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娇凌
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1 第 52 卷第 5 期厦门大学学报 ( 自然科学版 ) Vol.52 No 年 9 月 JournalofXiamenUniversity (NaturalScience) Sep.2013 doi: /j.issn 海水中多种类兽药残留测定准确度的评价和改善方法洪家俊 1, 陈秋兰 2, 易启同 1, 陈猛 1*, 袁东星 1 (1. 厦门大学环境与生态学院, 福建省海陆界面生态环境重点实验室, 福建厦门 ; 2. 泉州市环境监测站, 福建泉州 ) 摘要 : 海水中兽药多残留分析时, 基质效应会对测定准确度产生较大影响. 以反渗透水为空白对照,LC-MS/MS 检测, 在 500 倍浓缩条件下, 评价了 3 种常用亲水 - 亲油平衡 (hydrophile-lyophilebalance,hlb) 固相萃取柱 (Waters Supelco 和安谱 ) 对海水中 35 种兽药的基质效应和保留效果. 研究发现 : 反渗透水实验中 3 种 HLB 柱表现出柱填料的外源性基质效应, 喹诺酮类和四环素类兽药呈现基质正效应, 雌激素类等呈现基质负效应, 磺胺类和氯霉素类兽药基质效应不显著. 海水基质实验中由于外源性杂质与内源性杂质共同作用, 大部分喹诺酮类和四环素类兽药呈现基质正效应, 氯霉素类和雌激素类呈现基质负效应, 磺胺类兽药基质效应不显著. 与外标法相比较, 基质匹配标准校正法可有效消除基质效应. 在 50 和 200ng/L 两个加标质量浓度下,3 种 HLB 柱对海水中 35 种目标兽药校正后的回收率分别为 26.8% ~147.8% (Waters) 60.4%~159.3%(Supelco) 和 52.0%~112.1%( 安谱 ); 两个加标浓度的相对标准偏差 (RSD)(n=4) 在 0.1% ~11.1%. 结果表明, 相同实验条件下,3 种 HLB 柱的基质效应不容忽视, 采用基质匹配标准校正法可以有效克服基质效应, 为海水样品中兽药多残留分析方法准确度的改善提供了参考数据. 关键词 : 兽药 ; 海水 ; 测定准确度 ; 亲水 - 亲油平衡 (HLB); 基质效应中图分类号 : X131.2 文献标志码 : A 文章编号 : (2013) 随着禽畜和水产养殖业的发展, 大量使用的兽药相当一部分通过直接投药废水排放和地表冲刷等多种途径进入水体, 影响环境健康和生态安全. 在环境水样兽药多残留的分析方法中, 固相萃取 (solidphase extraction,spe) 由于具有萃取 / 富集能力强简单快速重现性好样品和有机溶剂用量少易于批量处理等优点而被广泛应用 [1-3], 主要柱型有 C18 柱 [4] 亲水 - 亲油平衡 (hydrophile-lyophilebalance,hlb) 柱 [1,5] [2] [6] 离子交换柱及混合相 SPE 柱等. 由于兽药极性普遍较强,C18 柱离子交换柱和混合相 SPE 柱在同时富集水中多种类兽药时均表现出一定的局限性 ; 以 N- 乙烯基吡咯烷酮 - 二乙烯基苯共聚物为填料的 HLB 柱则由于同时具有亲水性与亲脂性基团, 可以保留多种 [7-8] 极性差异较大的化合物而得到广泛应用. 目前市售的 HLB 柱品牌主要有美国 Waters 公司生产的 Oasis HLB 美国 Supelco 公司生产的 Supel-SelectHLB 和上海安谱公司生产的 CNW PolȳSery HLB. 高立红 [9] [10] [5] 等孙广大等和 Reverte 等采用 Waters 公司生产的 HLB 柱对河水和海水中的多种类兽药进行富 [11] 集 ; 洪蕾洁等则采用上海安谱公司生产的 CNW HLB 柱对河水中的 10 种磺胺类兽药进行富集. 在使用液相色谱 - 串联质谱联用 (liquidchromatographȳtandem massspectrometry,lc-ms/ms) 技术进行兽药多残留检测时 [12-13],SPE 柱填料及基质带来内源性和外源性干扰物质可能使目标物电离过程受到抑制或促 [14] 进, 由此产生的基底效应会严重影响到测定准确度. 本文选择 8 类 35 种常见兽药, 以反渗透水 (reverseosmosis) 为空白对照, 厦门近岸海水为实际基质, 考察并比较了 500mg 填料量的美国 Waters 公司 OasisHLB 美国 Supelco 公司 Supel-SelectHLB 和上海安谱公司 CNW Polȳ SeryHLB 柱对目标兽药的基质效应保留效果及其改善方法以相对标准偏差 (RSD) 考察其重现性, 为海水样品中兽药多残留分析方法准确度的改善提供了参考数据. 收稿日期 : 基金项目 : 福建省自然科学基金项目 (2012J01048); 中国科学院城市环境研究所开放基金 (KLUEH201009) * 通信作者 :mengchen@xmu.edu.cn 1 实验部分 1.1 仪器与试剂液相色谱 - 质谱联用仪 :Agilent6410TripleQuad

