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1 第 4 卷第 2 期食品安全质量检测学报 Vol. 4 No 年 4 月 Journal of Food Safety and Quality Apr., 连英杰, 吴敏 *, 黎翠玉, 徐敦明, 林立毅, 周昱 ( 厦门出入境检验检疫局, 厦门 ) 摘要 : 目的建立直接提取 - 超高压液相色谱 - 电喷雾串联质谱法 (UPLC-ESIMS/MS) 同时测定原料奶及奶粉中土霉素四环素金霉素强力霉素 4 种四环素类药物的分析方法方法原料奶及奶粉样品经少量高氯酸沉淀蛋白低温冷冻除脂后, 用 C 18 色谱柱分离, 以 0.1% 甲酸水和乙腈为流动相进行梯度洗脱, 电喷雾串联质谱正离子模式扫描, 多反应监测模式 (MRM) 检测, 外标法定量结果 4 种四环素族药物在 1~1000 ng/ml 浓度范围内线性关系良好, 相关系数 r 均在以上本方法的定量限为 (S/N 10) 为原料奶 5μg/kg, 奶粉 25 μg/kg, 在 μg/kg 三个加标水平下, 加标回收率为 73.4%~99.4%, 相对标准偏差为 0.8%~14.3%(n 6) 结论该方法简便快速灵敏可靠经济有效, 适用于原料奶及奶粉中土霉素四环素金霉素和强力霉素 4 种四环素族药物残留的测定关键词 : 四环素族 ; 直接提取 ; 超高压液相色谱 - 串联质谱法 ; 奶 ; 奶制品 Determination of tetracycline antibiotics residues in milk and dairy products by direct extraction-uplc-esi-ms/ms LIAN Ying-Jie, WU Min *, LI Cui-Yu, XU Dun-Ming, LIN Li-Yi, ZHOU Yu (Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Xiamen , China) ABSTRACT: Objective A method for the simultaneous determination of oxytetracycline, tetracycline, chlortetracycline, and doxycycline residues in milk and dairy products was developed using direct extraction and ultra pressure liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry (UPLC-ESI-MS/MS). Methods Samples were extracted with little perchloric acid to precipitate protein and remove Frozen grease, separated by C 18 column with gradient elution using acetonitrile and water (containing 0.1% formic acid) and analyzed by UPLC-ESI-MS/MS under the positive mode using multiple reaction monitoring (MRM). The samples were quantified with external standard method. Results The method showed a good linearity over the range of 1~1000 ng/ml for 4 compounds of tetracycline antibiotics residue with r The detection limit (S/N 10) of milk was 5 μg/kg, and that of dairy products was 25 μg/kg. The recoveries were 73.4%~99.4% at the spiked level of 10, 50 μg/kg, and 100 μg/kg with relative standard deviation of 0.8%~14.3%(n 6). Conclusion This method is simple, accurate and reproducible, and it is suitable for the rapid analysis of tetracy- 基金项目 : 福建省自然科学基金 (2011J05029) Fund: Supported by the National Natural Science Foundation of Fujian (2011J05029) * 通讯作者 : 吴敏, 高级工程师, 主要研究方向为食品有毒有害物质分析 shimianhe74@sina.com *Corresponding author: WU Min, Senior Engineer, Technical Center of Xiamen Inspection & Quarantine Bureau, No.2165 Jiangang Road, Haicang District, Xiamen , China. shimianhe74@sina.com

