上 海 农 业 学 报 57 氟 喹 诺 酮 类 (Fluoroquinolones,FQs) 作 为 一 类 人 工 合 成 高 效 广 谱 抗 菌 药 在 规 模 化 畜 禽 养 殖 中 大 量 使 用, 但 其 基 本 不 能 被 动 物 吸 收, 大 部 分 以 药 物 原 形 或 其 代

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1 上 海 农 业 学 报 2016,32(1):56 60 ActaAgriculturaeShanghai DOI: j.isn 文 章 编 号 : (2016) 液 相 色 谱 串 联 质 谱 法 检 测 有 机 肥 中 4 种 氟 喹 诺 酮 类 抗 菌 药 饶 钦 雄 1, 赵 晶 1,2, 闵 红 3, 邵 婷 1,4, 孙 明 星 3, 罗 峰 5, 姚 春 霞 ( 1 上 海 市 农 业 科 学 院 农 产 品 质 量 标 准 与 检 测 技 术 研 究 所, 上 海 ; 2 华 东 师 范 大 学 地 理 科 学 学 院, 上 海 ; 3 上 海 出 入 境 检 验 检 疫 局, 上 海 ; 4 安 徽 师 范 大 学 环 境 科 学 与 工 程 学 院, 芜 湖 ; 5 上 海 市 崇 明 县 动 物 疫 病 预 防 控 制 中 心, 上 海 ) 摘 要 : 建 立 了 有 机 肥 中 4 种 氟 喹 诺 酮 类 抗 菌 药 的 液 相 色 谱 串 联 质 谱 (LC MSMS) 分 析 方 法 取 5g 有 机 肥 样 品 以 5mLNa 2 EDTA Mclvaine 缓 冲 溶 液 (ph=4.0) 与 20mL 乙 腈 乙 酸 =9 1(VV) 超 声 提 取 两 次, 用 HLB 固 相 萃 取 柱 进 行 净 化 富 集, 以 5% 氨 化 甲 醇 进 行 洗 脱, 氮 气 吹 干 后 以 溶 液 ( 三 乙 胺 + 磷 酸 + 水 = )+ 乙 腈 =88+12(VV) 复 溶 以 0.1% 甲 酸 水 和 甲 醇 作 为 流 动 相, 采 用 梯 度 洗 脱 方 式 LC MSMS 检 测 试 验 结 果 表 明, 有 机 肥 中 4 种 喹 诺 酮 类 化 合 物 不 同 浓 度 加 标 回 收 率 在 66.19% %, 相 对 标 准 偏 差 在 2.40% 9.45%, 检 出 限 为 0.010mgkg, 定 量 限 为 0.050mgkg, 本 方 法 能 够 满 足 实 际 有 机 肥 样 品 的 测 定 要 求 关 键 词 : 有 机 肥 ; 氟 喹 诺 酮 类 ; 检 测 方 法 ; 液 相 色 谱 串 联 质 谱 ; 提 取 剂 中 图 分 类 号 :X713 文 献 标 识 码 :A Determinationoffourfluoroquinolonesinmanureby liquidchromatography tandem masspectrometry RAOQin xiong 1,ZHAOJing 1,2,MINHong 3,SHAOTing 1,4,SUNMing xing 3,LUOFeng 5,YAOChun xia 1 ( 1 InstituteforAgro FoodQualityStandardsandTestingTechnology,ShanghaiAcademyofAgriculturalSciences, Shanghai201403,China; 2 SchoolofGeography,EastChinaNormalUniversity,Shanghai200241,China; 3 ShanghaiEntry ExitInspectionandQuarantineBureau,Shanghai200135,China; 4 ColegeofEnvironmental ScienceandEnginering,AnhuiNormalUniversity,Wuhu241003,China; 5 AnimalEpidemicDiseaseControl CenterofChongmingCounty,Shanghai202150,China) Abstract:Amethodofdetermining4fluoroquinolonesinmanurewasdevelopedbyliquidchromatography tandemmasspectrometry(lc