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1 依据日本肯定列表使用 SPE 柱及 LC- MS/MS 对肉类样品中的兽药 (I) 和 (II) 进行多残留分析应用报告食品与农业作者 Eugene Chang, Kazuyuki Yamashita 和 Ritu Arora 安捷伦科技有限公司 252 Commercentre Drive Lake Forest, CA 9263 美国引言相当于美国 FDA 的日本厚生劳动省 (MHLW) 于 26 年 5 月 29 日起开始实施日本肯定列表制度, 用以限定食品中的农业化学品 [1] 此项法规的颁布旨在禁止含有超过最大残留限量 (MRL) 农业化学品的化学污染食品流入市场农业化学品包括农药饲料添加剂和兽药该法规适用于所有国产和进口食品, 涉及近 8 种化学品由于日本是西太平洋 / 大洋洲地区的最大进口国, 所以大多数食品出口国必须遵守此准则此法规的检验方案采用经典的 SPE 柱和 LC/MS 或 GC/MS 技术, 要求农业化学品的残留量不超出 MRL( 通常为.1 ppm) 本文描述了不同肉类基质中 45 种中性碱性和酸性兽药的分析, 残留量均低于日本肯定列表规定的 MRL (.1 ppm) 通过采用 Hydromatrix 硅藻土 Bond Elut Plexa SPE 柱 Pursuit C18 HPLC 色谱柱及 MS 检测, 安捷伦提供了肉中兽药测定的完整解决方案

2 材料与方法为了便于检测和分离, 将药物分为两组组 1 主要由碱性化合物组成, 而组 2 由酸性和碱性化合物组成两组药物使用不同的 LC 和 MS/MS 条件 ( 方法 (I) 和方法 (II), 见表 1) 进行分析, 但采用相同的样品前处理方法表 1. 方法 (I) 和 (II) 中的分析物方法 (I) 方法 (II) 2- 氨基 -5- 丙磺酰基苯并咪唑林可霉素噻菌灵磺胺醋酰左旋咪唑达氟沙星磺胺嘧啶赛拉嗪磺胺噻唑克伦特罗甲氧苄啶敌百虫 (DEP) 磺胺吡啶替米考星奥美普林息疟定磺胺甲基嘧啶氟苯尼考甲砜氯霉素 2- 乙酰氨基 -5- 硝基噻唑磺胺二甲嘧啶氯舒隆磺胺甲氧哒嗪氨磺磷磺胺莫托辛氢化可的松磺胺氯哒嗪泰妙菌素磺胺多辛地塞米松磺胺地托辛波尼松龙磺胺甲基异噁唑仲丁威 (BPMC) 乙氧酰胺苯甲酯埃玛菌素磺胺喹噁啉双硫磷 (Abate) 磺胺硝苯丙烯菊酯 β- 群勃龙莫能菌素 α- 群勃龙醋酸美仑孕酮玉米赤霉醇材料与试剂基质鸡肉猪肉和牛肉过滤器 Hydromatrix( 部件号 1983) SPE 柱 Bond Elut Plexa,3 ml,6 mg( 部件号 ) 色谱柱 Pursuit C18,3. 15 mm,3 µm( 部件号 A3115X3) 标准品含碱性酸性和中性分析物的药物混合溶液,PL-2-1 及 PL-1-3 (Wako, Japan) 浓度每种药物浓度为 2 µg/ml, 溶于甲醇中泵 Agilent 212-LC 检测器 Agilent 32-MS LC/MS 两种方法共同的样品前处理步骤 1. 称取 5 g 肉类样品 2. 加入 1 ml 乙腈 / 甲醇 /.2% 偏磷酸 (1:1:3) 溶液, 搅匀并经含 2-3 mm 厚 Hydromatrix 硅藻土的滤纸减压过滤用 2 ml 乙腈 / 甲醇 /.2% 偏磷酸 (1:1:3) 溶液冲洗硅藻土层经含硅藻土的滤纸减压过滤 3. 合并滤液, 并蒸发至 2 ml 4. 用 5 ml 甲醇 5 ml 2% 氨水活化 Bond Elut Plexa 柱, 上样, 用 5 ml 2% 氨水淋洗, 然后用 5 ml 甲醇洗脱样品 5. 4 ºC 蒸干溶剂 6. 用 1 ml 乙腈 : 水 (1:9) 溶液复溶样品与日本肯定列表配合的动物产品中兽药的标准分析方法尚未发布但是, 已有政府推荐使用的检测方法, 经过少许修改即为以下给出的方法 (I) 和方法 (II) 样品用 Hydromatrix 硅藻土过滤, 随后采用 Bond Elut Plexa SPE 柱进行前处理, 可以有效消除基质干扰当用乙腈 / 甲醇 / 偏磷酸混合溶液处理肉类样品时会使蛋白质变性, 故必须使用 Hydromatrix 等硅藻土产品来消除浑浊用甲醇和 2% 的氨水活化 Bond Elut Plexa 柱, 与通常使用甲醇和水活化不同, 用氨水活化能够带来更高的回收率两种方法中大多数化合物均采用供应商提供的分析证书中的 MRM 离子对进行分析, 但有些情况下为了获得更好的灵敏度, 采用了不同的监测离子所有分析物使用的 MS/MS 离子对详细列于表 2 和 3 中由于一些化合物在高温时不稳定, 所以两种方法中均包括了干燥气的温度控制程序 2

