 氯四环素 108± ± ± ± ± ±12.2 环丙沙星 103± ± ± ± ± ±3.11 克拉霉素 96.4± ± ± ± ± ±1.91 二氟沙星 129± ± ± ± ± ±19.7 强力霉素 139± ± ± ± ± ±

22 不同样品保存时间下的抗生素的加标检测 ( 平均值 ± 标准偏差 ) 化合物名称 0 天 1 天 2 天 4 天 9 天 14 天 恩诺氟沙星 196± ± ± ± ± ±9.74 脱水红霉素 114± ± ± ± ± ±2.88 氟罗沙星 146± ± ± ± ± ±5.62 北里霉素 142.7± ± ± ± ± ±4.23 林可霉素 90.3± ± ± ± ± ±5.83 罗美沙星 185± ± ± ± ± ±21.1 马波沙星 88.4± ± ± ± ± ±9.16 诺氟沙星 80.3± ± ± ± ± ±5.78 氧氟沙星 165± ± ± ± ± ±7.27 竹桃霉素 103± ± ± ± ± ±2.47 氧四环素 123± ± ± ± ± ±11.8 罗红霉素 122± ± ± ± ± ±2.37 沙拉沙星 82.7± ± ± ± ± ±18.1 磺胺氯哒嗪 111± ± ± ± ± ±3.1 磺胺嘧啶 137± ± ± ± ± ±1.48 磺胺二甲氧哒嗪 89.1± ± ± ± ± ±2.05 磺胺甲基嘧啶 91.4± ± ± ± ± ±1.97 磺胺对甲氧嘧啶 98.8± ± ± ± ± ±0.15 磺胺二甲嘧啶 98.0± ± ± ± ± ±0.93 磺胺甲噁唑 82.3± ± ± ± ± ±1.95 磺胺间甲氧嘧啶 96.3± ± ± ± ± ±0.75 磺胺吡啶 73.9± ± ± ± ± ±1.25 磺胺喹喔啉 90.7± ± ± ± ± ±1.90 四环素 122± ± ± ± ± ±6.87 甲氧苄啶 101± ± ± ± ± ±0.99 泰勒素 141± ± ± ± ± ± 固相萃取和仪器分析步骤 固相萃取条件选择 本标准中涉及的目标抗生素的理化性质差异明显, 同步提取具有一定的难度 根据已有的报道, 采用 HLB 柱富集和净化抗生素是最常用的方法, 涉及的抗生素类 别主要有磺胺类 [4,5] 喹诺酮类 [4] 磺胺类增效剂 [4] 四环素类 [6] [7] 大环内酯类林可 霉素类 [8] 因此, 本标准在优化过程直接选用 HLB 柱富集和净化水体中抗生素 固相萃取 (SPE) 过程主要优化了水样 ph 值 (3 和 7) 洗脱溶剂 ( 甲醇和含有 0.1% 甲酸的甲醇 ) 和 Na 4 EDTA 添加量 (0.5 g 和 1 g) 等条件 19

