4 期何欣, 等 : 基于高效液相色谱四级杆飞行时间质谱技术筛查渔业水域环境中抗生素残留方法的建立与应用 653 素的定量分析方法海水和城市污水中抗生素的方法定量下限分别为 1.1~34.7 ng/l 和 2.5~57.2 ng/l 液相色谱法和液相色谱 - 电喷雾串联质谱技术具有灵敏度和准确

Size: px

Start display at page:

Download "4 期何欣, 等 : 基于高效液相色谱四级杆飞行时间质谱技术筛查渔业水域环境中抗生素残留方法的建立与应用 653 素的定量分析方法海水和城市污水中抗生素的方法定量下限分别为 1.1~34.7 ng/l 和 2.5~57.2 ng/l 液相色谱法和液相色谱 - 电喷雾串联质谱技术具有灵敏度和准确"

泗钰左
5 years ago
Views:

1 水第 40 卷第 4 期 2016 年 4 月产学报 Vol. 40, No. 4 JOURNAL OF FISHERIES OF CHINA Apr., 2016 文章编号: (2016) DOI: /jfc 基于高效液相色谱四级杆飞行时间质谱技术筛查渔业水域环境中抗生素残留方法的建立与应用何欣 1 李诗言 2 王扬 2 郑重莺 2 张海琪 2 金仁耀 1 王鼎南 2 王林雯 2 戴志远 1 * (1. 浙江工商大学食品与生物工程学院浙江杭州 2. 浙江省水产技术推广总站浙江杭州 ) 摘要应用高效液相色谱四级杆飞行时间质谱(HPLC-Q-TOF-MS)技术建立水中常用的42种抗生素残留快速筛查方法采用固相萃取富集净化的方法进行样品预处理目标药物经液相色谱仪C 18 反相柱分离 1%甲酸乙酸铵水溶液甲醇溶液为流动相梯度洗脱利用正离子源全扫描模式进行检测并将建立的方法应用于浙江省内主要渔业环境水质样品抗生素残留的筛查工作渔业水域环境中42种抗生素定量限(LOQ S/N=10)为 0.010~0.120 μg/l 3个水平加标的平均回收率为60.7%~97.1% 相对标准偏差(RSD)为 0.58%~8.01% 该方法快速简便灵敏度高对抽取的60批次样品进行检测共检出磺胺甲鰁唑磺胺间甲氧基嘧啶磺胺吡啶磺胺氯哒嗪恩诺沙星5种药物含量为 25.6~106.7 ng/l 本实验建立的渔业水质中抗生素药物的高效液相色谱四级杆串联飞行质谱分析方法灵敏准确定性能力强可以成功应用于渔业环境水质样品抗生素残留的筛查工作关键词抗生素残留高效液相色谱四级杆飞行时间质谱法渔业水域环境浙江省中图分类号 X 文献标志码 A 渔用抗生素主要用于预防和治疗水生动物疾养殖水体的表层水中环丙沙星恩诺沙星和土病在使用过程中由于水生动物体内代谢酶霉素等检出率较高浓度范围为10.5~26.8 μg/l 系的不同极少部分抗生素被吸收大部分未目前水体中常用的抗生素含量的检测方法已被生物吸收而通过动物排泄等途径直接以原药经有一些报道 Kumar等 [11]采用了酶联免疫法检形式排入水体 [1] 这些药物残留除了对水生动物测水环境中的泰乐菌素和四环素 2种抗生素的具有急慢性毒性作用外还将引起诸如耐药检出限分别为0.10和0.50 μg/l 该方法操作简便以及菌群失调等副且分析快速但方法的选择性较高难以同时作用目前与其相关的潜在生态风险已经引分析多种成分对于结构类似的分析容起国内外广泛关注王敏等在对福建滨海养殖易出现假阳性李彦文等 [12]采用了液相色谱法对水体中5类14种抗生素残留的检测中检出了喹诺水体中的抗生素进行了残留检测 5种抗生素在酮类氯霉素类和磺胺类的7种抗生素浓度为水和土壤中的检出限为0.94~13.2 ng/l 唐才明等[13] 3.54~40.2 ng/l 阮悦斐等 [10]分析了天津近郊养殖采用了固相萃取(SPE)及液相色谱-电喷雾串联质水体的表层水中喹诺酮类四环素类及磺胺类谱(LC-ESI MS/MS)技术建立了水体中微量磺 3类共18种抗生素的残留 500倍浓缩后在淡水胺大环内酯类抗生素甲氧苄胺嘧啶及氯霉 [2-4] 菌超级细菌的产生 [5] [6-7] [8] [9] 收稿日期修回日期资助项目浙江省农业标准化研究项目(2013) 国家科技支撑计划(2015BAD29B06) 通信作者戴志远 dzy@mail.zjgsu.edu.cn