2 676 厦门大学学报 ( 自然科学版 ) 2013 年 LC-MS/MS(Agilent,USA), 包括 Agilent1260 液相色谱系统和电喷雾电离源 (ESI). 色谱分离柱为 100 mm 3 mm 2.6 μm 粒径的 Phenomenex Kinetex C18(phenomenex,USA). PHB-10/e-301 型笔式 ph 计 ( 上海康仪仪器有限公司 );YP202N 电子天平 ( 上海精密科学仪器有限公司 );12 通道 SPE 装置 (Supelco,USA);SK-1 型快速混匀器 ( 金坛市富华仪器有限公司 );GM-0.33 型真空泵 0.22μm 亲水性聚偏二氟乙烯 (PVDF) 过滤器 0.45μm 醋酸纤维膜溶剂过滤器均购自天津津腾实验设备有限公司. SPE 柱 :500 mg/6 ml Oasis HLB (Waters, USA);500 mg/12 ml Supel-Select HLB(Supelco, USA);500mg/6mLCNW PolȳSery HLB( 安谱, 中国上海 ).3 种 HLB 柱填料的主要的理化参数见表 1. 表 1 3 种 HLB 柱的理化参数 Tab.1 Physicalandchemicalparametersof3 HLBcartridges 相关理化参数 Waters Supelco 安谱填料量 (mg) 柱容量 (ml) 平均粒径 ( μ m) 50.0~ ~60 60 平均孔径 (nm) 730~ 平均孔隙体积 (cm 3 /g) 1.18~ 平均比表面积 (m 2 /g) 727~ ~ 质谱友好型是是适用 ph 范围 1~14 1~14 溶剂 : 乙腈 (Tedia,USA) 甲醇 (Tedia,USA) 和甲酸 (Fluka,USA) 均为色谱纯.Na2EDTA( 上海申博化工有限公司 ) 为分析纯. 甲醇与超纯水以 1 4 的体积比混合后再添加甲酸至 0.1%( 体积分数 ) 作为样品的定容溶剂. 实验用水均为超纯水, 取自 Mili-Q 纯水机 (Milipore, Bedford,MA,USA). 目标兽药标准品 : 甲砜霉素 (thiamphenicol, 纯度 99.7%) 氟甲砜霉素 (florfenicol, 纯度 97.0%) 和氯霉素 (chloramphenicol, 纯度 99.0%) 尼卡巴嗪 (nicarbazin, 纯度 99.0%) 玉米赤霉醇 (zeranol, 纯度 99.5%) 17β- 雌二醇 (estradiol, 纯度 97.5%) 雌三醇 (estriol, 纯度 99.0%) 己烯雌酚 (diethylstilbestrol, 纯度 99.00%) 氧氟沙星 (ofloxacin, 纯度 98.0%) 磺胺嘧啶 (sulfadiazine, 纯度 99.5%) 磺胺噻唑 (sulfathiazole, 纯度 99.5%) 磺胺吡啶 (sulfapyridine, 纯度 99.0%) 磺胺二甲基嘧啶 (sulfamethazine, 纯度 99.5%) 磺胺对甲氧嘧啶 (sulfamonomethoxine, 纯度 98.0%) 磺胺间甲氧嘧啶 (sulfameter, 纯度 99.0%) 磺胺甲恶唑 (sulfamethoxazole, 纯度 99.0%) 磺胺二甲氧嘧啶 (sulfadimethoxine, 纯度 99.0%) 磺胺氯哒嗪 (sulfamonomethoxine, 纯度 99.0%) 磺胺甲噻二唑 (sulfamethizole, 纯度 98.5%) 磺胺二甲基异嘧啶 (sulfaisodimidine, 纯度 99.0%) 磺胺醋酰 (sulfacetamide, 纯度 99.4%) 四环素 (tetracycline, 纯度 97.0%) 金霉素 (chlortetracycline, 纯度 99.0%) 强力霉素 (doxycycline, 纯度 98.0%) 购自德国奥格斯堡公司 ; 结晶紫 (crystalviolet, 纯度 94.4%) 诺氟沙星 (norfloxacin, 纯度 99.0%) 环丙沙星 (ciprofloxacin, 纯度 99.5%) 恩诺沙星 (enrofloxacin, 纯度 99.0%) 达氟沙星 (danofloxacin, 纯度 98.4%) 氟甲喹 (flumequine, 纯度 97.8%) 麻保沙星 (marbofloxacin, 纯度 99.0%) 磺胺二甲异恶唑 (sulfisoxazole, 纯度 99.0%) 磺胺邻二甲嘧啶 (sulfamethoxypyridazine, 纯度 99.8%) 己烷雌酚 (hexoestrol, 纯度 99.5%) 双烯雌酚 (dienoestrol, 纯度 98.1%) 购自美国 Sigma 公司. 