2 490 食品安全质量检测学报第 4 卷 cline antibiotics in milk and dairy products. KEY WORDS: tetracycline antibiotics; direct extraction; ultra pressure liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry (UPLC-ESI-MS/MS); milk; dairy products 四环素类抗生素, 其化学结构属氢化并四苯环衍生物它们被广泛用于多种细菌及立克次氏体衣原体支原体等所致感染的治疗 [1], 并已被广泛应用于饲料添加剂中随着动物源性食品需求的急剧增长, 抗生素滥用超量使用不遵守休药期规定等一系列不合理用药现象严重, 导致动物源性食品中药物残留问题不断增多, 已经涉及到乳及乳制品, 对公众的健康带来潜在危害 [2] 美国欧盟及我国等对土霉素四环素金霉素在牛奶中的最大残留限量作了规定, 分别为 [3] 0.1 mg/kg [4], 近年来四环素族兽药残留测定的方法主要有高压液相色谱法 (HPLC) [5,6] 和固相萃取 - 液相色谱 - 串联质谱法 (SPE- LC-MS/MS) [7] HPLC 方法仅靠保留时间来定性, 抗干扰能力差, 易受其他杂质影响, 检出限较低, 检出限达不到一些国家的要求 [8] SPE-LC-MS/MS 样品前处理步骤繁琐, 回收率略低, 分析时间较长, 也有研究以多壁碳纳米管固相萃取柱做净化材料 [4], 虽然该方法引进了先进的碳纳米材料但其成本问题偏高, [9] 普及率不高近年来 HPLC-MS/MS 方法与超高压液相色谱 - 串联质谱法 (UPLC-MS/MS) 主要用于药物中四环素族残留量的分析, 饲料中也有一些报道 [10], 但是 UPLC-MS/MS 用于食品中四环素族药物未见报道本研究选用高氯酸进行提取净化后, 用 UPLC- MS/MS 同时测定了原料奶和奶粉中四环素族残留量, 从而有效消除了基质效应, 提高了方法的灵敏度, 降低了分析成本 1 材料与方法 1.1 仪器设备 Agilent 1290 超高压液相色谱仪 ( 美国安捷伦公司 ); API4000 四极杆串联质谱仪 ( 美国 AB 公司 ); 配有电喷雾电离源 (ESI); 涡旋振荡器 ( 德国 IKA 公司 ); TGL-16G 超高速离心机 ( 上海安亭宁科学仪器厂 ) 1.2 试剂土霉素四环素金霉素和强力霉素 4 种标准品纯度均大于 93%, 购于德国 Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司, 用甲醇配置成质量浓度为 100 μg/ml 的储备液以上溶液均于 -18 下避光保存根据需要用超纯水逐级稀释配成适当浓度的混合标准工作液, 现用现配甲酸, 乙腈均为色谱纯 ; 高氯酸为分析纯 1.3 样品前处理提取和净化原料奶 : 直接吸取 2 g 样品 ( 精确到 0.01 g), 加 0.25 ml 15% 高氯酸溶液, 溶液产生白色絮状沉淀, 涡旋充分, 低温冷冻除脂, r/min 离心 3 min, 取上清液, 经 0.22 μm 滤膜过滤后, 供液相色谱 - 串联质谱仪测定奶粉 : 准确称取取 1 g 样品 ( 精确到 0.01 g) 用水稀释至 5 g, 取 2 g 样液加入 0.5 ml 15% 高氯酸, 涡旋 5 min, r/min 离心 3 min, 取清液, 经 0.22 μm 滤膜过滤后, 供液相色谱 - 串联质谱仪测定超高压液相色谱条件色谱柱 : Waters Atalantis T3 色谱柱 (2.1 mm 150 mm, 3 μm), 柱温 : 20 ; 进样量 5 μl; 流动相 A 为 0.1% 甲酸水溶液, B 为乙腈 ; 流动相梯度程序 : 0~1 min 80%A; 1~8 min 流动相 A 线性降至 30%; 8~10 min 流动相 A 线性升至 80% 并保持 3 min, 流速为 0.3 ml/min 质谱条件电喷雾电离正离子模式 (ESI + ); 质谱扫描模式 : 多反应监测 (MRM); 喷雾电压 5500 V; 离子源温度 500 ; 辅助加热气流量 30 L/min; 锥孔电压 80 V; 入口电压 10 V; 出口电压 13 V; 停滞时间 100 ms; 其他质谱参数见表 1 表 1 多反应监测扫描模式的质谱参数 Table 1 Mass spectrometric parameters for tetracyclines 化合物母离子 (m/z) 子离子 (m/z) 碰撞电压 U/V 强力霉素 * 四环 * 25.0 素 * 28.5 金霉素 * 26.0 土霉素注 : * 定量离子 (Quantitative ion)

第 2 期连英杰, 等 : 直接提取 - 超高压液相色谱 - 电喷雾串联质谱法检测原料奶及奶制品中的四环素类抗生素 491 2 结果讨论 2.