2 4 期何欣, 等 : 基于高效液相色谱四级杆飞行时间质谱技术筛查渔业水域环境中抗生素残留方法的建立与应用 653 素的定量分析方法海水和城市污水中抗生素的方法定量下限分别为 1.1~34.7 ng/l 和 2.5~57.2 ng/l 液相色谱法和液相色谱 - 电喷雾串联质谱技术具有灵敏度和准确度高和重现性好等特点, 但只能针对某一类目标, 在满足多参数同时检测需求上存在局限性本实验通过固相萃取法富集渔业水域环境中 42 种常见抗生素, 采用四极杆 / 飞行时间质谱 (Q- TOF/MS) 的高分辨率质谱技术, 利用其高特异性高质量准确度及高质量分辨率等优点 [14], 建立了同时筛查渔业环境水域中不同种类抗生素的高效液相色谱四级杆飞行时间质谱检测法通过建立不同种类数据库匹配检索, 方便快速地对目标和未知进行筛查与鉴定基于渔业水域环境中抗生素残留对健康和生态的潜在风险, 利用该项技术开展渔业水域环境抗生素污染分析评估显得十分必要 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂实验中所用的 Agilent 液相色谱四级杆飞行时间质谱仪, 配有 Dual AJS ESI 源 ( 美国 Agilent 公司 ) 有机溶剂包括乙腈( 色谱纯, 美国 TEDIA 公司 ); 甲醇 ( 色谱纯, 美国 TEDIA 公司 ); 甲酸 (HPLC / 色谱纯, 美国 ROE scientific INC.); 维生素 C( 分析纯, 美国 Sigma 公司 ) Oasis HLB 固相萃取柱 (500 mg/6 ml, 美国 Waters 公司 ) 42 种抗生素标准品购自德国 Dr. Ehrenstorfer 公司, 纯度均大于 95%( 表 1) 分别称取 10 mg 上述标准品, 置于 10 ml 棕色容量瓶中, 用甲醇溶解并定容配制成 100 μg/ml 的标准储备液, 于 20 C 保存备用实验中再用甲醇稀释上述标准储备液, 配制成不同浓度的混合标准使用液待用 1.2 水样采集 2015 年 7 月至 8 月在浙江省重要产卵索饵场 ( 钱塘江上游常山开化段鱼类产卵索饵水域 ) 水产种质资源保护区 ( 东西苕溪水产种质资源保护区 ) 重要增殖放流水域( 桐庐两江增殖放流区域 ) 以及重要养殖水域 [ 包括杭州千岛湖 ( 大型水库 ) 养殖区衢州江山碗窑水库丽水石塘水库嘉兴汾湖养殖区绍兴洋湖泊养殖区金华金东水库群 ( 山塘 ) 养殖区以及湖州菱湖前口漾养殖区 ] 等四大类型水域 10 个区域采集水质样编号 no. Tab. 1 表 1 42 种目标的保留时间以及质谱信息 Retention times and MS parameters for the analysis of 42 target s 分子式 formula 母离子 /(m/z) parent ion 保留时间 /min retetion time 子离子 /(m/z) fragmentation 1 磺胺胍 sulfaguanidine C 7 H 10 N 4 O 2 S , , 磺胺吡啶 sulfapyridine C 11 H 11 N 3 O 2 S , , 磺胺嘧啶 sulfadiazine C 10 H 10 N 4 O 2 S , , 磺胺甲噁唑 sulfamethoxazole C 10 H 11 N 3 O 3 S , , 磺胺噻唑 sulfathiazole C 9 H 9 N 3 O 2 S , , 恶喹酸 oxolinic acid C 13 H 11 NO , , 磺胺甲嘧啶 sulfamerazine C 11 H 12 N 4 O 2 S , , 磺胺二甲异唑 sulfisoxazole C 11 H 13 N 3 O 3 S , , 磺胺甲二唑 sulfamethizole C 9 H 10 N 4 O 2 S , , 磺胺二甲基嘧啶 sulfamethazine C 12 H 14 N 4 O 2 S , , 磺胺二甲基异嘧啶 sulfisomidine C 12 H 14 N 4 O 2 S , , 磺胺对甲氧基嘧啶 sulfameter C 11 H 12 N 4 O 3 S , , 磺胺间甲氧基嘧啶 sulfamonomethoxine C 11 H 12 N 4 O 3 S , , 磺胺氯哒嗪 sulfachloropyride C 10 H 9 C l N 4 O 2 S , , 磺胺喹恶啉 sulfachinoxalin C 14 H 12 N 4 O 2 S , ,

