2 keword:antibiotic;lc-ms/ms;pretreatment method 1 引言近些年来, 抗生素 (antibiotics) 作为一种广泛使用的药物, 大量使用后进入环境中并且造成了严重的生态环境问题, 已经引起了人们的广泛关注由于抗生素主要是极性化合物, 具有亲水

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凡初陈
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1 :27:48 第 22 卷第 X 期 Vol.22 No.X 年 X 月 JOURNAL OF SHANGHAI UNIVERSITY (NATURAL SCIENCE) Dec DOI: /j.issn 高效液相色谱 - 串联质谱法对水环境中 12 种抗生素的检测徐晖, 吴明红, 徐刚 (1. 上海大学环境与化学工程学院, 上海 ) 摘要 : 本实验利用固相萃取 (SPE) 及液相色谱 - 电喷雾串联质谱联用 (LC-MS/MS) 技术, 建立了水体中痕量磺胺类 β- 内酰胺类四环素类喹诺酮类大环内酯类共 12 种抗生素的定量分析方法水样中的 12 种抗生素通过 HLB 小柱的萃取富集后, 以乙腈为有机相 0.2% 甲酸和醋酸铵混合水溶液为水相, 采用 LC-MS/MS 进行定量分析抗生素采用 ESI 离子源, 多反应监测模式 (MRM), 以 13 C 3 - 咖啡因作为内标物进行定量检测抗生素在河水中的方法定量限分别为 ~4.805 ng /L, 回收率分别为 71%-90% 该方法被应用于分析南陈河 ( 上海 ) 中抗生素的含量, 平均浓度为 2.04ng/L ng/L 关键词 : 抗生素 ;LC-MS/MS; 样品前处理中图分类号 :O 658 文献标志码 :A Analytical Methods of 12 antibiotics in aqueous Environment 收稿日期 : XU Hui,WU Ming-hong,XU Gang (School of Environmental and Chemical Engineering, Shanghai University, Shanghai , China) Abstrect:The study has established a quantitative method for trace detection of 12 antibiotics including sulfonamides, β -lactams, fluoroquinolones, tetracyclines, macrolides in waters using solid phase extraction(spe) coupled to liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). After enriching thought HLB cartridges, 12 antibiotics were detected by LC-MS/MS with the organic phase of acetonitrile and aqueous phase of 5 mmol /L ammonium acetate 0.2 % formic acid. The antibiotics were quantified with multiple reaction monitoring (MRM) mode by internal standard of 13 C 3 -caffeine. The quantification limits for the antibiotics were ~4.805 ng /L in river water and the recoveries ranged from 71% to 90%. The method was applied for detection of the antibiotics in Nanchen River (Shanghai) and the mean concentrations of antibiotics were from 2.04ng/L ng/L. 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 ( , , , , ) 通信作者 : 吴明红 (1968~), 女, 教授, 研究方向为环境控制和环境毒理学. mhwu@staff.shu.edu.cn