3 第 2 期连英杰, 等 : 直接提取 - 超高压液相色谱 - 电喷雾串联质谱法检测原料奶及奶制品中的四环素类抗生素结果讨论 2.1 提取和净化条件的优化原料奶和奶制品的基质成分复杂, 蛋白质油脂含量高, 因此样品前处理尤为重要四环素类化合物具有极好的水溶性用水溶液就能起到很好的提取效果高氯酸有很好的沉淀蛋白质的能力, 酸性条件有助于四环素族的溶解通过实验发现, 高氯酸浓度在 1%~15% 区间内, 样品蛋白质沉淀不充分, 净化效果不够好, 15%~30% 区间内回收率呈下降趋势因此选择浓度 15% 的高氯酸水溶液作为提取剂和蛋白沉淀剂本研究对比了固相萃取和高氯酸直接提取净化效果, 结果见图 1 采用 C 18 固相萃取柱净化, 4 种四环素族药物残留回收率低于 70% 而采用 Waters Oasis HLB 固相萃取柱净化, 4 种四环素族药物残留回收率低于 82% 而且因为乳及乳制品中的蛋白含量很高, 容易造成固相萃取柱的堵塞, 从而造成相对标准偏差偏大 ) 图 1 不同净化方法效果比较 Fig. 1 Select of purification methods 2.2 色谱和质谱条件的优化采用针泵连续进样, 在正离子模式下, 分别对 1 μg/ml 混合标准溶液进行母离子全扫描, 确定其分子离子优化各分子离子的锥孔电压分别以上述离子为母离子, 对其子离子进行全扫描, 选择丰度高干扰较小的两对子离子为定性离子, 丰度最高的作为定量离子, 对喷雾电压离子源温度碰撞气入口电压出口电压去簇电压及碰撞能量等参数进行优化 4 种药物混表的总离子流图如图 2 所示, 从图 2 中可以看出, 4 种药物在 2 min 内即可实现快速分离检测, 能够与干扰杂质充分分离, 有效地减轻了基质效应的影响, 使定量结果更加准确可靠 2.3 方法的线性范围检出限和定量限取 ng/ml 的系列混合标准溶液进行测定, 以各药物定量离子的质量色谱峰面积 (A) 为纵坐标 Y, 对应的质量浓度 (ρ, ng/ml) 为横坐标 X, 绘制标准曲线在 1~1000 μg/kg 范围内, 4 种药物的质量浓度与其峰面积呈良好的线性关系, 相关系数均大于 0.993( 见表 2) 在空白原料奶与奶粉样品中添加混合标准溶液, 确定本方法中 4 种药物的检出限 ( 以 3 倍信噪比计 ) 分别为原料奶 2 μg/kg, 奶粉为 10 μg/kg, 定量限 ( 以 10 倍信噪比计 ) 分别为原料奶为 5 μg/kg, 奶粉为 25 μg/kg 根剧具体日常检测要求, 本系统在测定相似物质混标时一般选取检出限最低的物质, 作为这类物质的检出限和定量限 Fig.2 图 2 4 种混标总离子流图 Total ion chromatogram of 4 mixed standard solution