3 654 水产学报 40 卷编号 no. 分子式 formula 母离子 /(m/z) parent ion 保留时间 /min retetion time 子离子 /(m/z) fragmentation 续表 1 16 磺胺邻二甲氧嘧啶 sulfadoxine C 12 H 14 N 4 O 4 S , , 磺胺二甲基哒嗪 sulfadimethoxine C 12 H 14 N 4 O 4 S , , 诺氟沙星 norfloxacin C 16 H 18 FN 3 O , , 依诺沙星 enoxacin C 15 H 17 FN 4 O , , 环丙沙星 ciprofloxacin C 17 H 18 FN 3 O , , 培氟沙星 pefloxacin C 17 H 20 FN 3 O , , 洛美沙星 lomefloxacin C 17 H 19 F 2 N 3 O , , 丹诺沙星 danofloxacin C 19 H 20 FN 3 O , , 恩诺沙星 enrofloxacin C 19 H 22 FN 3 O , , 氧氟沙星 ofloxacin C 18 H 20 FN 3 O , 氟罗沙星 fleroxacin C 17 H 18 F 3 N 3 O , 沙拉沙星 sarafloxacin C 20 H 17 F 2 N 3 O , , 司帕沙星 sparfolxacin C 19 H 22 F 2 N 4 O , , 奥比沙星 orbifloxacin C 19 H 20 F 3 N 3 O , , 双氟沙星 difloxacin C 21 H 19 F 2 N 3 O , , 青霉素 G penicilline G C 16 H 18 N 2 O 4 S , 氨苄西林 ampicillin C 16 H 19 N 3 O 4 S , 阿莫西林 amoxicillin C 16 H 25 N 3 O 8 S , 苯唑西林 oxacillin C 19 H 19 N 3 O 5 S , 萘夫西林 nafcilin C 21 H 22 N 2 O 5 S , 头孢氨苄 cefalexin C 16 H 17 N 3 O 4 S , , 头孢匹林 cefapirin C 17 H 17 N 3 O 6 S , , 头孢唑林 cefazolin C 14 H 14 N 8 O 4 S , , 头孢洛宁 cephalonium C 20 H 18 N 4 O 5 S , , 头孢匹罗 cefpirome C 22 H 22 N 6 O 5 S , , 头孢喹肟 cefquinome C 23 H 24 N 6 O 5 S , , 红霉素 erthromycin C 37 H 67 NO , , 品水样采集按照水质采样样品的保存和管理技术规定 (HJ ) 要求进行其中水深 10 m, 只采表层 ; 水深 >10 m, 采表底两层样品所有样品盛于 1 L 棕色玻璃瓶内, 常温运输至实验室内 4 C 避光冷藏保存,7 天内测定完毕每个批次采样都准备 1 个现场空白样品采样期间的底层水温 17.8~22.7 C, 表层水温 23.8~31.1 C 1.3 样品前处理准确称取经过 0.45 μm 玻璃纤维滤膜抽滤 ( 流速 :5~10 ml/min) 的水样 250 ml, 加入 g 的抗氧化试剂维生素 C 粉末, 经预先用 3 ml 甲醇和 3 ml 水活化的 Oasis HLB 固相萃取柱富集后, 将固相萃取柱抽真空至填料全干后, 用 6 ml 乙腈甲醇 (V/V=1 1) 洗脱待测物, 收集全部洗脱液于 10 ml 离心管中, 在 40 C 水浴中用氮气吹至近干, 用 200 μl 乙腈复溶, 涡旋 10 s, 再加入 800 μl 蒸馏水, 涡旋 10 s, 经过 0.22 μm 有机滤膜过滤, 待上机同批水样分析时均加做试剂空白和加标回

4 4 期何欣, 等 : 基于高效液相色谱四级杆飞行时间质谱技术筛查渔业水域环境中抗生素残留方法的建立与应用 655 收进行质量控制 1.4 色谱质谱条件色谱柱采用 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C 18,100 mm 2.1 mm,3.5 μm 流速 ml/min, 柱温 30 C, 进样量 2 μl 流动相 A: 添加甲酸的 5 mmol 乙酸铵水溶液, 甲酸添加体积为乙酸铵水溶液的 0.1%; 流动相 B: 甲醇梯度洗脱程序设定 :0~1 min,5% B;1~5 min,5%~30% B;5~8 min,30%~50% B;8~15 min,50%~98% B; 15~18 min,98% B 质谱条件为电喷雾离子源 (Dual AJS ESI) 源, 正离子模式,MS 扫描范围为 50~1000 m/z, 毛细管电压设置为 4000 V, 鞘气温度和流速分别为 320 C 和 11.0 L/min; 干燥气温度和流速分别为 320 C 和 10.0 L/min, 诱导解离电压为 130 V 使用 C 5 H 4 N 4 参比液 ( 离子精确相对质量为 ) 实时质量校准 2 结果 2.1 液相条件优化实验选取的 3 种不同的流动相体系分别为加入 0.1% 甲酸的 5 mmol/l 乙酸铵溶液甲醇 0.1% 甲酸水溶液甲醇和水溶液甲醇结果表明,0.1% 甲酸的 5 mmol/l 乙酸铵溶液甲醇流动相体系具有较好的洗脱效果为了增强方法拓展性, 选择了兼容性较好洗脱时间充足的洗脱程序, 全程时间为 18 min,42 种在 10 min 内实现基本分离 2.2 筛查数据库的建立和分析应用 Agilent MassHunter Workstation Software (Version B 5.00) 软件采集与处理数据, 应用 Agilent MassHunter PCDL Manager(B 4.00) 软件建立筛查数据库将 42 种 10 μg/ml 的渔药标准物质溶液通过液相色谱串联四级杆飞行时间质谱确认的保留时间, 完善一级筛查谱库, 并针对每种分别采集了碰撞能量 (collision energy,ce) 为和 40 ev 时的二级质谱图加入谱库, 得到精确质量数和同位素峰度匹配二级特征离子匹配等信息 ( 表 1) 42 种抗生素中含有 3 对同分异构体, 磺胺二甲基嘧啶磺胺二甲基异嘧啶磺胺对甲氧基嘧啶磺胺间甲氧基嘧啶磺胺邻二甲氧嘧啶磺胺二甲基哒嗪的保留时间分别为和和和 min, 分离效果良好欧盟 2002/657/EC 决议中规定 1 个结构碎片可以获得 2 个鉴别分数, 二级质谱中的每个子离子获得 2.5 个分数, 为确定 1 个需要至少 4 个鉴别分数, 所以 1 个具有精确质量数的母离子和 1 个特征碎片子离子即可获得 4.5 分的鉴定分数, 满足鉴定的要求本方法中每个已经确证至少 1 个精确质量数的母离子和其 2 个特征子离子, 满足欧盟决议的要求 2.3 前处理条件选择实验采用 SPE 小柱固相萃取富集净化水样, 能在一定程度上减少基质效应 [15] 比较 C 18 和 Oasis HLB 柱的净化效果, 选择 Oasis HLB 柱作为本实验的固相萃取 SPE 小柱为获得较高回收率, 进一步优化洗脱液种类和洗脱体积, 考察了 3 种不同洗脱液 ( 分别为甲醇, 乙腈和 50 % 乙腈甲醇洗脱试剂 ) 和不同洗脱体积 ( 分别采用和 10 ml 进行洗脱 ) 对 5 μg/l 加标浓度水平下不同种类药物平均回收率的影响结果显示, 纯乙腈与 50% 乙腈甲醇对于这 42 种抗生素的洗脱能力无显著性的差异,6 ml 即可将所有吸附的抗生素洗脱下来纯甲醇试剂的洗脱能力较弱,8 ml 方可将所有吸附的抗生素洗脱下来, 并且对于头孢类抗生素的回收率较低, 如比较 50% 乙腈甲醇体系和纯甲醇体系洗脱时, 头孢氨苄的回收率分别为 70.8%~73.1% 和 62.8%~69.4% 考虑到乙腈的毒性及纯乙腈过强的洗脱能力带来的杂质, 故采用 50% 乙腈甲醇体系作为洗脱液, 洗脱体积为 6 ml 2.4 线性范围和定量限将 42 种药物各浓度点系列标准溶液按照色谱质谱条件分析后, 以提取离子色谱图的峰面积 (Y) 为纵坐标, 质量浓度 (X,μg/L) 为横坐标绘制校准曲线, 其相关系数 (r) 均大于 0.99, 表明各在相应的浓度范围内呈良好的线性关系采用标准添加法进行测试, 以空白水样提取液稀释标准曲线的最低浓度, 以 S/N =10 时为分析仪器的定量限 (LOQ)( 表 2) 2.5 方法学验证取空白水样, 添加 3 个不同浓度水平的混合标准溶液, 每个浓度水平做 3 个平行, 计算平均回收率及相对标准偏差 (RSD) 渔业环境水域中 42 种渔药的平均回收率为 60.7%~97.1%,RSD 范围为 0.58%~8.01%, 满足检测要求 ( 表 3)