2 2 keword:antibiotic;lc-ms/ms;pretreatment method 1 引言近些年来, 抗生素 (antibiotics) 作为一种广泛使用的药物, 大量使用后进入环境中并且造成了严重的生态环境问题, 已经引起了人们的广泛关注由于抗生素主要是极性化合物, 具有亲水挥发性弱等特征, 因此自然水体是抗生素主要的存在介质 [1], 随着抗生素研究的加深, 目前已经从表面水体 [2-4], 地下水 [5], 饮用水 [6] [7-8], 城市污水等多种环境水体中检出抗生素的存在目前常用的抗生素检测方法主要有酶联免疫测定法 (ELISA) 高效液相色谱法 (HPLC) [9-11] [7, 及液相色谱 - 串联质谱法 (LC-MS/MS) 等 12-13], 近年来,LC - MS/MS 技术由于其高灵敏度低检测限而被广泛地用于抗生素药物等极性, 非挥发性性污染物的分析 [14] 本研究利用固相萃取技术 (SPE), 结合 LC-MS/MS 作为分析技术, 使用内标定量的方法建立检测河流水体中痕量的磺胺类 (sulfonamides) β- 内酰胺类 (β-lactams) 四环素类 (tetracyclines) 喹诺酮类 (fluoroquinolones) 大环内酯类(macrolides) 共 5 大类 12 种抗生素残留的方法, 并应用该方法初步采样分析了河水中的抗生素残留, 浓度为 2.04ng/L ng/L 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 Agilent 1200 高效液相色谱, 配自动进样器 ;Agilent 6460 三重四极杆串联质谱仪, 配有电喷雾电离源 ( ESI);12 孔固相萃取装置 ( 安谱 );HLB 固相萃取小柱 (500 mg / 6 ml, Waters 公司 ); 中速定性滤纸 ( 国药 );0.7μm 滤膜 ( 英国 Maidstone 公司 ); 甲醇乙腈醋酸铵均为色谱纯 (Merck 公司 ); 甲酸为色谱纯 ( 安谱 ); 实验室制备的超纯水 ;; 乙二胺四乙酸二钠盐 (EDTA-2Na) 为分析纯 ( 国药 ) 磺胺嘧啶 (sulfadiazine,sd) 磺胺甲噁唑(Sulfamethoxazole,SMX) 磺胺二甲基嘧啶 (s ulfamethazine,smz) 头孢氨卡(cefalexin,CFX) 阿莫西林(Amoxicillin,AMOX) 四环素 (tetracyclines,tc) 土霉素 (oxytetracycline,otc) 恩诺沙星(enrofloxacin, ENR) 氧氟沙星(ofloxacin,OFL) 红霉素(erythromycin,ERY) 罗红霉素 (roxithromycin, ROX) 螺旋霉素(spiramycin,SPI) 均购自 Ehrenstofer GmbH 公司 ( 德国 ); 内标 13 C 3 - 咖啡因购自 Cerilliant 公司 ( 美国 ) 标准溶液的配制 : 分别称取 12 种抗生素适量的标准样品 ( 精确到 0.01 mg), 溶解于 10 ml 甲醇, 于 4 状态下保存内标物储备液的制备 : 将内标溶液用甲醇溶解于 100 ml 容量瓶中, 用甲醇定容配成 10 mg /L 的储备液, 于 4 保存 2.2 样品采集本研究于上海宝山区南陈河采集河水 500ml, 其中水样采集瓶为超声清洗后的棕色瓶, 采集时先用河水润洗两次水样经采集后经过中速定性滤纸过滤后, 再经 0.7μm 滤膜过滤, 之后于 500ml 样品滤液中分别加入 0.1gEDTA 二钠, 并且用硫酸调节 ph 值至 3.0 左

3 徐晖, 等 : 高效液相色谱 - 串联质谱法对水环境中 12 种抗生素的检测 3 Compound 右, 分别加入 100 ng 内标物质, 采集完的样品于 3 天内处理完毕 2.3 样品前处理 HLB 小柱 (6 ml, 500 mg, Waters) 经活化后 ( 分别用 6ml 甲醇超纯水 100ml 加 0.1g 的 EDTA 二钠水溶液 (ph ) 淋洗 Oasis HLB 萃取小柱 ), 使 500ml 水样通过 HLB 固相萃取系统, 以 10ml/min 的流速通过小柱, 待所有样品过柱后, 用 10ml(pH ) 超纯水淋洗小柱, 真空抽气干燥 1 小时, 使用 6ml 甲醇洗脱小柱, 洗脱液收集于 10ml 氮吹管, 然后氮吹洗脱液至 0.2ml, 用甲醇定容至 1ml 最终样品的富集倍数为 500 倍 2.4 色谱条件安捷伦 C18 色谱柱 (3.0mm 100mm,2.7μm); 柱温 :40 ; 进样量 :5μL; 流速 : 0.4mL /min; 流动相 A: 乙腈, 流动相 B: 含 0.2% 甲酸和 5mmol 醋酸铵溶液 ; 梯度洗脱顺序 : 0-5 min, 0% -13%A; 5-10 min, 13%-20%A; min, 20%-90%A 2.5 质谱条件采用电喷雾离子源 (ESI), 分析物在正离子扫描下以多反应监测 (MRM) 模式分析其中毛细管电压 :4.5 kv; 射频透镜电压 :0.5V; 离子源温度 :90 ; 脱溶剂温度 :350 ; 脱溶剂气流速 :500 L / h; 锥孔反吹气流速 :30 L / h; 检测模式 :MRM 12 种抗生素的检测参数见表 1 表 1 抗生素的 LC - MS / MS 主要参数 Table 1 Instrumental analysis data about 12 antibiotics and 1 surrogate standard Precursor ion (m/z) Quantitative ion (m/z) Qualitative ion (m/z) Fragment (V) collision energy (ev) Cone voltage Sulfadiazine ulfamethoxazole Sulfamethazine Cefalexin Amoxicillin Enrofloxacin Ofloxacin Tetracycline Oxytetracycline Macrolide Roxithromycin Spiramycin C 3 -Caffeine 结果与讨论 3.1 液相色谱 - 串联质谱条件的优化色谱条件该实验比较了乙腈和甲醇作为 LC - MS/MS 流动相的有机相, 结果使用乙腈作为流动相时, 图谱基线较低, 出峰峰形 ; 而甲醇作为流动相时, 基线较高, 部分出峰有峰形拖尾的现象实验还比较了 0.1 % 0.2 % 0.3% 的甲酸以及纯水作为水相流动相对抗生素 (ev)