分别称取各兽药标准品适量, 以甲醇为溶剂, 配成一定质量浓度的单标储备液 ; 取各单标储备液适量以甲醇为溶剂, 配制成 35 种目标兽药的混合标准溶液, 置于 -4 冰箱中避光保存. 1.2 检测条件 LC 条件色谱柱柱温 :30 ; 流动相流速 :0.25 ml/min; 进样量 :10μL. 目标物分为 ESI + 项目和 ESI - 项目两组, 其中, ESI + 项目组的流动相为 : 含 0.10% 甲酸的超纯水 (A1) 和含 0.10% 甲酸的乙腈 (B1); 梯度洗脱程序为 :0 ~2min,10%B1;2~10 min,10% ~15%B1;10~12 min,15%b1;12.01~16 min,25%b1;16~24 min, 25%~80%B1;24~26 min,80%b1;26.01~30 min, 10%B1.ESI- 项目组的流动相为 : 超纯水 (A2) 和乙腈 (B2); 梯度洗脱程序为 :0~1 min,25%b2;1.01~5 min,45%b2;5~9 min,45% ~80%B2;9~12 min, 80%B2;12.01~15min,25%B MS 条件离子源 :ESI + 和 ESI - ; 离子源温度 :350 ; 毛细管电压 :4000V; 雾化气流速 :10L/min; 检测模式 : 多反应监测 (multiplereactionmonitoring,mrm);35 种目标物优化后的 MS 参数见表样品前处理前处理方法主要根据 EPA1694 [15] 和本课题组研

3 第 5 期洪家俊等 : 海水中多种类兽药残留测定准确度的评价和改善方法 677 [16-17] 究基础上选定. 保留效果的前处理 : 将不同品牌的 HLB 柱接在 SPE 装置上, 依次用 6 ml 甲醇和 6 ml 水活化. 在 500mL 经 0.45μm 滤膜过滤的反渗透水和厦门近岸海水中加入相同浓度的兽药混合标准溶液和 0.25g Na2EDTA, 混匀后以 4~6 ml/min 的速率通过 SPE 柱. 上柱完毕后以 6mL 的 5 95( 体积比 ) 甲醇水进行淋洗, 依次用 8mL 的甲醇和 4mL 甲醇 - 二氯甲烷 (1 1, 体积比 ) 进行洗脱 ; 接取洗脱液于 40 下氮吹浓缩至干, 以定容溶剂定容至 1mL, 经 0.22μm PVDF 过滤器过滤后, 待 LC-MS/MS 检测. 基质效应的前处理 : 将未加标的反渗透水和海水如上进行 SPE 操作, 在 40 下氮吹浓缩至干, 用等浓度的混合标准溶液定容至 1mL, 经 0.22μmPVDF 过滤器过滤后, 待 LC-MS/MS 检测. 2 结果与讨论 2.1 目标兽药的 MS 参数优化以适当浓度目标物和替代物的单标溶液进行 MS 参数优化. 首先进行全扫描, 优化目标物的 [M+H] + 或 [M-H] - 准分子离子峰响应 ; 然后对准分子离子进行轰击, 监测二次碎裂产生的子离子, 最后将准分子离子和 2~3 个信号强度适宜的子离子组成监测离子对, 以 MRM 模式进行检测. 优化后的目标物母离子 (parention,pi) 源内碎裂电压 (fragmentervoltage,fv) 子离子 (daughterions,di) 碰撞能 (colisionenergy, CE) 等 MS 参数和以 5 倍信噪比计算的仪器测定限 (instrumentdetectionlimit,idl) 见表 LC 条件优化在流速 0.25mL/min 进样量 10μL 的条件下, 分别用流动相 A1 和 B1 来优化磺胺类喹诺酮类和四环素类目标兽药的分离 ; 用流动相 A2 和 B2 来优化氯霉素类雌激素类等目标兽药的分离. 首先通过洗脱程序较长且梯度较缓的慢梯度程序确定各目标物的大致出峰时间顺序和分离情况, 再分段调整梯度洗脱程序, 实现最佳分离效果. 优化后目标兽药分组分析梯度程序见 1.2.1,MRM 谱图见图基质效应考察在 LC-MS/MS 分析中, 由于基质杂质的干扰, 目标物被 ESI 电离源电离的能力受到影响, 造成目标物信号强度改变的现象称为基质效应 (matrix efect) [18]. 基质效应的产生原因主要有 :1) 与目标成分共同萃取出的基质成分或者具有高质子亲和力的物质通过促进或占据电离液滴表面的电位点, 影响目标物的电离效率, 从而导致目标物响应信号增强或者降低 [7,19] ;2) 来自流动相或试样中的非挥发组分阻碍液相中形成的目标物离子进入气相, 导致目标物信号发生变化 [20] ;3) 具有较高表面活性的物质提高液滴表面 [21-22] 张力, 从而抑制目标物的离子化. 