5 656 水产学报 40 卷 2.6 方法应用应用本方法对实验室采集的浙江省渔业水域环境 60 批次水质样品进行检测, 结果共检出磺胺甲鰁唑磺胺间甲氧基嘧啶磺胺吡啶磺胺氯哒嗪恩诺沙星等两大类 5 种药物, 其中 20 批次检出磺胺甲鰁唑, 含量为 22.3~53.6 ng/l;14 批次检出磺胺间甲氧基嘧啶, 含量为 32.3~76.3 ng/l; 10 批次检出磺胺吡啶, 含量为 18.9~41.9 ng/l; 6 批次检出磺胺氯哒嗪, 含量为 18.8~30.6 ng/l; 4 批次检出恩诺沙星, 含量为 94.2~113.2 ng/l 以 Tab. 2 编号 no. 表 2 渔业水域环境中 42 种抗生素的线性范围定量限 (LOQ) 和相关系数 (r) Linear ranges,limits of quantification(loq),and correlation coefficients (r) of the 42 antibiotics in fishery water 线性范围 /(μg/l) linear ranges 仪器定量限 /(μg/l) LOQ 相关系数 r 1 磺胺胍 sulfaguanidine 0.020~ 磺胺吡啶 sulfapyridine 0.010~ 磺胺嘧啶 sulfadiazine 0.020~ 磺胺甲噁唑 sulfamethoxazole 0.020~ 磺胺噻唑 sulfathiazole 0.020~ 恶喹酸 oxolinic acid 0.050~ 磺胺甲嘧啶 sulfamerazine 0.010~ 磺胺二甲异唑 sulfisoxazole 0.050~ 磺胺甲二唑 sulfamethizole 0.050~ 磺胺二甲基嘧啶 sulfamethazine 0.010~ 磺胺二甲基异嘧啶 sulfisomidine 0.020~ 磺胺对甲氧基嘧啶 sulfameter 0.010~ 磺胺间甲氧基嘧啶 sulfamonomethoxine 0.020~ 磺胺氯哒嗪 sulfachloropyride 0.050~ 磺胺喹恶啉 sulfachinoxalin 0.025~ 磺胺邻二甲氧嘧啶 sulfadoxine 0.010~ 磺胺二甲基哒嗪 sulfadimethoxine 0.010~ 诺氟沙星 norfloxacin 0.025~ 依诺沙星 enoxacin 0.040~ 环丙沙星 ciprofloxacin 0.060~ 培氟沙星 pefloxacin 0.025~ 洛美沙星 lomefloxacin 0.025~ 丹诺沙星 danofloxacin 0.040~ 恩诺沙星 enrofloxacin 0.020~ 氧氟沙星 ofloxacin 0.020~ 氟罗沙星 fleroxacin 0.020~ 沙拉沙星 sarafloxacin 0.040~ 司帕沙星 sparfolxacin 0.020~ 奥比沙星 orbifloxacin 0.020~ 双氟沙星 difloxacin 0.020~