4 4 类药物出峰的影响, 结果发现随着甲酸, 各抗生素的母离子丰度提高, 峰形变差 ; 总体比较发现, 甲酸浓度为 0.2% 时, 离子出峰峰形与丰度的综合效果达到最佳于此同时, 已有研究表明 [7], 在流动相中加入醋酸铵改善离子出峰峰形, 减少峰形拖尾的现象所以, 实验最终选择乙腈和 0.2 % 甲酸以及 5 mmol /L 醋酸铵的混合溶液作为水相流动相质谱条件根据所选取抗生素的分子结构及其物理化学性质, 该实验选择了 ESI 源作为离子源实验在正离子模式下, 使用单离子检测扫描 (SIM) 扫描模式对各抗生素的母离子进行扫描, 优化仪器参数, 找到适合的裂解电压, 使母离子丰度达到最佳 ; 然后根据得到的准分子离子峰, 以适当的碰撞能量对准分子离子进行碰撞, 对所得的碎片离子进行子离子扫描, 选择其中响应值最强的子离子作为定量离子, 选择响应值相对较强并且作为特征离子峰的离子作为定性离子 ; 最后选择 MRM 扫描模式对子离子进行碰撞能量的优化, 得到定量离子和定性离子的最佳碰撞电压优化后的仪器参数以及各抗生素的母离子与子离子见表 1 由于本实验检测的 12 种抗生素在正离子模式下均可成功电离, 故不需要采用负电子模式, 可于正电子模式下一次性进样得到相关检测数据 3.3 固相萃取条件的优化在预处理过程中, 为了达到最佳萃取效果, 使水样中抗生素的回收率达到最高, 本研究进一步优化了 SPE 技术的相关条件本研究对超纯水中在 ph 值 2.0,3.0,4.0,7.0 四种条件下的各类抗生素的回收率进行了对比试验如表 2 所示, 结果发现, 在 ph 值为 3.0 的条件下, 抗生素的回收率达到最佳故实验在采集水样中添加硫酸, 调节 ph 值为 3.0; 同时在调节 SPE 小柱第三次活化液以及萃取过程中清洗液 ph 值为 3.0, 从而保证整个萃取过程中, 小柱内部的 ph 值保持稳定另一方面, EDTA 二钠溶液的加入阻止了大环内酯类抗生素与样品中金属离子可能产生的螯合作用, 大幅提高萃取效率, 同时对磺胺类等其它抗生素的萃取没有不利影响表 2 12 种抗生素在不同 ph 条件下的回收率 (%) Table 2 The recovery rate(%)of 12 antibiotics in different ph conditions Compound ph 2.0 ph 3.0 ph 4.0 ph 7.0 Sulfadiazine Sulfamethoxazole Sulfamethazine Cefalexin Amoxicillin Enrofloxacin Ofloxacin Tetracycline Oxytetracycline Macrolide Roxithromycin Spiramycin C 13 -Caffeine