根据杂质来源分为外源性杂质和内源性杂质 [18], 外源性杂质来源于预处理过程中的缓冲溶液无机离子有机酸 SPE 柱等 ; 内源性杂质主要为存在于基质中的各种有机物. 基质效应会影响实验结果的重现性工作曲线线性, 导致 [18,23] 定性定量的不准确. 本研究以反渗透水为空白对照厦门近岸海水为实际基质, 按照 1.3 进行处理, 用等浓度的标准溶液定容, 利用公式 (1) 计算目标兽药的基质效应值 (ME 值 ), 结果列于表 3. 基质效应的评价方面,ME 值在 80%~120% 之间时表示基质效应不显著 ; 高于 120% 即呈现基质正效应, 目标兽药信号相应被基质干扰产生促进效应, 其中 121%~140% 可视为轻微的促进效应 ; 低于 80% 即呈现基质负效应, 目标兽药信号相应被基质干扰产生抑制效应, 其中 60%~79% 可视为轻微的抑制效应. 所有结果的 RSD 均在 0.1% ~16.1%. ME 值 = 定容样品标准品的响应 / 相同浓度标准品的响应 100%. (1) 对于 14 种磺胺类兽药,WatersHLB 柱除磺胺甲噻恶唑和磺胺二甲异恶唑在海水中表现出抑制效应外 (ME 值分别为 75.3% 和 57.3%), 其他在反渗透水和海水中均未表现出基质效应 ;Supelco HLB 柱除磺胺二甲氧嘧啶和磺胺二甲异恶唑在反渗透水和海水中呈现显著抑制效应, 及反渗透水中磺胺甲恶唑呈现轻微抑制效应外, 其他均未表现出基质效应 ; 安谱 HLB 柱在反渗透水中均未表现出基质效应, 而在海水基质中对磺胺间甲氧嘧啶表现出显著抑制效应磺胺二甲基嘧啶表现出轻微促进效应. 对于 7 种喹诺酮类兽药,Waters HLB 柱对反渗透水中的环丙沙星诺氟沙星氟甲喹表现出显著的促进效应, 而对海水中的环丙沙星恩诺沙星达氟沙星表现出抑制效应对氟甲喹表现出促进效应 ;Supelco HLB 柱对反渗透水中的全部 7 种兽药均表现出显著促进效应, 而仅对海水中的诺氟沙星表现出促进效应 ; 安谱 HLB 柱则对反渗透水和海水中的全部 7 种兽药均表现出促进效应. 对于 3 种四环素类兽药, 除安谱 HLB 柱对反渗

4 678 厦门大学学报 ( 自然科学版 ) 2013 年表 2 目标兽药的 MS 参数线性范围相关系数及 IDL Tab.2 Massparameters,linearrange,correlationcoeficients(r 2 )andidloftargetveterinarydrugs 偏号兽药 MS 参数 PI(m/z) DI(m/z) FV/V CE/eV 线性范围 / ( μg L -1 ) r 2 IDL/ ( μg L -1 ) S01 磺胺甲恶唑 *, ,15 0.5~ S02 磺胺甲噻二唑 *, ,20 0.1~ S03 磺胺吡啶 *, ,15 0.5~ S04 磺胺噻唑 *, ,20 0.5~ S05 磺胺氯哒嗪 *, ,20 0.1~ S06 磺胺二甲氧嘧啶 *,245.1, ,15,15 0.1~ S07 磺胺间甲氧嘧啶 *, ,10 0.1~ S08 磺胺对甲氧嘧啶 *, ,15 0.1~ S09 磺胺二甲基嘧啶 ,186.0 * ,15 0.5~ S10 磺胺嘧啶 *, ,15 1.0~ S11 磺胺二甲基异嘧啶 *, ,10 0.2~ S12 磺胺醋酰 *, ,15 0.5~ S13 磺胺二甲异恶唑 *, ,10 0.1~ S14 磺胺邻二甲嘧啶 *,126.0, ,15,20 0.5~ Q01 环丙沙星 *, ,15 5.0~ Q02 诺氟沙星 *, ,10 5.0~ Q03 恩诺沙星 *, ,15 5.0~ Q04 氧氟沙星 *, ,20 0.5~ Q05 达氟沙星 *, ,20 5.0~ Q06 氟甲喹 *, ,20 0.2~ Q07 麻保沙星 *, ,20 5.0~ T01 金霉素 ,444.1 * ,15 5.0~ T02 四环素 ,410.0 * 120 5,15 5.0~ T03 强力霉素 *, ,20 5.0~ C01 氯霉素 ,151.0 * 120 5,10 0.5~ C02 甲砜霉素 ,185.1 * 130 5,15 0.5~ C03 氟甲砜霉素 ,185.0 * ,12 0.5~ E01 己烯雌酚 *, ,30 5.0~ E02 雌三醇 *, ,34 125~ E03 17β- 雌二醇 *, ,40 125~ E04 己烷雌酚 ,134.1 * ,5 0.5~ E05 双烯雌酚 *, ,20 0.5~ O01 结晶紫 *, , ~ O02 玉米赤酶醇 ,277.3 * ,15 0.2~ O03 尼卡巴嗪 * ~ 注 :* 为定量离子.