4 492 食品安全质量检测学报第 4 卷表 2 4 种四环素族化合物的工作曲线和线性相关系数 Table 2 Regression equations, correlation coefficient of tetracyclines 化合物线性方程 r 金霉素 Y = 475 X 土霉素 Y=702X 强力霉素 Y = 1940 X 四环素 Y= 462 X 方法的回收率与精密度分别向空白原料奶和奶粉中添加 3 个水平的混合标准溶液, 每个加标水平取 6 个平行样, 进行加标回收率实验由表 3 可以看出, 4 种药物的平均回收率为 73.4%~99.4%, 相对标准偏差为 0.8%~14.3%, 表明该方法具有较好的准确度和精密度, 满足残留检测的要求以下是 4 种化合物混合标准液的 MRM 谱图 ( 见图 3) 以及样品空白 ( 见图 4, 6) 和样品加标 ( 见图 5,7)MRM 谱图表 3 样品中四环素族化合物残留的回收率 (%) Table 3 Recoveries of tetracyclines in the samples(%) 化合物添加水平 (μg/kg) 样品回收率 (%) 强力霉素 10 牛奶四环素土霉素金霉素强力霉素 10 奶粉四环素土霉素金霉素相对标准偏差 (%) Fig.3 图 3 4 种化合物混合标准液的 MRM 谱图 MRM chromatograms of 4 mixed standard solution

5 第 2 期连英杰, 等 : 直接提取 - 超高压液相色谱 - 电喷雾串联质谱法检测原料奶及奶制品中的四环素类抗生素 493 Fig.4 图 4 空白原料奶样品 MRM 谱图 MRM chromatograms of blank milk samples Fig.5 图 5 原料奶样品加标 50 μg/kg MRM 谱图 MRM chromatograms of milk sample at spiked level of 50 μg/kg

6 494 食品安全质量检测学报 Fig.6 Fig.7 图 6 空白奶粉样品 MRM 谱图 MRM chromatograms of blank milk powder 图 7 奶粉样品加标 50 μg/kg MRM 图 MRM chromatograms of milk powder at spiked level of 50 μg/kg 第4卷

第 2 期连英杰, 等 : 直接提取 - 超高压液相色谱 - 电喷雾串联质谱法检测原料奶及奶制品中的四环素类抗生素 495 3 结论本文研究建立的超高压液相色谱 - 电喷雾串联四级杆质谱同时测定原料奶及奶粉中四环素族药物残留的检测方法, 所有药物可在 2 min 实现快速分离检测本方法快速准确灵敏度高重复性好, 线性范围宽, 能满足残留检测的分析要求, 适用于原料奶和奶粉中 4