MSMS).Amanuresample(5.0gDW)wasultrasonicalyextractedtwicewith 5 mlna 2 EDTA Mclvainebufersolution(pH4.0)and20 mlacetonitrileaceticacid(91,vv),purifiedand concentratedbyhlbsolid phasecartridgeandthenelutedwith5% ammoniatedmethanol.theresiduewasdis solvedinthecombinedsolution(triethylamine phosphoricacid water= ,VVV)andacetonitrile at88 12volumetricratioafterevaporatedtodrynesunderastreamofnitrogengas.With0.1% formicacid con tainingwaterandmethanolasmobilephasesandviagradientelution,theanalytewasdeterminedbylc MSMS. Theresultshowed thattherecoveryratesof4 fluoroquinolonesin diferentspiked manuresampleswere 66 19% % witharelativestandarddeviationof2.40% 9.45%,andthedetectionlimitandquantita tionlimitwere0.010mgkgand0.050mgkgrespectively,indicatingthatthismethodcouldmeettherequire mentfordeterminingactualmanuresamples. Keywords:Organicfertilizer;Fluoroquinolones;Detectionmethod;Liquidchromatography tandemmas spectrometry;extractant 收 稿 日 期 : 基 金 项 目 : 国 家 质 检 公 益 性 行 业 科 研 专 项 ( ); 上 海 市 自 然 科 学 基 金 (12ZR ); 上 海 市 科 委 重 点 支 撑 项 目 (14DZ ) 作 者 简 介 : 饶 钦 雄 (1979 ), 男, 硕 士, 助 理 研 究 员, 研 究 方 向 : 农 产 品 安 全 E mail:qinxiongrao@163.com 通 信 作 者 : 姚 春 霞 (1976 ), 女, 博 士, 副 研 究 员, 研 究 方 向 : 土 壤 和 农 产 品 安 全 E mail:chunxia.yao@163.com

2 上 海 农 业 学 报 57 氟 喹 诺 酮 类 (Fluoroquinolones,FQs) 作 为 一 类 人 工 合 成 高 效 广 谱 抗 菌 药 在 规 模 化 畜 禽 养 殖 中 大 量 使 用, 但 其 基 本 不 能 被 动 物 吸 收, 大 部 分 以 药 物 原 形 或 其 代 谢 物 随 粪 尿 排 出, 成 为 环 境 中 抗 菌 药 污 染 的 重 要 来 源 [1] 污 染 的 有 机 肥 料 广 泛 施 用 于 农 业 生 产 中, 影 响 土 壤 肥 力 危 及 农 产 品 质 量 安 全 [2], 还 可 通 过 地 表 径 流 和 淋 滤 作 用 造 成 水 体 的 污 染, 并 引 发 细 菌 耐 药 性, 进 而 威 胁 动 物 与 人 类 健 康 ; 因 此, 这 类 抗 菌 药 已 成 为 重 要 环 境 有 机 污 染 物 和 环 境 科 学 研 究 的 热 点 [3] 近 年 来, 多 数 科 研 者 已 用 高 效 液 相 色 谱 法 进 行 有 机 肥 中 兽 药 残 留 的 检 测, 就 目 前 报 道 的 方 法 而 言, 有 机 肥 中 兽 药 残 留 检 测 回 收 率 较 低, 检 测 方 法 复 杂 [4 5] 本 试 验 尝 试 用 液 相 色 谱 串 联 质 谱 法 同 时 检 测 有 机 肥 中 4 种 常 见 氟 喹 诺 酮 类 抗 菌 药 : 诺 氟 沙 (NOR) 环 丙 沙 星 (CIP) 氧 氟 沙 星 (OFL) 恩 诺 沙 星 (ENR) 以 期 为 有 机 肥 中 喹 诺 酮 类 的 检 测 分 析 及 风 险 评 价 提 供 参 考 依 据 1 材 料 与 方 法 1.1 试 剂 与 仪 器 样 品 的 采 集 : 样 品 为 鸡 粪 和 猪 粪, 按 照 GBT8571 规 定 制 备 实 验 室 样 品 样 品 烘 干 研 磨 后 过 1mm 或 2mm 试 验 筛 药 品 和 试 剂 : 诺 氟 沙 星 (NOR) 环 丙 沙 星 (CIP) 恩 诺 沙 星 (ENR) 氧 氟 沙 星 (OFL) 标 准 品 ;Na 2 EDTA Mclvaline 缓 冲 液 (ph4.0):0.1moll 柠 檬 酸 溶 液 0.2molL 磷 酸 二 氢 钠 溶 液 = (VV); 复 溶 液 : ( 三 乙 胺 + 磷 酸 + 水 = )( 体 积 比 ) 乙 腈 =88 12(VV); 甲 酸 甲 醇 乙 腈 均 为 色 谱 纯 主 要 仪 器 : 液 相 色 谱 串 联 质 谱 (Thermo,QuantumUltra); 固 相 萃 取 装 置 (WATERS) 亲 水 亲 脂 平 衡 萃 取 柱 (HLB)(200mg,6mL); 离 心 机 ; 超 声 仪 ; 氮 吹 仪 1.2 液 相 色 谱 串 联 质 谱 参 考 条 件 液 相 色 谱 工 作 条 件 :C18 柱 (100mm 3.0mm(i.d),2.7μm); 流 动 相 :A 相 为 0.1% 甲 酸 水 溶 液,B 相 为 甲 醇 ; 梯 度 洗 脱 : 梯 度 洗 脱 程 序 见 表 1; 流 速 :0.3mLmin; 柱 温 :40 ; 进 样 量 :5μL 表 1 梯 度 洗 脱 程 序 Table1 Gradientelutionprogram 时 间 min 流 速 ml min -1 A 相 % B 相 % 质 谱 参 考 条 件 : 离 子 源, 电 喷 雾 离 子 源 ; 扫 描 方 式, 正 离 子 扫 描 ; 检 测 方 式, 多 反 应 监 测 ; 电 离 电 压, 4.0kV; 源 温,300 ; 毛 细 管 温 度,350 ; 辅 气 流 速,20Lh; 鞘 气 流 速,30Lh; 测 试 药 物 定 性 定 量 离 子 对 及 对 应 的 锥 孔 电 压 碰 撞 能 量 见 表 2 表 2 氟 喹 诺 酮 类 抗 菌 药 的 定 性 定 量 离 子 及 锥 孔 电 压 碰 撞 能 量 Table2 Qualitativeandquantitativeions,conevoltageandcolisionenergyoffluoroquinolones 药 物 定 性 离 子 对 (mz) 定 量 离 子 对 (mz) 碰 撞 能 量 ev 诺 氟 沙 星 320.1> > > 环 丙 沙 星 332.1> > > 恩 诺 沙 星 360.2> > > 样 品 前 处 理 氧 氟 沙 星 362.1> > > 称 取 (5.0±0.02)g 试 样 于 50mL 聚 丙 烯 离 心 管 中, 加 入 5mLNa 2 EDTA Mclvaline 缓 冲 液 (ph4.0), 涡 动 混 匀, 再 加 入 20mL 乙 腈 乙 酸 =9 1(VV), 涡 动 2min, 超 声 10min 4500rmin 离 心 10min, 转 移

3 8 饶钦雄 等 液相色谱串联质谱法检测有机肥中 4种氟喹诺酮类抗菌药 ml容量瓶中 残渣再加入上述提取剂重复提取 次 合并两次提取液 用乙腈定容至刻度 上清液至 水浴中氮气吹至液面低于 ml 不能吹干 再加入 ml 摇匀 准确量取 ml提取液 置于 N e缓冲液 p H4 混匀待净化 E HLB固相萃取柱使用前用 ml甲醇和 ml纯水活化 将上述待净化液以 3mL m 的速度过柱 甲醇水溶液淋洗 弃去淋洗液 将小柱抽干 m 再用 6mL 氨化甲醇 弃去滤液 用 6mL3 μm滤膜待测 洗脱 并收集洗脱液氮气吹干 用 ml复溶液溶解 涡动混匀 过 结果与分析 色谱分析图 4种氟喹诺酮类标准品的色谱峰十分尖锐 图 4 并且均在 4m 内 在本研究建立的仪器条件下 MS MS检测方法能同时较好地检测出 4种氟喹诺酮类抗菌药 完成出峰 说明构建的 LC 图 诺氟沙星色谱图 F Ch mt g m x c 图 氧氟沙星色谱图 F Ch m t g m x c 图 3 环丙沙星色谱图 F 3 Ch m t g m c p x c 图 4 