5 第 5 期洪家俊等 : 海水中多种类兽药残留测定准确度的评价和改善方法 679 图中各目标物代码见表 2 图 1 目标兽药分组分析的 MRM 谱图 Fiġ1 MRMchromatogramofgroupedtargetveterinarydrugs 透水中的四环素和强力霉素 WatersHLB 柱对海水中的四环素和强力霉素未有显著基质效应外, 其他均表现出促进效应. 对于 3 种氯霉素类兽药,3 种 HLB 柱对海水基质均表现出显著抑制效应, 而在反渗透水中,Supelco HLB 柱同样全部为抑制效应,Waters 和安谱 HLB 柱则都对甲砜霉素表现出抑制效应. 对于 5 种雌激素类兽药,Waters HLB 柱除对海水中雌三醇基质效应不显著外, 其他均表现出抑制效应 ;SupelcoHLB 柱除对反渗透水和海水中的雌三醇表现出显著抑制外, 对其他雌激素表现出轻微抑制效应 ; 安谱 HLB 柱仅对海水中的雌三醇表现出显著抑制效应, 而对反渗透水中的雌三醇和海水中的 17β- 雌二醇表现轻微抑制效应, 其他均未表现出基质效应. 对于反渗透水和海水中的结晶紫和尼卡巴嗪, WatersHLB 柱均为显著抑制效应,Supelco 和安谱 HLB 柱均为显著促进效应.Waters 和安谱 HLB 柱对反渗透水中安谱 HLB 柱对海水中的玉米赤霉醇未有显著基质效应, 而 Supelco HLB 柱对反渗透水中 Waters 和 SupelcoHLB 柱对海水中的玉米赤霉醇均呈现抑制效应. 总体而言, 无论在反渗透水还是海水中, 磺胺类兽药的基质效应都最轻微, 喹诺酮类四环素类和结晶紫最严重. 相对于反渗透水, 海水中内源性杂质与外源性杂质的共同作用, 使得部分目标兽药的基质效应发生较大变化, 如部分喹诺酮类兽药由反渗透水的基质促进效应转变为基质抑制效应 ; 氯霉素类兽药由反渗透水的基质效应不显著变为基质抑制效应等. 分离度对基质效应的影响方面, 结合图 1 可见, 结晶紫和甲砜霉素等在分离度良好的条件下仍然呈现较为严重的基质效应 ; 而磺胺甲噻二唑和磺胺对甲氧嘧啶等保留时间非常接近, 但基质效应却不明显. 综上所述, 基质效应复杂且难以避免, 应在 LC-MS/MS 方法开发和验证时给予充分重视种品牌 HLB 柱的保留效果比较目前基质效应主要克服手段有 :1) 优化净化方法 [18] 及色谱分离条件 ;2) 替代物法 ;3) 基质匹配标准校正法 ;4) 上述 3 种手段的综合运用. 由于替代物大部分为目标物同位素标准品, 价格昂贵且不易得到, 有限的几种替代物又无法完全模拟所有目标物的行为, 其应

6 680 厦门大学学报 ( 自然科学版 ) 2013 年表 3 3 种品牌 HLB 柱在不同水样中的基质效应 (n=4) Tab.3 Matrixefectsof3diferentHLBcartridgestowatersamples(n=4) 反渗透水 ME 值 /% (RSD/%) 目标兽药海水 ME 值 /% (RSD/%) Waters Supelco 安谱 Waters Supelco 安谱磺胺甲恶唑 (2.4) 73.3 (3.0) (2.7) 99.0 (2.6) (2.0) (1.8) 磺胺甲噻二唑 97.0 (0.4) 95.1 (11.0) (1.1) 75.3 (3.1) 94.0 (0.4) (1.3) 磺胺吡啶 (0.8) (7.2) (2.0) (0.6) 84.5 (0.1) (1.9) 磺胺噻唑 (3.4) (6.3) (1.9) 98.5 (0.9) 90.8 (0.5) (1.3) 磺胺氯哒嗪 96.9 (7.8) (9.0) (0.5) 90.1 (2.8) 81.9 (2.1) (2.8) 磺胺二甲氧嘧啶 94.9 (2.6) 52.4 (1.2) (1.2) 86.1 (1.4) 40.4 (12.3) (7.2) 磺胺间甲氧嘧啶 (3.2) (7.0) (1.5) (1.4) 94.9 (0.6) 46.6 (2.1) 磺胺对甲氧嘧啶 97.0 (3.3) 99.2 (13.0) (1.0) 93.9 (2.4) 88.6 (2.6) (1.2) 磺胺二甲基嘧啶 (3.1) (8.3) (5.1) (4.8) 89.6 (1.4) (0.3) 磺胺嘧啶 (1.4) (1.4) (0.1) (1.4) 96.9 (0.9) (0.6) 磺胺二甲基异嘧啶 (3.8) (4.1) (2.4) (3.2) 88.6 (0.7) (0.2) 磺胺醋酰 96.5 (1.4) (1.5) (1.9) 92.0 (0.3) 87.4 (1.4) 92.1 (3.1) 磺胺二甲异恶唑 98.3 (1.0) 31.8 (3.9) (1.2) 57.3 (0.5) 