5 徐晖, 等 : 高效液相色谱 - 串联质谱法对水环境中 12 种抗生素的检测线性范围和检出限由于水环境中存在的高浓度的溶解有机质可能导致检测过程中 LC-MS/MS 信号增强或减弱, 从而影响实际样品定量结果的准确性, 为了保证检测结果的准确性与可靠性, 本实验加入 100ng 内标物 13 C 3 - 咖啡因, 对实际样品内标物的质谱响应面积与标准样品中内标物面积的比值进行计算, 确定实际样品的回收率内标物 13 C 3 - 咖啡因在近些年的实验中, 被广泛用于作为检测抗生素类物质的内标 [7-8] 本实验配置 μg /L 的系列混合工作标准溶液 ( 含 12 种抗生素以及内标物质 ), 绘制标准工作曲线 12 种抗生素的线性关系及在实际样品中的方法定量下限 (S /N 10) 见表 3 表 3 抗生素的保留时间方法定量下限线性范围与 R 2 Table 3 The retention time, LOQ (Limit of quantification), Line range and R 2 of antibiotics compound retention time (min) quantification limit (ng/l)(s/n 10) Line rang ρ/(μg/l) Sulfadiazine ~ Sulfamethoxazole ~ Sulfamethazine ~ Cefalexin ~ Amoxicillin ~ Enrofloxacin ~ Ofloxacin ~ Tetracycline ~ Oxytetracycline ~ Macrolide ~ Roxithromycin ~ Spiramycin ~ C 13 -Caffeine ~ R 加标回收率实验为了确定方法的准确性以及稳定性, 本实验选取超纯水样品 6 个和实际河水样品 6 个, 分别加入抗生素标样与内标物质 ( 每种化合物 100 ng), 计算抗生素在不同水体中的回收率其中 100ng 各种抗生素与 13 C 3 - 咖啡因内标于超纯水样品中的加标质谱图如图 1, 图 2, 图 3, 图 4 每 6 个样品加入过程空白样品以保证预处理过程的准确性且所有加标样品均釆用相同方法进行预实验和处理分析, 各抗生素在超纯水和河水中的回收率与相对标准偏差见表 3

6 6 图 1 超纯水中磺胺类抗生素与 C13- 咖啡因加标 (100ng) 回收率实验质谱图 Fig.1 MRM chromatogram of sulfonamides antibiotics and C 13 -Caffeine recovery in pure water samples 图 1 超纯水中内酰胺类与喹诺酮类抗生素加标 (100ng) 回收率实验质谱图 Fig.1 MRM chromatogram of β-lactams and fluoroquinolones antibiotics recovery in pure water samples

7 徐晖, 等 : 高效液相色谱 - 串联质谱法对水环境中 12 种抗生素的检测 7 图 1 超纯水中四环素类与螺旋霉素抗生素加标 (100ng) 回收率实验质谱图 Fig.1 MRM chromatogram of tetracyclines and spiramycin antibiotics recovery in pure water samples 图 1 超纯水中红霉素与罗红霉素抗生素加标 (100ng) 回收率实验质谱图 Fig.1 MRM chromatogram of erythromycin and roxithromycin antibiotics recovery in pure water samples 表 4 抗生素的回收率与相对标准偏差 Table 4 The recoveries and relative standard deviations(rsds) of antibiotics compound ultrapure water river water Recovery/% RSD s r /% Recovery/% RSD s r /% Sulfadiazine Sulfamethoxazole