6 4 期何欣, 等 : 基于高效液相色谱四级杆飞行时间质谱技术筛查渔业水域环境中抗生素残留方法的建立与应用 657 编号 no. 线性范围 /(μg/l) linear ranges 仪器定量限 /(μg/l) LOQ 续表 2 相关系数 r 31 青霉素 G penicilline G 0.050~ 氨苄西林 ampicillin 0.110~ 阿莫西林 amoxicillin 0.120~ 苯唑西林 oxacillin 0.050~ 萘夫西林 nafcilin 0.050~ 头孢氨苄 cefalexin 0.060~ 头孢匹林 cefapirin 0.050~ 头孢唑林 cefazolin 0.120~ 头孢洛宁 cephalonium 0.120~ 头孢匹罗 cefpirome 0.100~ 头孢喹肟 cefquinome 0.060~ 红霉素 erthromycin 0.050~ 表 3 水质中 42 种抗生素的回收率和相对标准偏差 Tab. 3 Recoverie and relative standard deviation (RSD) of the 42 antibiotics in water n=3 磺胺胍 sulfaguanidine 加标量 /(μg/l) spiked 回收率 /% recovery RSD/% 加标量 /(μg/l) spiked 回收率 /% recovery 洛美沙星 lomefloxacin RSD/% 磺胺吡啶 sulfapyridine 丹诺沙星 danofloxacin 磺胺嘧啶 sulfadiazine 恩诺沙星 enrofloxacin 磺胺甲噁唑 sulfamethox -azole 氧氟沙星 ofloxacin 磺胺噻唑 sulfathiazole 氟罗沙星 fleroxacin 恶喹酸 oxolinic acid 沙拉沙星 sarafloxacin

7 658 水产学报 40 卷磺胺甲嘧啶 sulfamerazine 加标量 /(μg/l) spiked 回收率 /% recovery RSD/% 加标量 /(μg/l) spiked 回收率 /% recovery 续表司帕沙星 sparfolxacin RSD/% 磺胺二甲异唑 sulfisoxazole 奥比沙星 orbifloxacin 磺胺甲二唑 sulfamethizole 双氟沙星 difloxacin 磺胺二甲基嘧啶 sulfametha -zine 青霉素 G penicilline G 磺胺二甲基异嘧啶 sulfisomidine 氨苄西林 smpicillin 磺胺对甲氧基嘧啶 sulfameter 阿莫西林 amoxicillin 磺胺间甲氧基嘧啶苯唑西林 sulfamonome -thoxine oxacillin 磺胺氯哒嗪 sulfachloropy -ride 萘夫西林 nafcilin 磺胺喹恶啉 sulfachinoxalin 头孢氨苄 cefalexin 磺胺邻二甲氧嘧啶 sulfadoxine 头孢匹林 cefapirin 磺胺二甲基哒嗪 sulfadimetho -xine 头孢唑林 cefazolin 诺氟沙星 norfloxacin 头孢洛宁 cephalonium

8 4 期何欣, 等 : 基于高效液相色谱四级杆飞行时间质谱技术筛查渔业水域环境中抗生素残留方法的建立与应用 659 依诺沙星 enoxacin 加标量 /(μg/l) spiked 回收率 /% recovery RSD/% 加标量 /(μg/l) spiked 回收率 /% recovery 续表头孢匹罗 cefpirome RSD/% 环丙沙星 ciprofloxacin 头孢喹肟 cefquinome 培氟沙星 pefloxacin 红霉素 erthromycin 上 5 种药物的检出率分别为 33.3% 23.3% 16.7% 10% 和 6.67%( 表 4) 3 讨论 3.1 方法学分析本研究先对 42 种抗生素的液相条件进行了优化,0.1% 甲酸的 5 mmol/l 乙酸铵溶液甲醇流动相体系具有较好的洗脱效果这是因为甲酸可以显著地提高离子化效率, 乙酸铵能够降低噪音背景, 二者结合可以提高飞行时间质谱的灵敏度, 因此本实验采用 0.1% 甲酸的 5 mmol/l 乙酸铵溶液甲醇作为流动相在前处理方法的优化中, 首先比较 C 18 和 Oasis HLB 柱的净化效果, 前者提取部分强极性药物有一定的损失率, 柱子易被穿透, 后者的吸附剂是由亲脂性二乙烯苯和亲水性 N- 乙烯基吡咯烷酮 2 种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物, 是用于酸性中性和碱性的通用型吸附剂, 而且即使柱床干涸, 回收率也不受影响 [16], 适合于水体中 42 种抗生素残留检测 [17] 苏仲毅针对养殖业常用的 24 种抗生素, 采用固相萃取超高压液相色谱串联质谱检测方法建立了其在河水和海水中的高灵敏的同时分析方法该方法中, 在 1000 倍稀释的条件下, 四环素类抗生素的定量限为 10 μg/l, 其余目标物的仪器检测限均小于 0.5 μg/l 各类抗生素的表 4 Tab. 4 渔业环境监测水域中抗生素筛查结果 Results of antibiotic residue in fishery waters 监测水域类型 type of fishery waters 具体监测区域 area 钱塘江上游常山开重要产卵索饵场水域化段站位数量 number 磺胺甲噁唑 sulfameth-oxazole 筛查出的抗生素种类和含量 /(ng/l) type and concentration 磺胺间甲氧基嘧啶 sulfamonom-ethoxine 磺胺吡啶 sulfapyri-dine 磺胺氯哒嗪 sulfachloro-pyride 恩诺沙星 enrofloxa-cin 4 未检出 ND 未检出 ND 未检出 ND 未检出 ND 未检出 ND 水产种质资源保护区东西苕溪 6 未检出 ND 未检出 ND 未检出 ND 未检出 ND 未检出 ND 重要增殖放流水域桐庐两江 ± ±8.9 未检出 ND 24.7±5.9 未检出 ND 重要养殖水域杭州千岛湖 ( 大型水库 ) 10 未检出 ND 未检出 ND 未检出 ND 未检出 ND 未检出 ND 重要养殖水域衢州江山碗窑水库 6 未检出 ND 未检出 ND 未检出 ND 未检出 ND 未检出 ND 重要养殖水域丽水石塘水库 6 未检出 ND 未检出 ND 未检出 ND 未检出 ND 未检出 ND 重要养殖水域嘉兴汾湖 ±4.7 未检出 ND 34.1±7.8 未检出 ND 未检出 ND 重要养殖水域绍兴洋湖泊 8 未检出 ND 68.4±7.9 未检出 ND 未检出 ND 未检出 ND 重要养殖水域金华金东水库 ( 山塘 ) ±5.3 未检出 ND 未检出 ND 未检出 ND 未检出 ND 重要养殖水域湖州菱湖前口漾 ±9.1 未检出 ND 26.7±7.8 未检出 ND 103.7±9.5