44.0 (2.1) 89.2 (0) 磺胺邻二甲嘧啶 97.0 (3.3) 99.2 (13.0) (1.3) 93.9 (2.4) 82.5 (0.7) (3.7) 环丙沙星 (5.3) (16.1) (11.5) 69.3 (15.0) (1.8) (3.0) 诺氟沙星 (1.4) (4.8) (0.2) 82.0 (2.5) (0.5) (2.5) 恩诺沙星 (7.4) (12.7) (0.9) 67.6 (2.1) (1.5) (1.2) 氧氟沙星 (3.0) (7.4) (2.2) 85.0 (0.1) (1.5) (0.1) 达氟沙星 (8.0) (8.6) (7.0) 43.6 (2.3) (2.0) (0.3) 氟甲喹 (1.4) (5.5) (3.2) (1.5) (0.8) (0.3) 麻保沙星 (0.4) (0.5) (0.6) (9.1) 84.4 (3.5) (0.1) 金霉素 (3.4) (2.4) (1.8) (12.1) (0) (5.1) 四环素 (6.4) (12.4) (9.0) (11.0) (0.4) (9.8) 强力霉素 (9.0) (4.2) (4.5) (7.7) (9.3) (6.7) 氯霉素 92.0 (0.1) 62.4 (0.9) (3.0) 32.7 (1.5) 42.2 (2.0) 57.0 (1.4) 甲砜霉素 57.2 (4.0) 59.3 (5.1) 52.7 (0.9) 22.4 (0.2) 38.1 (2.2) 20.0 (0.6) 氟甲砜霉素 91.6 (0.3) 56.1 (1.6) (3.5) 37.0 (1.7) 38.3 (0.1) 44.8 (1.9) 己烯雌酚 60.8 (2.5) 90.7 (1.2) 84.1 (10.4) 55.4 (5.3) 69.8 (4.3) 91.1 (6.9) 雌三醇 71.1 (4.2) 40.5 (8.0) 75.7 (14.5) 89.2 (0.8) 27.7 (3.0) 27.8 (11.6) 17β- 雌二醇 66.7 (6.5) 69.3 (1.1) 88.2 (3.7) 63.5 (2.0) 68.8 (3.6) 72.7 (2.3) 己烷雌酚 50.5 (5.9) 69.8 (2.0) 83.5 (8.7) 42.0 (0.6) 67.6 (0.9) 86.9 (2.9) 双烯雌酚 53.7 (1.6) 75.4 (2.1) 83.2 (2.7) 49.0 (0.9) 61.2 (5.6) 82.5 (0.1) 结晶紫 52.8 (8.6) (3.7) (3.2) 57.7 (15.4) (4.4) (3.3) 玉米赤酶醇 81.2 (2.1) 75.7 (4.4) 86.5 (7.5) 63.3 (4.6) 65.6 (0.7) 82.3 (2.8) 尼卡巴嗪 72.2 (6.4) (3.6) (5.0) 50.8 (1.0) (1.8) (1.1) 用受到限制. 基质匹配标准校正法是指将空白样品经过前处理后, 加入系列浓度目标物标准制作基质匹配标准工作曲线, 用以对检测结果进行校正. 本研究在优化净化方法及色谱分离条件后, 选择较为复杂的近岸海水为基质, 按照 1.3 进行前处理 LC-MS/MS 检测, 对 3 种 HLB 柱进行质量浓度为 50 和 200ng/L 的加标回收实验, 分别以外标法和基质匹配标准校正法定量结果计算回收率, 以此考察保留效果和不同定量方式的影响, 结果列于表 4. 可以看出, 外标法定量的回收率结果与海水中基

7 第 5 期洪家俊等 : 海水中多种类兽药残留测定准确度的评价和改善方法 681 表 4 3 种 HLB 柱对海水中加标兽药的回收率 (n=4) 目标兽药 Tab.4 Recoveriesoftargetveterinarydrugsspikedinseawateron3diferentHLBcartridges(n=4) % Waters Supelco 安谱 50ng/L 200ng/L 50ng/L 200ng/L 50ng/L 200ng/L RE RE * RSD RE RE * RSD RE RE * RSD RE RE * RSD RE RE * RSD RE RE * RSD 磺胺甲恶唑磺胺甲噻二唑磺胺吡啶磺胺噻唑磺胺氯哒嗪磺胺二甲氧嘧啶磺胺间甲氧嘧啶磺胺对甲氧嘧啶磺胺二甲基嘧啶磺胺嘧啶磺胺二甲基异嘧啶磺胺醋酰磺胺二甲异恶唑磺胺邻二甲嘧啶环丙沙星诺氟沙星恩诺沙星氧氟沙星达氟沙星氟甲喹麻保沙星金霉素四环素强力霉素氯霉素甲砜霉素氟甲砜霉素己烯雌酚雌三醇 β- 雌二醇己烷雌酚双烯雌酚结晶紫玉米赤酶醇尼卡巴嗪注 :RE 为外标法定量的回收率 ;RE * 为基质匹配标准工作曲线定量的回收率.