23 各条件下的回收率数据结果见表 6 总体而言, 在 ph 3 条件 ( 添加 0.5 g Na 4 EDTA, 甲醇洗脱 ) 下共有绝大部分目标化合物在 50%~150% 范围内 因此, 选取 ph 3+0.5gNa 4 EDTA+ 甲醇洗脱作为水体中固相萃取富集净化抗生素的最优条件 表 6 水体中抗生素在不同固相萃取条件下的回收率 化合物 ph 3 a ph7 b 0.1% 甲酸甲 醇洗脱液 Na 4 EDTA Na 4 EDTA 0.5 g d 1 g e 磺胺类 SCP 74±5 70±4 79±13 66±2 70±1 SDM 64±6 65±2 72±1 67±2 63±1 SDZ 129±6 123±10 114±8 124±3 132±6 SM 102±5 98±3 120±5 105±4 98±0.5 SMM 71±2 78±7 74±5 68±3 62±10 SMR 109±2 87±2 106±2 110±5 106±4 SMX 90±1 79±1 93±1 82±3 82±1 SMZ 95±8 119±9 90±4 88±8 92±4 SPD 82±2 78±3 82±0.5 81±3 83±0.6 SQX 65±2 66±1 73±5 70±3 72±4 氟喹诺酮类 CAR 84±2 88±3 85±3 83±3 84±5 CFX 95±1 113±4 102±2 86±3 102±1 DIF 56±2 129±7 57±3 52±8 76±4 EFX 200±6 427±20 206±7 187±29 269±15 FL 87± ±9 86±0.2 78±9 110±2 LFX 75±3 166±7 73±2 69±10 100±5 MAR 108±2 263±13 109±5 102±16 141±5 NFX 98±3 102±1 107±3 81±8 98±1 OFX 101±4 267±6 99±2 92±15 137±4 SAR 53±3 52±1 58±4 51±5 10±1 四环素类 CTC 95±5 65±10 95±7 147±7 108±2 DC 96±5 126±7 131±10 132±8 137±4 OTC 168±19 40±3 203±15 193±9 210±10 TC 78±5 50±8 88±9 109±5 94±7 大环内酯类 CTM 82±2 78±3 91±5 81±3 82±2 ETM-H 2 O 119±13 85±3 94±4 95±3 108±6 LCM 137±3 115±3 152±3 135±2 136±2 ODM 186±2 195±2 217±5 184±3 192±2 RTM 142±4 149±3 156±6 136±5 142±5 TYL 115±2 134± ±1 146±2 148±1 其他 OMP 111± ±1 121±3 112±2 112±1 TMP 103±1 97± ±1 103± ±0.5 LIN 123±9 92±3 149±9 114±7 138±3 20

24 5.6.2 仪器分析方法条件优化本实验中采用 Agilent SB-C 18 色谱柱为分析柱, 各组分均获得了良好的分离效果 由于电喷雾质谱的电离是在溶液状态下进行的, 因此流动相的组成和配比不但影响目标化合物的色谱行为, 而且影响目标化合物的离子化效率, 从而影响灵敏度 仪器条件优化主要是针对 32 种抗生素在不同环境基质 ( 地表水 污水处理厂废水 养殖场废水 ) 中的仪器测试方法 32 种目标化合物包括磺胺类 四环素类 喹诺酮类 大环内酯类 林可霉素类 磺胺类增效剂等 正模式下, 选用乙腈作为有机相 ; 为了最大程度地获取较好的抗生素峰型和灵敏度, 水相流动相尝试了 5 mm 草酸 0.1% 甲酸 0.5% 甲酸 0.1% 甲酸和 5 mm 乙酸胺 0.1% 甲酸和 2 mm 乙酸胺 0.2% 甲酸和 2 mm 乙酸胺 四环素类抗生素在草酸条件下可以产生较好的灵敏度 分离度 重复性和较低的基质效应, 这可能于草酸能够络合色谱柱及样品中的重金属有关 [9] 然而, 草酸不利于挥发, 很容易在液相色谱串联质谱 (LC-MS/MS) 毛细管端口累积, 堵塞毛细管, 因此不建议使用 0.2% 甲酸和 2 mm 乙酸胺作为水相流动相时, 喹诺酮类 离子载体类和大环内酯类抗生素可以获取较好的分离度和灵敏度, 四环素类抗生素也可以获得可以接受的灵敏度 因此, 仪器流动相最终选取乙腈 ( 有机相 ) 和 0.2% 甲酸和 2 mm 乙酸胺 ( 水相 ) 为了更好地分离多种抗生素并获取满意的峰型, 实验过程中在正模式条件下尝试多种色谱柱 Agilent Zorbax SB-C 18 column (100 mm 3 mm, 1.8 μm) 在乙腈 ( 有机相 ) 和 0.2% 甲酸和 5 mm 乙酸铵 ( 水相 ) 流动相条件下, 可以满足除四环素类之外的其他抗生素的分离 对于四环素类抗生素而言,Agilent Zorbax Eclipse Plus C 18 column(100 mm 3 mm, 1.8 μm; 100 mm 2.1 mm, 1.8 μm; doubly end-capped) 相对于 Agilent Zorbax SB-C 18 columns (100 mm 3 mm, 1.8 μm; and 50 mm 2.1 mm, 1.8 μm) 和 Agilent Zorbax XDB column(50 mm 2.1 mm, 1.8 μm) 可以获取更好的峰型和灵敏度 ; 特别是 Agilent Zorbax Eclipse Plus C 18 column(100 mm 2.1 mm, 1.8 μm) 相对于 Agilent Zorbax Eclipse Plus C 18 column(100 mm 3.0 mm, 1.8 μm) 柱效更高, 可以获得更窄的峰型, 更高的灵敏度和更好的线性 实验过程中发现, 较短的保留时间 (<4 min) 可以完全消除四环素类的拖尾问题, 但快速出峰过程中大量杂质同步进入离子源, 造成严重的基质干扰 因此, 实验过程中, 综合考虑峰型及目标化合物和杂质的分离情况, 设定浓度梯度 四环素类抗生素在硅胶柱上进行分离时容易出现拖尾和分离度及灵敏度差的情况, 主要是因为四环素类抗生素容易与金属离子和硅醇基团发生络合 [10] 合适的填料和较高的柱效可以有效地减少四环素类的吸附, 获得较好的峰型 线性和重现性 基于实验结果,Agilent Zorbax eclipse plus C 18 column (100 21