3 方法 (I) LC 条件流动相 A 乙腈 +.1% 甲酸溶液方法 (II)LC 条件流动相 A 乙腈 +.1% 甲酸溶液流动相 B 水 +.1% 甲酸溶液流动相 B 水 +.1% 甲酸溶液柱温 4 ºC 梯度程序时间 (min) %A %B 流速 (µl/min) 柱温 4 ºC 梯度程序时间 (min) %A %B 流速 (µl/min) 方法 (I) MS 条件岐管温度 4 ºC API 外壳温度 65 ºC API 干燥气程序 4 ºC 保持 19 min,1 min 内降至 3 ºC, 保持 15 min 表 2. 方法 (I)MS/MS 离子对详情化合物母离子子离子 ESI 模式碰撞能量 2- 氨基 -5- 丙磺酰基苯并咪唑 (+) 21.5 噻菌灵 (+) 8. 左旋咪唑 (+) 16. 磺胺嘧啶 (+) 15. 磺胺噻唑 (+) 6. 甲氧苄啶 (+) 1.5 磺胺吡啶 (+) 13.5 奥美普林 (+) 14. 磺胺甲基嘧啶 (+) 11.5 甲砜氯霉素 (+) 8. 磺胺二甲嘧啶 (+) 19. 磺胺甲氧哒嗪 (+) 14.5 磺胺莫托辛 (+) 14.5 磺胺氯哒嗪 (+) 8. 磺胺多辛 (+) 17.5 磺胺地托辛 (+) 17.5 磺胺甲基异噁唑 (+) 12. 乙氧酰胺苯甲酯 (+) 15. 磺胺喹噁啉 (+) 12. 磺胺硝苯 (+) 19.5 β- 群勃龙 (+) 38. α- 群勃龙 (+) 38. 醋酸美仑孕酮 (+) 14. 玉米赤霉醇 (+) 21. 方法 (II)MS 条件岐管温度 4 ºC API 外壳温度 65 ºC API 干燥气程序 275 ºC 保持 19 min,1.25 min 内升至 4 ºC, 保持 16 min 表 3. 方法 (II)MS/MS 离子对详情化合物母离子子离子 ESI 模式碰撞能量林可霉素 (+) 19.5 磺胺醋酰 (+) 11. 达氟沙星 (+) 18.5 赛拉嗪 (+) 1.5 克伦特罗 (+) 9.5 敌百虫 (DEP) (+) 9.5 替米考星 (+) 14. 息疟定 (+) 19. 氟苯尼考 (-) 乙酰氨基 -5- 硝基噻唑 (-) 13. 氯舒隆 (-) 1.5 氨磺磷 (+) 2.5 氢化可的松 (+) 14.5 泰妙菌素 (+) 12. 地塞米松 (+) 5. 波尼松龙 (+) 13. 仲丁威 (BPMC) (+) 1.5 埃玛菌素 (+) 19. 双硫磷 (Abate) (+) 19.5 丙烯菊酯 (+) 7. 莫能菌素 (+) 3.5 3