7 第 2 期连英杰, 等 : 直接提取 - 超高压液相色谱 - 电喷雾串联质谱法检测原料奶及奶制品中的四环素类抗生素结论本文研究建立的超高压液相色谱 - 电喷雾串联四级杆质谱同时测定原料奶及奶粉中四环素族药物残留的检测方法, 所有药物可在 2 min 实现快速分离检测本方法快速准确灵敏度高重复性好, 线性范围宽, 能满足残留检测的分析要求, 适用于原料奶和奶粉中 4 种四环素族药物残留的定量和确证检测参考文献 [1] 钟伟龙, 吴云普, 吕飞, 等. 超高效液相色谱 - 串联质谱法测定饲料中四环素类药物残留 [J]. 农业灾害研究, 2012, 2(1): Zhong WL,Wu YP, Lv F. Determination of Tetracyclines Residue in Feed by U PLC-MS/MS [J]. J Agr Catastrophol, 2012, 2(1): [2] 宋戈, 郑伟. 高效液相色谱法测定乳及乳制品中多种四环素类药物残留 [J]. 中国乳品工业, 2012, 40(8): Song G, Zheng W. Determ ination of various tetracycline antibiotics residues in milk and dairy products[j]. China Dairy Ind, 2012, 40(8): [3] 范志影, 刘宏超. 高效液相色谱法测定牛奶中的四环素类抗生素 [J]. 中国乳品工业, 2010, 38(12): Fan Zhi-Ying,Liu Hong-Chao. Determ ination of tetracycline antibiotics in COW S m ilk by liquid chrom atography[j]. China Dairy Ind, 2010, 38(12): [4] 赵海香, 孙艳红, 丁明玉, 等. 多壁碳纳米管净化 / 超高效液相色谱串联质谱同时测定动物组织中四环素与喹诺酮多残留 [J]. 分析测试学报, 2011, 30 (6): Zhao HX, Sun YH, Ding MY, et al. Simultaneous Determination of Tetracyclines and Quinolones Residues in Animal Tissue by Ultra Perfbrmance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry and Muhiwalled Carbon Nanotubes Cleaning [J]. J Instru Anal, 2011, 30(6): [5] 陈辉华, 戴军, 王洪新, 等. HPLC 法对鱼肉中 3 种四环素类和 5 种氟喹诺酮类兽药残留的同时测定 [J]. 分析测试学报, 2008, 27(9): Chen HH, Dai J, Wang HX, et al. Simultaneous Multiresidue Determination of Tetracyclines and Fluoroqui-nolones in Fish Muscle Using High Performance Liquid Chromatography [J]. J Instrum Anal, 2008, 27(9): [6] 庞国芳, 曹彦忠, 张进杰, 等. 高效液相色谱法同时测定禽肉中土霉素四环素金霉素强力霉素残留的研究 [J]. 分析测试学报, 2005, 24(4): Pang GF, Cao YZ, Zhang JJ, et al. Simultaneous Determination of Oxytetracycline, Tetracycline, Chlortetracycline and Doxycycline in PoulW Meat by High Perform ance Liquid Chromatography [J]. J Instrum Anal, 2005, 24(4): [7] 马丽丽, 郭昌胜胡伟, 等. 固相萃取一高效液相色谱一串联质谱法同时测定土壤中氟喹诺酮四环素和磺胺类抗生素 [J]. 分析化学, 2010, 38(1): Ma LL, Guo CS, Hu W, et al. Simultaneous Extraction and Determination of Eighteen Fluoroquinolone, Tetracycline and Sulfonamide Antibiotics from Soils Using Solid-phase Extraction and Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry[J]. Chin J Anal Chem, 2010, 38(1): [8] 张春艳, 潘国卿, 白国涛, 等. 直接提取快速测定牛奶及奶粉中四环素残留量 [J]. 中国乳品工业, 2009, 37(2): Zhang CY, Pan GQ, Bai GT, et al. HPLC determ ination of oxytetracycline, tetracycline, chlorotetrecycline, doxycycline by direct extraction in m ilk and milk saturate powder [J]. China Dairy Ind, 2009, 37(2): [9] 岳振峰, 邱月明, 林秀云, 等. 高效液相色谱串联质谱法测定牛奶中四环素类抗生素及其代谢产物 [J]. 分析化学, 2006, 34(2): Yue ZF, Qiu YM, Lin XY, et al. Determination of Multi-Residues of Tetracyclines and Their Metabolites in Milk by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Positive-ion Electrospray Ionization Mass Spectrometry[J].Chin J Anal Chem, 2006, 34(2): [10] 郭黎明, 朱奎, 江海洋, 等. 超高效液相色谱串联质谱法同时测定鸡肝中残留的四环素类磺胺类和喹诺酮类药物 [J]. 色谱, 2009, 27(4): Guo LM, Zhu K, Jiang HY, et al. Simultaneous determination of tetracyclines,sulfonamides and quinolones residues in chicken livers by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry [J]. Chin J Chromatogr, 2009, 27(4): ( 责任编辑 : 赵静 ) 作者简介连英杰, 助理工程师, 主要研究方向为食品有毒有害物质分析 lyj @126.com 吴敏, 高级工程师, 主要研究方向为食品有毒有害物质分析 shimianhe74@sina.com

DOI /j.issn Food Research And Development UPLC-MS/MS 5 0.

DOI /j.issn Food Research And Development UPLC-MS/MS 5 0. 118 217 5 38 1 DOI 1.3969/j.issn.5-6521.217.1.28 Food Research And Development 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1. 731 2. 731 - UPLC-MS/MS 5. 1 mol/l ProElut PXC 5 % - Thermo Hypersil Gold mm 2.1 mm 1.9 μm ESI