25 mm 2.1 mm, 1.8 μm) 最终用于抗生素的分离 最终优化后的液相色谱条件为 : 色谱柱为 C 18 柱 (100 mm 2.1 mm, 1.8 μm) 或等效色谱柱, 在色谱柱前段连接在线过滤器, 以去除流动相和样品中细小颗粒物 流动相流速为 0.3 ml/min; 柱温箱的温度设为 40, 进样量为 5 µl 流动相为缓冲液 (0.2% 甲酸和 2 mmol/l 乙酸铵 )(A) 和乙腈 (B), 梯度洗脱程序如下 :0 min10% B,5 min15% B,7 min20% B,11 min40% B,15 min60% B,16 min95% B,25 min95% B 流动相的流速为 0.3 ml/min 抗生素标准样品的总离子流图见图 8, 提取离子流图见标准文本附录 F 图 8 目标抗生素的总离子流图对于质谱分析, 采用 Agilent 公司的 Optimizer 软件对碰撞能 碎裂电压 母离子和子离子进行优化, 结果见表 7 质谱参考条件设为: 干燥气温度和流速为 325 和 6 ml/min; 雾化器压力 45 psi; 鞘气温度和流速为 350 和 11 L/min; 毛细管电压和喷嘴电压分别为 3500 V 和 0 V 正模式下, 目标化合物的母离子均为 [M+H] + 表 732 种抗生素的质谱条件 化合物 保留时间 /min 母离子 (m/z) 子离子 (m/z) a 碎裂电压 /V 碰撞能 /ev 相对丰度 /% b 磺胺嘧啶 林可霉素 磺胺吡啶

26 化合物 保留时间 /min 母离子 (m/z) 子离子 (m/z) a 23 碎裂电压 /V 碰撞能 /ev 相对丰度 磺胺甲基嘧啶 甲氧苄啶 马波沙星 卡巴多 氟罗沙星 氧四环素 诺氟沙星 氧氟沙星 磺胺二甲嘧啶 环丙沙星 磺胺对甲氧嘧啶 四环素 罗美沙星 恩诺氟沙星 磺胺间甲氧嘧啶 磺胺氯哒嗪 沙拉沙星 二氟沙星 磺胺甲噁唑 氯四环素 强力霉素 磺胺二甲氧哒嗪 磺胺喹喔啉 北里霉素 泰勒素 脱水红霉素 克拉霉素 /% b

27 化合物 保留时间 /min 母离子 (m/z) 罗红霉素 竹桃霉素 林可霉素 -d 噻苯咪唑 -d 磺胺甲基嘧啶 -d 甲氧苄啶 -d 磺胺二甲嘧啶 -13C 环丙沙星 -d 磺胺甲噁唑 -d 红霉素 -13C-d 子离子 (m/z) a 碎裂电压 /V 碰撞能 /ev 注 : 对于不同的质谱仪器, 仪器参数可能存在差异, 测定前应将质谱参数优化到最佳 相对丰度 /% b a 上面的离子为定量离子 a 相对丰度 =( 定性离子峰面积 / 定量离子峰面积百分比 )*100 1) 非商业性声明 : 附录 D 所列参考质谱条件是在 Agilent QQQ 6460 质谱仪上完成的, 此处列出试验用仪器型号仅 为提供参考, 并不涉及商业目的, 鼓励标准使用者尝试不同厂家型号的仪器 标准曲线配制浓度依次为 1.00μg/L 5.00μg/L 10.0μg/L 50.0μg/L 100μg/L 200μg/L 的抗生素类标准工作液系列 ( 此为参考浓度序列 ) 在该浓度范围内 32 种化合物的相关系数 (R) 均大于 0.99, 如表 8 所示 表 832 种抗生素类化合物的标准曲线线性方程 线性范围和相关系数 序号 化合物 英文简写 线性方程 线性范围 (μg/l) 相关系数 R 1 磺胺氯哒嗪 SCP Y=0.041*X ~ 磺胺嘧啶 SDZ Y=0.9589*X ~ 磺胺二甲氧哒嗪 SDM Y=5.1646*X ~ 磺胺甲基嘧啶 SMR Y=1.2650*X ~ 磺胺对甲氧嘧啶 SM Y=0.8916*X ~ 磺胺二甲嘧啶 SMZ Y=0.969*X ~ 磺胺甲噁唑 SMX Y=1.2291*X ~ 磺胺间甲氧嘧啶 SMM Y=1.4984*X ~