恩诺沙星色谱图 F 4 Ch mt g m e x c 提取剂的选择 e ml B 乙腈 乙酸 9 V V ml C 乙腈溶液 比较了 4种提取剂 A N E 含 草酸 ml D A B混合液 ml ml 提取有机肥中氟喹诺酮类抗菌药的加标回收率 表 3 结果显示 D方案加 mln e浸润 后加 ml乙腈 乙酸 9 V V 两次重 E 4种物质的回收率均能达到 8 左右 并且重现性较好 故本试验最终采 复提取有机肥中氟喹诺酮时 用 D作为有机肥中 4种氟喹诺酮类抗菌药的最佳提取剂 3 线性范围及检出限 μg μg μg μg μg ml及 μg ml 配制质量浓度为 的系列基质匹配标准溶液 液相色谱 串联质谱仪测定 以定量离子的峰面积为纵坐标 标准溶液质量浓 87 9X R 9999 诺氟沙星标准曲线 度为横坐标 绘制基质匹配标准曲线 氧氟沙星标准曲线 Y 7 Y 63 X R 999 9 环 丙 沙 星 标 准 曲 线 Y 337 4 9X R 99 98 恩 诺 沙 星 标 准 曲 线 Y 6 3 96X R 999 8 在空白有机肥中添加 4种氟喹诺酮标准品 多次低水平添加 以 3倍信噪比作为

4 上 海 农 业 学 报 59 检 出 限,10 倍 信 噪 比 作 为 定 量 限, 结 果 显 示 4 种 氟 喹 诺 酮 化 合 物 在 有 机 肥 中 的 检 出 限 为 0.010mgkg (SN 3), 定 量 限 为 0.050mgkg 表 3 不 同 提 取 剂 下 有 机 肥 中 4 种 氟 喹 诺 酮 类 抗 菌 药 的 回 收 率 Table3 Recoveryratesof4fluoroquinolonesinmanureunderdiferentextractants 回 收 率 % 平 均 值 相 对 标 准 提 取 剂 药 品 重 复 1 重 复 2 重 复 3 ( X±SD) 珚 偏 差 % A 氧 氟 沙 星 ± 诺 氟 沙 星 ± 环 丙 沙 星 ± 恩 诺 沙 星 ± B 氧 氟 沙 星 ± 诺 氟 沙 星 ± 环 丙 沙 星 ± 恩 诺 沙 星 ± C 氧 氟 沙 星 ± 诺 氟 沙 星 ± 环 丙 沙 星 ± 恩 诺 沙 星 ± D 氧 氟 沙 星 ± 诺 氟 沙 星 ± 环 丙 沙 星 ± 恩 诺 沙 星 ± 注 : - 表 示 未 检 出 2.4 样 品 的 加 标 回 收 率 及 准 确 度 取 鸡 粪 及 猪 粪 2 种 有 机 肥 样 品 作 为 空 白 基 质 做 添 加 回 收 试 验 我 国 尚 未 对 有 机 肥 中 氟 喹 诺 酮 类 规 定 最 高 残 留 限 量 (MRL), 但 肉 类 食 品 中 的 MRL 为 mgkg, 以 肉 类 食 品 的 MRL 为 参 考 标 准, 设 置 了 0.1mgkg 0.5mgkg 1.0mgkg 三 个 水 平 进 行 添 加 回 收 试 验 在 鸡 粪 和 猪 粪 两 种 基 质 的 有 机 肥 中 氟 喹 诺 酮 类 化 合 物 的 平 均 回 收 率 在 66.19% %, 相 对 标 准 偏 差 在 2.40% 9.45% 2.5 精 密 度 以 空 白 有 机 肥 试 样 作 为 基 质, 进 行 0.1mgkg 0.5mgkg 和 1.0mgkg 三 个 添 加 水 平, 每 个 水 平 重 复 5 个 样 品, 按 照 上 述 样 品 处 理 方 式 操 作, 按 外 标 法 计 算 回 收 率, 以 测 定 结 果 计 算 日 内 变 异 系 数,3 天 内 进 行 3 批 处 理, 以 计 算 日 间 变 异 系 数 结 果 表 明 在 此 方 法 下 有 机 肥 中 喹 诺 酮 类 抗 菌 药 的 日 内 变 异 系 数 和 日 间 变 异 系 数 均 小 于 14% 2.6 实 际 样 品 分 析 市 场 上 收 集 了 9 个 有 机 肥 样 品, 用 建 立 的 检 测 方 法 对 其 中 喹 诺 酮 类 化 合 物 含 量 进 行 检 测 ( 表 4) 结 果 显 示, 在 有 机 肥 样 品 中, 氟 喹 诺 酮 类 药 物 均 有 残 留 参 照 肉 类 中 的 氟 喹 诺 酮 类 的 最 高 残 留 量 可 知,1 号 和 2 号 样 品 中 诺 氟 沙 星,3 号 样 品 中 氧 氟 沙 星,4 号 样 品 中 除 诺 氟 沙 星 外 残 留 均 很 严 重, 超 过 MRL 规 定 值, 其 余 样 品 中 4 种 氟 喹 诺 酮 类 抗 菌 药 均 小 于 0.3mgkg, 但 仍 有 残 留, 说 明 该 方 法 能 有 效 用 于 检 测 有 机 肥 中 氟 喹 诺 酮 类 的 残 留 表 4 有 机 肥 样 品 中 4 种 氟 喹 诺 酮 类 残 留 含 量 Table4 Contentsoffourfluoroquinolonesinmanuresamples mg kg -1 样 品 氧 氟 沙 星 诺 氟 沙 星 环 丙 沙 星 恩 诺 沙 星