9 660 水产学报 40 卷线性范围分别为氯霉素类 0.5~ μg/l 四环素类 10.0~ μg/l 喹诺酮类和磺胺类 0.2~ μg/l; 线性相关系数为 ~0.9999, 整 [18] 个仪器分析过程为 1 h Hirsch 等应用 HPLC- MS/MS 技术, 成功地同时检测了河水中包括大环内脂磺胺四环素和 β- 内酰胺在内的四类 18 种抗生素, 在浓缩 100 倍的条件下, 仪器定量 [19] 限为 10~5000 ng/l 高立红等采用 HPLC-MS/MS 分析环境水样中 22 种抗生素类药物, 在浓缩 200 倍的条件下, 仪器定量限为 0.05~0.50 μg/l 本研究目标物数量为 42 种,250 倍浓缩时, 仪器定量限为 0.01~0.12 μg/l, 全程时间为 18 min 若统一采用 100 倍浓缩时, 苏仲毅 [17] Hirsch 等 [18] [19] 高立红等和本研究的方法定量限分别为小于 5 0.1~50 0.5~5 和 0.1~1.2 ng/l 因此本方法拥有更为广泛的目标筛查范围, 更高的灵敏度及更高效的检测效率 3.2 水体中抗生素残留分析 [20] 王丹等对中国地表水环境中药物分析显示, 磺胺类和喹诺酮类在抗生素类检出率中分别占 33% 和 30%, 其中磺胺甲鰁唑报道率最高 Xu [21] 等在香港维多利亚港附近海域检出 2 种喹诺酮类抗生素, 浓度为 10~21 ng/l; 在珠江检出氯霉素 2 种喹诺酮类抗生素和 3 种磺胺类抗生素, 浓度分别为 41~266 11~250 和 37~336 ng/l 刘虹 [22] 等在贵阳市的水库中检出氯霉素和四环素类抗生素, 浓度分别为 0.2~0.8 和 0.2~1.4 μg/l Golet [23] 等在瑞士的 Glatt 峡谷和污水处理厂排出的水中检测到了浓度为 72 ng/l 的环丙沙星和 57 ng/l 的诺 [9] 氟沙星王敏等对福建滨海养殖水体中 5 类 14 种抗生素残留的检测检出了 3 类 7 种抗生素, 包括浓度分别为 3.54 ng/l 的诺氟沙星 14.8 ng/l 的氧氟沙星,5.36 ng/l 的磺胺嘧啶,7.35 ng/l 的磺胺二甲嘧啶 18.5 ng/l 的磺胺甲恶唑 5.00 ng/l 的氟甲砜霉素和 40.2 ng/l 的甲氧苄氨嘧啶阮悦斐 [10] 等分析了天津近郊养殖水体的表层水中喹诺酮类四环素类及磺胺类三类共 18 种抗生素的残留结果发现, 经 500 倍浓缩后, 磺胺类抗生素中有磺胺甲基异鰁唑被检出 2 次, 浓度最高达 μg/l 喹诺酮类抗生素检出相对较多, 环丙沙星恩诺沙星氧氟沙星 3 种目标物分别被检出次, 浓度最高达 μg/l 四环素类抗生素中土霉素被检出 2 次, 浓度均大于 μg/l, 即未经浓缩之前, 水样中的磺胺甲基异鰁唑浓度最高达 ng/l, 喹诺酮类抗生素的浓度最大达到 ng/l, 土霉素的浓度均大于 ng/l 从本次浙江省渔业水域环境中检出药物种类看, 分析结果有相似性, 磺胺和喹诺酮类抗生素是最主要的 2 种水体中残留的抗生素种类, 检出的浓度分别为 18.8~76.3 和 94.2~113.2 ng/l 按养殖水域类型分析, 产卵索饵场水域 ( 钱塘江上游常山开化段 ) 和水产种质资源保护区 ( 东西苕溪 )10 个监测点水样均未检出任何种类的药物残留 ; 重要增殖放流水域 ( 桐庐两江 )6 个监测点水样检出磺胺甲鰁唑磺胺间甲氧基嘧啶和磺胺氯哒嗪等 3 种药物 ; 重点养殖水域中杭州千岛湖衢州江山碗窑水库丽水石塘水库等 3 个区域属于大型水库, 为粗养区域, 不允许投喂人工饲料, 抽取的 22 批次水样中未检出抗生素残留嘉兴汾湖绍兴洋湖泊金华金东水库 ( 山塘 ) 湖州菱湖前口漾等 4 个区域属于小型的湖泊水库, 养殖方式为精养, 抽取的 22 个样品检出 5 种药物, 药物检出率达到该类水域样品的 50% 4 结论本方法建立并优化了渔业水质中抗生素药物的高效液相色谱四级杆串联飞行质谱分析方法, 渔业环境水域中 42 种渔药的平均回收率为 60.7%~97.1%,RSD 范围为 0.58%~8.01%, 定量限为 0.01~0.12 μg/l, 全程时间为 18 min 该方法灵敏准确定性能力强, 成功应用于浙江省渔业环境水质样品抗生素残留筛查工作从本次浙江省渔业水域环境中检出药物种类看, 磺胺和喹诺酮类抗生素检出率最高, 建议着重对这 2 种药物的使用及残留进行监控参考文献 : [ 1 ] Boxall A B A,Kolpin D W,Halling-Sørensen B,et al. Peer reviewed:are veterinary medicines causing environmental risks [J]. Environmental Science & Technology,2003,37(15): [ 2 ] Wollenberger L,Halling-Sørensen B,Kusk K O. Acute and chronic toxicity of veterinary antibiotics to Daphnia magna [J]. Chemosphere,2000,40(7):