28 序号 化合物 英文简写 线性方程 线性范围 (μg/l) 相关系数 R 9 磺胺吡啶 SPD Y=1.3936*X ~ 磺胺喹喔啉 SQX Y=1.0431*X ~ 卡巴多 CAR Y=0.0372*X ~ 环丙沙星 CFX Y=0.7658*X ~ 二氟沙星 DIF Y=0.4334*X ~ 恩诺氟沙星 EFX Y=0.6746*X ~ 氟罗沙星 FL Y=0.7285*X ~ 罗美沙星 LFX Y=0.4732*X ~ 马波沙星 MAR Y=1.1089*X ~ 诺氟沙星 NFX Y=0.8205*X ~ 氧氟沙星 OFX Y=0.8419*X ~ 沙拉沙星 SAR Y=0.5342*X ~ 克拉霉素 CTM Y=0.2178*X ~ 脱水红霉素 ETM-H2O Y=0.8121*X ~ 北里霉素 LCM Y=0.7963*X ~ 竹桃霉素 ODM Y=2.7367*X ~ 罗红霉素 RTM Y=0.1153*X ~ 泰勒素 TYL Y=0.4593*X ~ 氯四环素 CTC Y=0.3323*X ~ 强力霉素 DC Y=1.1960*X ~ 氧四环素 OTC Y=0.4481*X ~ 四环素 TC Y=1.022*X ~ 林可霉素 LIN Y=7.2965*X ~ 甲氧苄啶 TMP Y=0.8864*X ~ 实验室空白测试 (LRB) 参照 EPA 1694 方法的要求, 为保证实验用水 试剂 器具以及检测过程中所接触的仪器设备各部件不会对样品测试带来干扰和影响, 本实验以纯水为样品, 配制 6 份实验室空白平行样品, 经固相萃取处理后上机测试, 未发现实验室空白中含有任何抗生素 方法检出限 方法检出限确定按照 HJ 标准中空白实验中未检出目标物质的检出限测定方法, 依据仪器灵敏度情况, 本实验分别对流溪河水库水 ( 地表水 ) 污水处理厂废水 养殖场废水加标, 加标浓度为 10.0 ng/l, 样品体积为 1000 ml 每种类型配制 7 份平行模拟水样, 经固相萃取全过程分析, 数据结果见表 9-11 地表水方法的检出限范围为 0.4ng/L~3.0 ng/l, 测定下限范围为 1.7ng/L~12ng/L; 污水处理厂废水的方法的检出 25

29 限范围为 0.9 ng/l~9.3 ng/l, 测定下限范围为 3.6 ng/l~37 ng/l; 养殖场废水的方法的检出限范围为 0.4 ng/l~11 ng/l, 测定下限范围为 1.5 ng/l~44 ng/l 表 9 地表水添加浓度 (10.0 ng/l) 方法检出限 测定下限计算结果 抗生素 10.0 ng/l 加标量 平均值 SD 检出限 测定下限 简写 ng/l CAR CTC CFX CTM DIF DC EFX ETM-H 2 O FL LCM LIN LFX MAR NFX OFX ODM OTC RTM SAR SCP SDZ SDM SMR SM SMZ SMX SMM SPD SQX TC TMP TYL * 具有本底值的化合物 :EFX ETM-H 2 O OFX ODM SMM 低于测定下限 ;OTC 为 28.0 ng/l,lin 为 8.93 ng/l 26