4 结果与讨论图 1 和图 3 显示了方法 (I) 和方法 (II) 中标准品 LC-MS/MS 分析的总离子流和 MRM 色谱图 Pursuit C18 色谱柱使方法 (I) 中三对同分异构体均达到基线分离这表明 LC 的强大性能已经使 MS 检测能力显得捉襟见肘两种方法使用相同的色谱柱进行分离总之, 该色谱柱非常适用于兽药多残留分析 75 5 图 2 和图 4 是方法 (I) 和 (II) 中标准品的 1 ppb 混合物和加标基质 ( 鸡肉猪肉和牛肉 ) 的总离子流色谱图每种肉类基质净化后谱图差异极小, 显示出 Bond Elut Plexa 柱拥有极佳的净化能力使用 Bond Elut Plexa 柱对加标 1 ppb 的鸡肉猪肉和牛肉进行前处理, 两种方法所涉及的所有分析物的回收率及 RSD 值列于表 4 和表 5 中该方法的重现性良好, 大多数化合物的 RSD 值小于 1%, 最大的 RSD 值也仅为 3.6% 所有药物的回收率在 65%- 115% 之间, 大多数药物的回收率在 75%-1% 范围内这些回收率结果均符合 EU 和 CDFA 的要求 [2] min 22.1 > [-8. V] 24.1 > [-21.5 V] 25.1 > 178. [-16. V] > 92.1 [-15. V] 256. > 156. [-6. V] > 23.1 [-1.5 V] 25. > [-13.5 V] > [-14. V] > [-11.5 V] 356. > 38. [-8. V] > 92.1 [-19. V] > [-14.5 V] > [-8. V] > [-17.5 V] 254. > [-12. V] min 图 2. 对方法 (I) 中 1 ppb 标准品混合物和加标基质 ( 鸡肉猪肉和牛肉 ) 进行定量分析的总离子流色谱图 -α > 136. [-15. V] 31. > [-12. V] > [-19.5 V] > [-38. V] > (-)[21. V] > [-14. V] min 图 1. 使用 Agilent Pursuit C18 色谱柱进行方法 (I) 中标准品的 LC-MS/MS 分析的总离子流色谱图和 MRM 色谱图 4

5 min > [-19.5 V] > 156. [-11. V] (DEP) > 34.1 [-18.5 V] > 9.1 [-1.5 V] > 24.1 [-9.5 V] 259. > 19.1 [-9.5 V] > 143. [-14. V] > [-19. V] > (-) [18. V] 186. > (-) [13. V] > (-) [1.5 V] > 147. [-13. V] > [-14.5 V] > [-12. V] > [-5. V] min 图 4. 对方法 (II) 中 1 ppb 标准品混合物和加标基质 ( 鸡肉猪肉和牛肉 ) 进行定量分析的总离子流色谱图 326. > 93.1 [-2.5 V] 28.1 > 95.1 [-1.5 V] (BPMC) > [-19. V] (Abate) 467. > [-19.5 V] 33. > 135. [-7. V] > [-3.5 V] min 图 3. 使用 Agilent Pursuit C18 色谱柱进行方法 (II) 中标准品的 LC-MS/MS 分析的总离子流色谱图和 MRM 色谱图 5