10 4 期何欣, 等 : 基于高效液相色谱四级杆飞行时间质谱技术筛查渔业水域环境中抗生素残留方法的建立与应用 661 [ 3 ] Sørensen B H. Algal toxicity of antibacterial agents used linked immunosorbent assay for ultratrace determination in intensive farming [J]. Chemosphere,2000,40(7): of antibiotics in aqueous samples [J]. Journal of Environment Quality,2004,33(1): [ 4 ] Holten L H C,Halling-Sørensen B,Jørgensen S E. [12] 李彦文, 莫测辉, 赵娜, 等. 高效液相色谱法测定水 Algal toxicity of antibacterial agents applied in Danish 和土壤中磺胺类抗生素 [J]. 分析化学,2008,36(7): fish farming [J]. Archives of Environmental Contamination and Toxicology,1999,36(1):1-6. Li Y W,Mo C H,Zhao N,et al. Determination of [ 5 ] Nygaard K,Lunestad B T,Hektoen H,et al. sulfonamides antibiotics in water and soil using high Resistance to oxytetracycline,oxolinic acid and performance liquid chromatography [J]. Chinese Journal furazolidone in bacteria from marine sediments [J]. of Analytical Chemistry,2008,36(7): (in Aquaculture,1992,104(1-2): Chinese). [ 6 ] Endta H P,Mouton J W,den Hollander J G,et al. [13] 唐才明, 黄秋鑫, 余以义, 等. 高效液相色谱 - 串联 Comparative in vitro activities of Trovafloxacin (CP- 质谱法对水环境中微量磺胺大环内酯类抗生素 99,219) against 445 gram-positive isolates from 甲氧苄胺嘧啶与氯霉素的检测 [J]. 分析测试学报, patients with endocarditis and those with other 2009,28(8): bloodstream infections [J]. Antimicrobial Agents and Tang C M,Huang Q X,Yu Y Y,et al. Simultaneous Chemotherapy,1997,41(5): determination of trace sulfonamides,macrolides, [ 7 ] Sieradzki K,Roberts R B,Haber S W,et al. The trimethoprim and chloramphenicol in aquatic development of vancomycin resistance in a patient with environment using liquid chromatography-tandem mass methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection [J]. spectrometry [J]. Journal of Instrumental Analysis, The New England Journal of Medicine,1999, 2009,28(8): (in Chinese). 340(7): [14] Carrasco-Pancorbo A,Casado-Terrones S,Segura- [ 8 ] Ladirat S E,Schols H A,Nauta A,et al. High- Carretero A,et al. Reversed-phase high-performance throughput analysis of the impact of antibiotics on the liquid chromatography coupled to ultraviolet and human intestinal microbiota composition [J]. Journal of electrospray time-of-flight mass spectrometry on-line Microbiological Methods,2013,92(3): detection for the separation of eight tetracyclines in [ 9 ] 王敏, 俞慎, 洪有为, 等. 5 种典型滨海养殖水体中 honey samples [J]. Journal of Chromatography A, 多种类抗生素的残留特性 [J]. 生态环境学报,2011, 2008,1195(1-2): (5): [15] Hirsch R,Ternes T,Haberer K,et al. Occurrence of Wang M,Yu S,Hong Y W,et al. Residual antibiotics in the aquatic environment [J]. Science of the characterization of multi-categorized antibiotics in five Total Environment,1999,225(1-2): typical aquaculture waters [J]. Ecology and [16] Dias N C,Poole C F. Mechanistic study of the sorption Environmental Sciences,2011,20(5): (in properties of OASIS HLB and its use in solid-phase Chinese). extraction [J]. Chromatographia,2002,56(5-6):269- [10] 阮悦斐, 陈继淼, 郭昌胜, 等. 天津近郊地区淡水养 275. 殖水体的表层水及沉积物中典型抗生素的残留分析 [17] 苏仲毅. 环境水样中 24 种抗生素残留的同时分析方法 [J]. 农业环境科学学报,2011,30(12): 及其应用研究 [D]. 厦门 : 厦门大学,2008: Ruan Y F,Chen J M,Guo C S,et al. Distribution Su Z Y. Study on determination method for 24 characteristics of typical antibiotics in surface water and antibiotics in aquatic environmental samples and its sediments from freshwater aquaculture water in Tianjin application [D]. Xiamen:Xiamen University,2008: Suburban Areas,China [J]. Journal of Agro (in Chinese). Environment Science,2011,30(12): (in [18] Hirsch R,Ternes T A,Haberer K,et al. Chinese). Determination of antibiotics in different water [11] Kumar K,Thompson A,Singh A K,et al. Enzyme- compartments via liquid chromatography-electrospray