30 抗生素简写 表 10 城市污水处理厂废水添加浓度 (10.0 ng/l) 方法检出限 测定下限计算结果 10.0 ng/l 加标量 * 平均值 SD 检出限测定下限 ng/l CAR CTC CFX CTM DIF DC EFX ETM-H 2 O FL LCM LIN LFX MAR NFX OFX ODM OTC RTM SAR SCP SDZ SDM SMR SM SMZ SMX SMM SPD SQX TC TMP TYL *CTC ETM-H 2 O LIN OTC SMX SMM TC TMP 具有本底值 27

31 表 11 养殖场废水添加浓度 (10.0 ng/l) 方法检出限 测定下限计算结果 抗生素 10.0 ng/l 加标量 * 平均值 SD 检出限 测定下限 简写 ng/l CAR CTC CFX CTM DIF DC EFX ETM-H 2 O FL LCM LIN LFX MAR NFX OFX ODM OTC RTM SAR SCP SDZ SDM SMR SM SMZ SMX SMM SPD SQX TC TMP TYL * CTC CFX EFX ETM-H 2 O LCM LIN MAR OFX OTC SCP SDZ SMZ SMM TC TMP 具有本底值 28

32 5.6.6 方法精密度精密度是对三个浓度水平分别为 10.0 ng/l 100 ng/l 200 ng/l 的流溪河加标水样进行了精密度测试 ( 见表 12- 表 14), 每个浓度水平配制 7 份平行样品, 经全过程固相萃取和仪器分析 从表中可以看出, 不同浓度的水库水加标水样, 测试的相对标准偏差 (RSD)10.0 ng/l 100 ng/l 200 ng/l 分别为 1.75%~9.05% 0.75%~15.7%, 0.47%~18.5%, 说明方法的精密度良好 表 12 添加浓度 (10.0 ng/l) 低浓度空白基体加标测定精密度数据 抗生素 10.0 ng/l 加标量 平均值 SD RSD 简写 ng/l CAR CTC CFX CTM DIF DC EFX ETM-H 2 O FL LCM LIN LFX MAR NFX OFX ODM OTC RTM SAR SCP SDZ SDM SMR SM SMZ SMX SMM SPD SQX

33 抗生素 10.0 ng/l 加标量 平均值 SD RSD 简写 ng/l TC TMP TYL * 具有本底值的化合物 :EFX ETM-H 2 O OFX ODM SMM 低于测定下限 ;OTC 为 28.0 ng/l,lin 为 8.93 ng/l 表 13 添加浓度 (100 ng/l) 中浓度空白基体加标测定精密度数据 抗生素 100 ng/l 加标量 平均值 SD RSD 简写 ng/l CAR CTC CFX CTM DIF DC EFX ETM-H 2 O FL LCM LIN LFX MAR NFX OFX ODM OTC RTM SAR SCP SDZ SDM SMR SM SMZ SMX SMM SPD SQX TC TMP

34 抗生素 100 ng/l 加标量 平均值 SD RSD 简写 ng/l TYL * 具有本底值的化合物 :EFX ETM-H 2 O OFX ODM SMM 低于测定下限 ;OTC 为 28.0 ng/l,lin 为 8.93 ng/l 表 14 添加浓度 (200 ng/l) 高浓度空白基体加标测定精密度数据 抗生素 200 ng/l 加标量 平均值 SD RSD 简写 ng/l CAR CTC CFX CTM DIF DC EFX ETM-H 2 O FL LCM LIN LFX MAR NFX OFX ODM OTC RTM SAR SCP SDZ SDM SMR SM SMZ SMX SMM SPD SQX TC TMP TYL * 具有本底值的化合物 :EFX ETM-H 2 O OFX ODM SMM 低于测定下限 ;OTC 为 28.0 ng/l,lin 为 8.93 ng/l 31