6 表 4. 方法 (I): 使用 Agilent Bond Elut Plexa 柱对鸡肉猪肉和牛肉中的兽药进行多残留萃取, 于 1 ppb 检测限计算回收率鸡肉猪肉牛肉化合物 C (ppb) RSD 回收率 (%) C (ppb) RSD 回收率 (%) C (ppb) RSD 回收率 (%) 2- 氨基 -5- 丙磺酰基苯并咪唑噻菌灵左旋咪唑磺胺嘧啶磺胺噻唑甲氧苄啶磺胺吡啶奥美普林磺胺甲基嘧啶甲砜氯霉素磺胺二甲嘧啶磺胺甲氧哒嗪磺胺莫托辛磺胺氯哒嗪磺胺多辛磺胺甲基异噁唑乙氧酰胺苯甲酯磺胺喹噁啉磺胺地托辛磺胺硝苯 β- 群勃龙 α- 群勃龙醋酸美仑孕酮玉米赤霉醇

7 表 5. 方法 (II): 使用 Agilent Bond Elut Plexa 柱对鸡肉猪肉和牛肉中兽药进行多残留萃取, 于 1 ppb 检测限计算回收率鸡肉猪肉牛肉化合物 C (ppb) RSD 回收率 (%) C (ppb) RSD 回收率 (%) C (ppb) RSD 回收率 (%) 林可霉素磺胺醋酰达氟沙星赛拉嗪克伦特罗敌百虫 (DEP) 替米考星息疟定氟苯尼考乙酰氨基 -5- 硝基噻唑氯舒隆波尼松龙氢化可的松泰妙菌素地塞米松仲丁威 (BPMC) 埃玛菌素双硫磷 (Abate) 氨磺磷丙烯菊酯莫能菌素

8 结论本文开发了一种在多种肉类基质中, 根据日本肯定列表中要求的 MRL(.1 ppm) 范围, 联合使用 SPE 和 HPLC 产品进行有挑战性的兽药多残留分析的全面解决方案考查的肉类基质包括鸡肉猪肉和牛肉采用两种方法, 使用 SPE 柱和 LC-MS/MS 对 45 种化合物进行分析利用 Hydromatrix 硅藻土过滤消除浑浊 Bond Elut Plexa 柱净化样品基质得到了高重现性结果, 大多数化合物的 RSD 值均小于 1% 同时, 两种方法也表现出良好的回收率, 大多数化合物的回收率均在 75%-1% 范围内 Pursuit C18 色谱柱使方法 (I) 中的三对同分异构体均达到基线分离, 表明 LC 的强大性能已经使 MS 检测能力显得捉襟见肘 Pursuit C18 色谱柱适用于兽药多残留分析本文开发的两种分析方法均满足或超过日本肯定列表设定的 1 ppb 检测限的要求两种方法均表现出灵敏度高结果可靠成本效益好的特点参考文献 1. Positive List System for Agricultural Chemical Residues in Foods Quality Control Procedures for Pesticide Residues Analysis. SANCO/1232/26, 24 March ec.europa.eu/food/plant/resources/qualcontrol_en.pdf 更多信息这些数据代表了典型的结果如需了解更多有关我们产品和服务的信息, 请访问我们的网站安捷伦对本资料可能存在的错误或由于提供展示或使用本资料所造成的间接损失不承担任何责任本资料中的信息说明和技术指标如有变更, 恕不另行通知安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司, 年 9 月 27 日, 中国印刷 CHCN

试验部分 1.1 仪器, 试剂与材料 Waters ACQUITY UPLC I-Class FTN Waters Xevo TQ-S 三重四极杆质谱纯水机,Milli-Q 台式高速离心机漩涡震荡仪移液枪乙腈,HPLC 级 Oasis PRiME HLB 固相萃取柱,60 mg,3 ml 1.2 样

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