8 8 Sulfamethazine Cefalexin Amoxicillin Enrofloxacin Ofloxacin Tetracycline Oxytetracycline Macrolide Roxithromycin Spiramycin 实际样品检测本研究在上海地区南陈河进行了采样与实际样品浓度检测, 其中有 10 种物质成功检出, 没检测到的物质为四环素与螺旋霉素在检测出的 10 种物质中, 其中平均浓度最高的为氧氟沙星, 浓度为 ng/L; 浓度最低的为磺胺二甲基嘧啶, 浓度为 2.04ng/L 表 4 实际样品检测结果 (ng/l) Table 4 Determination results of real samples Compound SD SMX SMZ CFX ENR OFL AMOX OTC ERY ROX River water 参考文献 : [1] Kümmerer, K. Antibiotics in the aquatic environment a review Part I. Chemosphere[J], 2009,75: [2] 尹燕敏, 沈颖青, 朱月芳, 秦宏兵. 超高效液相色谱 - 串联质谱法同时测定水和沉积物中磺胺类喹诺酮类和氯霉素类抗生素残留. 分析科学学报 [J],2015,31(3), [3] Yan C.C, Yang Y, Zhou J.L, Liu M, Nie M.H, Shi H, Gu L.J. Antibiotics in the surface water of the Yangtze Estuary: occurrence, distribution and risk assessment. Environment Pollution[J], 2013;175: [4] Chen, K., Zhou, J.L. Occurrence and behavior of antibiotics in water and sediments from the Huangpu River, Shanghai, China. Chemosphere[J],2014,95, [5] 周爱霞, 苏小四, 高松, 张玉玲, 林学钰, 张兰英, 安永磊. 高效液相色谱测定地下水土壤及粪便中 4 种磺胺类抗生素. 分析化学 [J], 2014,43(3), [6] Focazio M.J, Kolpin D.W, Barnes K.K, Furlong E.T, Meyer M.T, Zaugg S.D, Barber, L.B, Thurman, M.E. A national reconnaissance for pharmaceuticals and other organic wastewater contaminants in the United States II) untreated drinking water sources. Science of Total Environment [J], 2008,402: [7] Xu W.H, Zhang G, Li X.D, Zou S.C, Li P, Hu Z.H, Li, J. Occurrence and elimination of antibiotics at four sewage treatment plantsin the Pearl River Delta (PRD), South China. Water Research[J], 2007,41: [8] Zhou L.J, Ying G.G, Liu S, Zhao J.L, Yang B, Chen Z.F, Lai, H.J. Occurrence and fate of eleven classes of antibiotics in two typical wastewater treatment plants in South China. Science of Total Environment[J] 2013, : [9] 欧阳红军, 何衍彪, 林玲. 高效液相色谱法测定食用菌 4 种农药的残留量. 南方农业学报 [J], 2015, 11(3) :

9 徐晖, 等 : 高效液相色谱 - 串联质谱法对水环境中 12 种抗生素的检测 9 [10] 李彦文, 莫测辉, 赵娜, 张瑞京, 亦如翰. 高效液相色谱法测定水和土壤中磺胺类抗生素. 分析化学 [J], 2008, 36 (7) : [11] 邵金良, 杨东顺, 王丽, 杜丽娟, 严红梅, 樊建麟, 刘宏程. 固相萃取 - 高效液相色谱法同时测定牛奶中 13 种磺胺残留. 分析实验室 [J],2014, 33 (11) : [12] 邓鸣, 张科明, 朱斌. 液相色谱 - 串联质谱法测定水产品中 β- 内酰胺类抗生素的残留. 食品工业科学 [J], 2013, 34 (16): [13] 刘正才, 杨方, 李耀平, 余孔捷, 王武军, 叶松生. UPLC - MS/MS 对鳗鱼中 26 种喹诺酮类及磺胺类抗生素药物残留的快速测定. 分析测试学报 [J], 2008, 27 (11): [14] Bu Q.W, Wang B, Huang J, Deng S.B, Yu G. Pharmaceuticals and personal care products in the aquatic environment in China: A review. J. Hazard. Mater 2013, 262:

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.

2 keword:antibiotic;lc-ms/ms;pretreatment method 1 引言 近些年来, 抗生素 (antibiotics) 作为一种广泛使用的药物, 大量使用后进入环境中并且造成了严重的生态环境问题, 已经引起了人们的广泛关注 由于抗生素主要是极性化合物, 具有亲水

2 keword:antibiotic;lc-ms/ms;pretreatment method 1 引言近些年来, 抗生素 (antibiotics) 作为一种广泛使用的药物, 大量使用后进入环境中并且造成了严重的生态环境问题, 已经引起了人们的广泛关注由于抗生素主要是极性化合物, 具有亲水