35 5.6.7 方法准确度对三个浓度水平分别为 10.0 ng/l 100 ng/l 200 ng/l 的流溪河水库加标水样进行了准确度测试 ( 见表 15-17), 每个浓度水平配制 7 份平行样品, 经全过程分析 在 32 种抗生素中, 有 7 种抗生素在流溪河水库样品中具有本底值, 其中恩诺氟沙星 (EFX) 脱水红霉素(ETM-H 2 O) 竹桃霉素(ODM) 氧四环素(OTC) 磺胺间甲氧嘧啶 (SMM) 低于相应的测定下限, 林可霉素 (LIN) 为 8.93 ng/l, 氧四环素 (OTC) 为 28.0 ng/l 因此加标后所测结果为减去本底值的数据 从表中可以看出, 对于 10 ng/l 加标浓度的水样, 测试的相对误差为 1.10%~48.7%; 对于 100 ng/l 加标浓度的水样, 测试的相对误差为 0.43%~72.7%; 对于 200 ng/l 加标浓度的水样, 测试的相对误差为 3.52%~63.2% 总体上, 在 3 个加标浓度中,75% 的化合物的相对误差 <30%, 说明方法准确度对于绝大部分化合物较好 相对误差比较大的物质为罗美沙星 (LFX) 诺氟沙星 (NFX) 恩诺氟沙星 (EFX) 罗红霉素 (RTM) 磺胺喹喔啉 (SQX) 四环素(TC) 强力霉素(DC) 氧四环素(OTC) 泰勒素(TYL), 这与它们没有对应的同位素内标有一定的关系, 当采用相似结构的化合物同位素标记物为内标时, 仍不可避免产生较大的偏差 表 15 添加浓度 (10.0ng/L) 低浓度空白基体加标测定准确度数据 抗生素 10.0 ng/l 加标量 平均值 加标值 相对误差 简写 ng/l ng/l % CAR CTC CFX CTM DIF DC EFX ETM-H 2 O FL LCM LIN LFX MAR NFX OFX ODM OTC

36 抗生素 10.0 ng/l 加标量 平均值 加标值 相对误差 简写 ng/l ng/l % RTM SAR SCP SDZ SDM SMR SM SMZ SMX SMM SPD SQX TC TMP TYL 注 : 数据为去除本底值 具有本底值的化合物 :EFX ETM-H 2 O OFX ODM SMM 低于测定下限 ;OTC 为 28.0 ng/l,lin 为 8.93 ng/l 表 16 添加浓度 (100ng/L) 中浓度空白基体加标测定准确度数据 抗生素 100 ng/l 加标量 平均值 加标值 相对误差 简写 ng/l ng/l % CAR CTC CFX CTM DIF DC EFX ETM-H 2 O FL LCM LIN LFX MAR NFX OFX ODM OTC RTM

37 抗生素 100 ng/l 加标量 平均值 加标值 相对误差 简写 ng/l ng/l % SAR SCP SDZ SDM SMR SM SMZ SMX SMM SPD SQX TC TMP TYL 注 : 数据为去除本底值 具有本底值的化合物 :EFX ETM-H 2 O OFX ODM SMM 低于测定下限 ;OTC 为 28.0 ng/l,lin 为 8.93 ng/l 表 17 添加浓度 (200ng/L) 高浓度空白基体加标测定准确度数据 抗生素 ng/l 加标量 平均值 加标值 相对误差 简写 ng/l ng/l % CAR CTC CFX CTM DIF DC EFX ETM-H 2 O FL LCM LIN LFX MAR NFX OFX ODM OTC RTM SAR SCP

38 抗生素 ng/l 加标量 平均值 加标值 相对误差 简写 ng/l ng/l % SDZ SDM SMR SM SMZ SMX SMM SPD SQX TC TMP TYL 注 : 数据为去除本底值 具有本底值的化合物 :EFX ETM-H 2 O OFX ODM SMM 低于测定下限 ;OTC 为 28.0 ng/l,lin 为 8.93 ng/l 5.7 方法适用性 对两个浓度的河水 污水处理厂废水和养殖废水进行加标回收实验, 其中地表水和污水处理厂废水 2 个加标浓度分别为 10.0 ng/l 和 100 ng/l; 养殖场废水 2 个加标浓度分别为 50.0 ng/l 和 100 ng/l 每个加标浓度平行配制 7 份水样, 其平均值 标准偏差和加标回收率结果见表 18~ 表 20 从表中看出, 河流中 16 种抗生素检测到本底值, 两个浓度的加标回收率为 41.5%~173%, 其中 70.3% 的化合物回收率为 70% ~ 130%; 污水处理厂出水中 8 种化合物具有本底值, 两个浓度的加标回收率为 46.6% ~ 196%, 其中 64.1% 的化合物回收率为 70% ~ 130%; 养殖场废水中 16 种化合物具有本底值, 加标回收率在 57.6% ~ 187%, 其中 73.4% 的化合物回收率为 70% ~ 130% 因此, 整体上来说绝大部分化合物的准确度良好, 满足检测要求 表 18 添加浓度 (10.0 ng/l 和 100 ng/l) 的河水样品加标测定准确度数据 本底 (n=3) 加标 10.0ng/L 扣除本底 * 加标 100ng/L 扣除本底 * 抗生素平均值 ng/l 标准偏差平均值 ng/l 标准偏差回收率 % 平均值 ng/l 标准偏差回收率 % 简写 ng/l ng/l ng/l CAR CTC CFX CTM DIF DC