11 662 水产学报 40 卷 tandem mass spectrometry [J]. Journal of selected antibiotics in the Victoria Harbour and the Pearl Chromatography A,1998,815(2): River,South China using high-performance liquid [19] [20] 高立红, 史亚利, 厉文辉, 等. 高效液相色谱电喷雾串联质谱法检测环境水样中 22 种抗生素类药物 [J]. 色谱,2010,28(5): Gao L H,Shi Y Y,Li W H,et al. Determination of 22 antibiotics in environmental water samples using high performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry [J]. Chinese Journal of Chromatography,2010,28(5): (in Chinese). 王丹, 隋倩, 赵文涛, 等. 中国地表水环境中药物和个人护理品的研究进展 [J]. 科学通报,2014,59(9): Wang D,Sui Q,Zhao W T,et al. Pharmaceutical and personal care products in the surface water of China:a [22] [23] chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry [J]. Environmental Pollution,2007, 145(3): 刘虹, 张国平, 刘丛强. 固相萃取色谱测定水沉积物及土壤中氯霉素和 3 种四环素类抗生素 [J]. 分析化学,2007,35(3): Liu H,Zhang G P,Liu C Q. Determination of chloramphenicol and three tetracyclines by solid phase extraction and high performance liquid chromatographyultraviolet detection [J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry,2007,35(3): (in Chinese). Golet E M,Alder A C,Giger W. Environmental exposure and risk assessment of fluoroquinolone review [J]. Chinese Science Bulletin,2014,59(9): antibacterial agents in wastewater and river water of the (in Chinese). Glatt valley watershed,switzerland [J]. Environmental [21] Xu W H,Zhang G,Zou S C,et al. Determination of Science & Technology,2002,36(17):

12 4 期何欣, 等 : 基于高效液相色谱四级杆飞行时间质谱技术筛查渔业水域环境中抗生素残留方法的建立与应用 663 Determination of antibiotic residues in fishery water environment by high performance liquid chromatography quadrupole time of flight mass spectrometry and its application HE Xin 1, LI Shiyan 2, WANG Yang 2, ZHENG Zhongying 2, ZHANG Haiqi 2, JIN Renyao 1, WANG Dingnan 2, WANG Linwen 2, DAI Zhiyuan 1 * (1. College of Food Science and Biotechnology, Gongshang University, Hangzhou , China; 2. Zhejiang Fishery Technology Extension Center, Hangzhou , China) Abstract: Rapid screening method for 42 kinds of commonly used antibiotics residues in fishery water by High performance liquid chromatography combined with quadrupole time-of-flight mass spectrometry (HPLC-Q-TOF- MS) has been developed. Targeted antibiotics was extracted from samples on C 18 Solid-phase extraction cartridges. Analytical separation was performed on a C 18 reverse phase column by liquid chromatography with 1% acetic acid, formic acid, ammonium salt aqueous methanol solution as mobile phase. Positive ion source full scan patterns were used. The result showed that Limit of Quantity (S/N=10, LOQ) of 42 kinds of antibiotics were μg/l. The average recovery for antibiotics was 60.7% 97.1%. The relative standard deviation (RSDs) was 0.58% 8.01%. The method is rapid and simple with high sensitivity. 60 fishery water samples were determined and sulfamethoxazole, sulfamonomethoxine, sulfapyridine, sulfachlorpyridazine, enrofloxacin were detected with the concentration from 25.6 to ng/l. The method is sensitive, accurate and can be applied to the screening of antibiotic residues in fishery water environment. Key words: antibiotic residues; high performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry; fishery water environment; Zhejiang province Corresponding author: DAI Zhiyuan. dzy@mail.zjgsu.edu.cn Funding projects: Research Project of Agricultural Standardization in Zhejiang Province (2013); National Science and Technology Support Program (2012BAD29B06)

DOI /j.issn Food Research And Development UPLC-MS/MS 5 0.

DOI /j.issn Food Research And Development UPLC-MS/MS 5 0. 118 217 5 38 1 DOI 1.3969/j.issn.5-6521.217.1.28 Food Research And Development 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1. 731 2. 731 - UPLC-MS/MS 5. 1 mol/l ProElut PXC 5 % - Thermo Hypersil Gold mm 2.1 mm 1.9 μm ESI