5 60 饶 钦 雄, 等 : 液 相 色 谱 串 联 质 谱 法 检 测 有 机 肥 中 4 种 氟 喹 诺 酮 类 抗 菌 药 3 讨 论 与 结 论 本 研 究 建 立 了 LC MSMS 测 定 有 机 肥 中 4 种 氟 喹 诺 酮 类 抗 菌 药 的 方 法 以 往 研 究 多 用 液 相 色 谱 进 行 [6] [7] 检 测, 如 张 敏 等 运 用 高 效 液 相 色 谱 荧 光 方 法 检 测 畜 禽 粪 中 4 种 氟 喹 诺 酮 类 抗 菌 药 残 留, 胡 献 刚 等 运 用 固 相 萃 取 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 畜 牧 粪 便 中 13 种 抗 生 素 药 物 残 留, 该 方 法 也 具 有 一 定 的 稳 定 性 和 重 现 性, 但 本 研 究 建 立 的 检 测 方 法 前 处 理 较 之 简 单 方 便, 且 该 法 进 样 量 少, 灵 敏 度 更 高 用 5mLNa 2 EDTA Mclvaline 和 20mL 乙 腈 乙 酸 =9 1(VV) 溶 液 提 取 有 机 肥 中 残 留 目 标 物, 得 到 较 好 的 提 取 效 果,HLB 固 相 萃 取 柱 净 化, 具 有 良 好 的 净 化 效 果 通 过 对 该 方 法 回 收 率 精 密 度 准 确 度 等 的 研 究, 表 明 该 方 法 具 有 较 高 的 准 确 度 和 精 密 度, 可 为 定 性 和 定 量 分 析 有 机 肥 中 氟 喹 诺 酮 类 抗 菌 药 提 供 一 种 准 确 高 效 的 检 测 方 法 但 该 方 法 目 前 局 限 于 4 种 氟 喹 诺 酮 类 抗 菌 药 的 检 测, 对 于 其 他 种 类 兽 药 的 检 测 尚 不 明 确, 可 进 一 步 探 讨 优 化 该 方 法 用 于 检 测 其 他 兽 药 的 残 留 参 考 文 献 [1] 李 彦 文, 莫 测 辉, 赵 娜, 等. 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 水 和 土 壤 中 的 磺 胺 类 抗 生 素 [J]. 分 析 化 学,2008,36(7): [2] 吴 小 莲, 向 垒, 莫 测 辉, 等. 超 高 效 液 相 色 谱 电 喷 雾 串 联 质 谱 测 定 蔬 菜 中 喹 诺 酮 类 抗 生 素 [J]. 分 析 化 学,2013,41(6): [3] 邰 义 萍, 莫 测 辉, 李 彦 文, 等. 长 期 施 用 粪 肥 土 壤 中 喹 诺 酮 类 抗 生 素 的 含 量 [J]. 中 国 环 境 科 学,2010,30(6): [4] 王 冉, 刘 铁 铮, 魏 瑞 成. 猪 粪 便 中 兽 药 盐 霉 素 残 留 的 降 解 动 态 研 究 [J]. 农 业 环 境 科 学 学 报,2007,26(S1): [5] 田 野, 刘 善 江. 有 机 肥 料 中 抗 生 素 在 农 田 土 壤 和 植 物 间 的 迁 移 研 究 [J]. 安 徽 农 业 科 学,2012,40(8): [6] 张 敏, 刘 庆 玉, 敖 永 华. 高 效 液 相 色 谱 荧 光 检 测 畜 禽 粪 污 中 四 种 氟 喹 诺 酮 类 抗 生 素 残 留 [J]. 湖 北 农 业 科 学,2012,51(3): [7] 胡 献 刚, 罗 义, 周 启 星, 等. 固 相 萃 取 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 畜 牧 粪 便 中 13 种 抗 生 素 药 物 残 留 [J]. 分 析 化 学,2008,36(9): ( 责 任 编 辑 : 程 智 强 )

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