39 本底 (n=3) 加标 10.0ng/L 扣除本底 * 加标 100ng/L 扣除本底 * 抗生素平均值 ng/l 标准偏差平均值 ng/l 标准偏差回收率 % 平均值 ng/l 标准偏差回收率 % 简写 ng/l ng/l ng/l EFX < 测定下限 ETM-H 2 O FL < 测定下限 LCM LIN LFX MAR NFX < 测定下限 OFX ODM OTC RTM < 测定下限 SAR SCP < 测定下限 SDZ SDM SMR < 测定下限 SM SMZ SMX < 测定下限 SMM SPD SQX TC TMP TYL * 注 : 为扣除本底值 表 19 添加浓度 (10.0 ng/l 和 100 ng/l) 的污水处理厂废水样品加标测定准确度数据 本底 (n=3) 加标 10.0ng/L 扣除本底 * 加标 100ng/L 扣除本底 * 抗生素平均值 ng/l 标准偏差平均值 ng/l 标准偏差回收率 % 平均值 ng/l 标准偏差回收率 % 简写 ng/l ng/l ng/l CAR CTC < 测定下限 CFX CTM DIF DC EFX

40 本底 (n=3) 加标 10.0ng/L 扣除本底 * 加标 100ng/L 扣除本底 * 抗生素平均值 ng/l 标准偏差平均值 ng/l 标准偏差回收率 % 平均值 ng/l 标准偏差回收率 % 简写 ng/l ng/l ng/l ETM-H 2 O FL LCM LIN < 测定下限 LFX MAR NFX OFX ODM OTC RTM SAR SCP SDZ SDM SMR SM SMZ SMX < 测定下限 SMM < 测定下限 SPD SQX TC < 测定下限 TMP < 测定下限 TYL * 注 : 为扣除本底值 表 20 添加浓度 (50.0 ng/l 和 100 ng/l) 的养殖场废水样品加标测定准确度数据 本底 (n=3) 加标 50.0ng/L 扣除本底 * 加标 100ng/L 扣除本底 * 抗生素平均值 ng/l 标准偏差平均值 ng/l 标准偏差回收率 % 平均值 ng/l 标准偏差回收率 % 简写 ng/l ng/l ng/l CAR CTC < 测定下限 CFX < 测定下限 CTM DIF DC EFX < 测定下限 ETM-H 2 O < 测定下限

41 抗生素 简写 本底 (n=3) 加标 50.0ng/L 扣除本底 * 加标 100ng/L 扣除本底 * 平均值 ng/l 标准偏差 ng/l 平均值 ng/l 标准偏差 ng/l 回收率 % 平均值 ng/l 标准偏差 ng/l 回收率 % FL LCM < 测定下限 LIN LFX MAR < 测定下限 NFX OFX < 测定下限 ODM OTC RTM SAR SCP SDZ SDM SMR SM SMZ < 测定下限 SMX SMM SPD SQX TC TMP < 测定下限 TYL * 注 : 为扣除本底值 5.8 结果计算和表示 定性分析 [11] 参照文献每种目标化合物选择 1 个母离子和 1~2 个子离子进行监测 在相同 的实验条件下, 标准样品中色谱峰的保留时间和待分析样品中响应峰的保留时间, 应满足两者的相对保留时间 (RRT) 在 2.5% 的误差范围内 各组分定性离子与标准溶液谱图中对应的定性离子相对丰度 (K), 偏差不超过 表 21 规定的范围, 则可判定为样品中存在对应的目标组分 38