8 682 厦门大学学报 ( 自然科学版 ) 2013 年质效应基本相对应, 例如, 海水中 3 种氯霉素类的 ME 值为 20.0% ~57.0%, 其外标法回收率为 18.9% ~ 55.6%;3 种四环素类的 ME 值为 101.5%~179.2%, 其外标法回收率为 102.4% ~398.9%, 因此, 对于 Waters Supelco 和安谱这 3 种 HLB 柱外标法定量结果无法反映真实的回收率情况. 采用基质匹配标准法校正后发现,3 种 HLB 柱的磺胺类回收率分别为 71.5% ~ 89.2% 60.4% ~ 91.2% 和 78.7% ~ 112.1%; 氯霉素类回收率分别为 79.6% ~101.2% 86.1%~105.2% 和 95.2%~111.1%; 喹诺酮类回收率分别为 71.0% ~126.1% 91.2% ~159.3% 和 69.3%~95.5%; 四环素类回收率分别为 69.9% ~ 108.2% 103.1% ~132.5% 和 82.5% ~100.1%; 雌激素类回收率分别为 83.6% ~118.3% 87.0% ~ 133.4% 和 83.0% ~104.2%, 回收率普遍较好, 安谱和 Waters 表现最佳,Supelco 的回收率普遍偏高. 总体上来看, 海水基质中,3 种 HLB 柱采用基质匹配标准校正后的目标兽药回收率为 26.8% ~147.8% 60.4%~159.3% 和 52.0%~112.1%,RSD(n=4) 在 0.1%~11.1% 之间, 较好地克服了基质效应干扰, 表现出相似的保留效果. 3 结论在相同的填料量和前处理方法下, 利用 LC-MS/ MS 评价了 WatersOasis HLB SupelcoSupel-Select HLB 和安谱 CNW PolȳSery HLB 这 3 种常用 HLB 柱对海水中多种类兽药 SPE 时的基质效应, 比较了外标法和基质匹配标准校正法的保留效果. 结果显示, 除了结晶紫和尼卡巴嗪等少数目标兽药, 对于相同基质的目标兽药,3 种 HLB 柱呈现的基质效应大体类似, 程度有一定区别, 不应忽视. 与外标法相比较, 基质匹配标准校正法可有效消除基质效应, 校正后 3 种 HLB 柱的保留效果无显著差异, 均可较好满足海水中兽药多残留的检测需求. 研究结果为实际海水样品中兽药多残留分析时 SPE HLB 柱型的选择和准确度的改善提供了参考数据. 参考文献 : [1] Seifrtova M,Pena A,LinoC M,etal.Determinationof fluoroquinolone antibiotics in hospital and municipal wastewatersincoimbrabyliquidchromatographywitha monolithiccolumnandfluorescencedetection[j].analyticalandbioanalyticalchemistry,2008,391: [2] Benito-PenaE,Partal-RoderaAI,Leon-Gonzalez M E,et al.evaluationofmixed modesolidphaseextractioncartridgesforthepre-concentrationofbeta-lactamantibioticsinwastewaterusingliquidchromatographywith UV- DADdetection[J].Analytica Chimica Acta,2006,556: [3] BatAL,AgaDS.Simultaneousanalysisofmultipleclassesofantibioticsbyiontrap LC-MS-MSforassessing surfacewaterandgroundwatercontamination[j].analyticalchemistry,2005,77: [4] Hilton M J,ThomasK V.Determinationofselectedhuman pharmaceuticalcompoundsinefluentandsurface watersamplesbyhigh-performanceliquidchromatographȳelectrospraytandem massspectrometry[j].journal ofchromatographya,2003,1015: [5] ReverteS,BorrulF,PocurulE,etal.Determinationof antibioticcompoundsin waterbysolidphaseextraction high performance liquid chromatography electrospray massspectrometry[j].journalof Chromatography A, 2003,1010: [6] 刘虹, 张国平, 刘丛强. 固相萃取 - 色谱测定水沉积物及土壤中氯霉素和 3 种四环素类抗生素 [J]. 分析化学, 2007,35(3): [7] Kasprzyk-HordenB,DinsdaleR M,GuwyAJ.Multi-residuemethodforthedeterminationofbasic/neutralpharmaceuticalsandilicitdrugsinsurface waterbysolidphaseextractionandultraperformanceliquidchromatoḡ raphȳpositiveelectrosprayionizationtandem massspectrometry[j].journalofchromatography A,2007,1161: [8] MitaniK,Kataoka H.Determinationoffluoroquinolones inenvironmentalwatersbyin-tubesolidphasemicroextractioncoupledwithliquidchromatographytandem mass spectrometry[j].analytica Chimica Acta,2006,562: [9] 高立红, 史亚利, 厉文辉, 等. 高效液相色谱 - 电喷雾串联质谱法检测环境水样中 22 种抗生素类药物 [J]. 分析测试学报,2010,28(5): [10] 孙广大, 苏仲毅, 陈猛. 固相萃取 - 超高压液相色谱 - 串联质谱同时分析环境水样中四环素类和喹诺酮类抗生素 [J]. 色谱,2009,27(1): [11] 洪蕾洁, 石璐, 张亚雷, 等. 固相萃取 - 高效液相色谱法同时测定水体中的 10 种磺胺类抗生素 [J]. 环境科学, 2012,33(2): [12] HirschR,TernesT A,HabererK,etal.Determination ofantibioticindiferentwatercompartmentsvialiquid chromatographȳelectrospraytandem massspectrometry [J].JournalofChromatographyA,1998,815:

9 第 5 期洪家俊等 : 海水中多种类兽药残留测定准确度的评价和改善方法 683 [13] ChenCY,WenTY,WangGS,etal.DeterminingestrogenicsteroidsinTaipeiwatersandremovalindrinking watertreatmentusinghigh-flow solid-phaseextraction andliquid chromatography/tandem massspectrometry [J].Science of the Total Environment,2007,378: [14] 王立琦, 贺利民, 曾振灵, 等. 液相色谱 - 串联质谱检测兽药残留中的基质效应研究进展 [J]. 质谱学报,2011,32 (6): [15] US EPA.Method 1694:pharmaceuticalsand personal careproductsin water,soil,sediment,andbiosolidsby HPLC/MS/MS[S].New York:[s.n.],2007. [16] 陆婉清. 环境水样和水产品中多种类兽药残留的同时分析方法研究 [D]. 厦门 : 厦门大学,2010. [17] 苏仲毅. 环境水样中 24 种抗生素残留的同时分析方法及其应用研究 [D]. 厦门 : 厦门大学,2008. [18] TrufeliH,PalmaP,FamigliniG,etal.Anoverviewof matrixefectsinliquidchromatographȳmassspectrometry[j].massspectrometryreviews,2011,30: [19] KebarleP,TangL.Fromionsinsolutiontoionsinthegas phase.themechanism ofelectrospray mass spectrometry [J].AnalyticalChemistry,1993,65:972A-986A. [20] KingRC,BonfiglioR,Fernandez-MetzlerC,etal.Mechanisticinvestigationofionizationsuppressioninelectrosprayionization[J].JournaloftheAmericanSocietyfor MassSpectrometry,2000,11: [21] CechNB,EnkeCG.Relatingelectrosprayionizationresponsetonon-polarcharacterofsmalpeptides[J].AnalyticalChemistry,2000,72: [22] ZhouS,Cook K D.A mechanisticstudyofelectrospray massspectrometry:chargegradientswithinelectrospray dropletsandtheirinfluenceonionresponse[j].journal ofthe AmericanSocietyfor MassSpectrometry,2001, 12: [23] WuJM,QianX Q,YangZG,etal.Studyonthematrix efectinthe determination ofselected pharmaceutical residuesinseawaterbysolid-phaseextractionandultrahigh-performanceliquidchromatographȳelectrosprayionizationlow-energycolision-induced dissociationtandem massspectrometry[j].journalofchromatography A,2010,1217: EvaluationandImprovementofMulti-residualDetermination AccuracyofTraceVeterinaryDrugsinSeawater HONGJia-jun 1,CHEN Qiu-lan 2,YIQi-tong 1,CHEN Meng 1*,YUAN Donḡxing 1 (1.FujianProvincialKeyLaboratoryforCoastalEcologyandEnvironmentalStudies,ColegeoftheEnvironmentandEcology, XiamenUniversity,Xiamen361102,China;2.QuanzhouEnvironmentalMonitoringStation,Quanzhou362000,China) Abstract: Matrixefectfrequentlyinfluencesdeterminationaccuracyoftraceveterinarydrugsindiferentmatrices.Inthispaper,the evaluationandimprovementmethodofmatrixefectondeterminationaccuracyof35veterinarydrugsspikedinseawaterwerestudied usingreverseosmosis(ro)waterascontrolmatrix.lc-ms/mswasusedfordetectionand HLBcartridgesofthreebrands (Waters,SupelcoandAnpel)forconcentrationunder500foldsconcentration.InRO wateronlyexogenousmatrixefectswereobserved. Sulfonamidesandchloramphenicolswerefoundnotsignificantlyafectedbymatrixefect.Quinolonesandtetracyclinesshowedpositivematrixefectswhileestrogensshowednegativematrixefects.Inseawater,duetotheco-existedexogenousandendogenousinterferingsubstances,mostquinolonesandtetracyclinesalsoshowedpositivematrixefects.Chloramphenicolsandestrogensshowed negativematrixefects,onlysulfonamideswerenotsignificantlyafected.matrixmatchedcalibrationmethodefectivelyovercamematrixefectswithbeterquantizationresultsthanexternalcalibrationmethod.recoveriesof35targetveterinarydrugsspikedinseawaterat50ng/land200ng/llevelswereintherangesof26.8%-147.8% (Waters),60.4%-159.3% (Supelco),and52.0%-112.1% (Anpel)withRSDs(n=4)0.1%-11.1%.Researchindicatedthatmatrixefectcouldnotbeignoredandmatrixmatchedcalibration methodwouldprovidebeterresultswhenusingdiferenthlbcartridgesfortraceveterinarydrugdeterminationinwaters. Keywords: veterinarydrug ;seawater;determinationaccuracy;hydrophile-lyophilebalance(hlb);matrixefect

2 了检测研究, 主要针对食品及饲料, 但对水体抗生素的研究仍不够全面目前, 抗生素的仪器检测方法有酶联免疫法 [3-4] 毛细管电泳法 [5] 气相色谱 - 质谱联用法 [6] 液相色谱法及液相色谱 - 质谱联用法等 [7-16] 由于不同种类抗生素的解离常数 (pka) 差异较大, 为多类别抗

2 了检测研究, 主要针对食品及饲料, 但对水体抗生素的研究仍不够全面目前, 抗生素的仪器检测方法有酶联免疫法 [3-4] 毛细管电泳法 [5] 气相色谱 - 质谱联用法 [6] 液相色谱法及液相色谱 - 质谱联用法等 [7-16] 由于不同种类抗生素的解离常数 (pka) 差异较大, 为多类别抗 1 论著固相萃取富集 - 超高效液相色谱 - 串联质谱法同时测定源水和自来水中的 4 种多类别抗生素王军淋, 许娇娇, 蔡增轩, 张念华, 王志园, 任一平浙江省疾病预防控制中心, 浙江杭州 351 摘要 : 目的建立超高效液相色谱 - 串联质谱法同时检测水源水和自来水中的磺胺类 β- 内酰胺类四环素类氯霉素类 4 种抗生素, 同时建立超高效液相色谱 - 三重四级杆飞行时间质谱的确认方法