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笙嬴
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1 2018 年 12 月 Vol.36 No.12 December 2018 Chinese Journal of Chromatography 1261 ~ 1268 研究论文 DOI: / SP.J 超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱法测定克氏螯虾中 39 种兽药残留宋伟 1,2, 赵暮雨 1, 韩芳 1,2, 吕亚宁 1,2, 丁磊 1, 周典兵 1, 邓晓军 3, 胡艳云 1,2, 郑平 1,2 1, 盛旋 (1. 安徽出入境检验检疫局检验检疫技术中心, 安徽合肥 ; 2. 食品安全分析与检测安徽省重点实验室, 安徽合肥 ; 3. 上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心, 上海 ) 摘要 : 建立了超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱 (UHPLC Q TOF MS) 快速筛查克氏螯虾中 39 种兽药残留的分析方法样品经酸化乙腈提取, 增强型脂质去除净化剂 ( EMR Lipid) 结合石墨化多壁碳纳米管 ( GMWNTs) 净化, 采用 UHPLC Q TOF MS 分析检测通过比对待测物准分子离子的精确质量数同位素丰度比保留时间等特征信息进行定性初筛, 通过二级谱图谱库检索比对进行确证, 通过一级提取离子色谱图峰面积进行定量分析 39 种化合物在各自的浓度范围内均呈良好的线性关系, 线性相关系数均大于 0.99, 定量限为 3 ~ 15 μg / kg, 添加回收率为 62 4% ~ 105 8%, 相对标准偏差 (RSD) 为 2 5% ~ 13 5%, 方法简便快速准确, 可应用于克氏螯虾中喹诺酮类磺胺类三苯甲烷类 39 种药物残留的快速筛查定量关键词 : 超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱 ; 增强型脂质去除净化剂 ; 石墨化多壁碳纳米管 ; 兽药残留 ; 克氏螯虾中图分类号 :O658 文献标识码 :A 文章编号 : (2018) Determination of 39 veterinary drug residues in Procambarusclarkii by ultra high performance liquid chromatography quadrupole time of flight mass spectrometry SONG Wei 1,2, ZHAO Muyu 1, HAN Fang 1,2, LÜ Yaning 1,2, DING Lei 1, ZHOU Dianbing 1, DENG Xiaojun 3, HU Yanyun 1,2, ZHENG Ping 1,2, SHENG Xuan 1 (1. Technical Center for Inspection and Quarantine of Anhui Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau, Hefei China; 2. Anhui Province Key Laboratory of Analysis and Detection for Food Safety, Hefei , China; 3. Technical Center for Animal Plant and Food Inspection and Quarantine, Shanghai Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shanghai , China) Abstract: An ultra high performance liquid chromatography quadrupole time of flight mass spectrometry ( UHPLC Q TOF MS) method was developed for determination of 39 veterinary drugs in Procambarusclarkii. Samples were extracted with acidified acetonitrile and purified with enhanced matrix removal lipid ( EMR Lipid) adsorbent and graphitized multi walled car bon nanotubes ( GMWNTs). Extracts were analyzed by UHPLC Q TOF MS. Target compounds were screened according to accurate mass, isotopic ratio, and retention time, and confirmed by library search. Target analytes were quantified using the chromatographic peak area of each compound. For each of the drugs of interest, calibration curves were linear in their respective ranges with correlation coefficients greater than The limits of quantification (LOQs) were 收稿日期 : 通讯联系人.E mail:huyanyun@ ahciq.gov.cn. 基金项目 : 安徽省公益性研究联动项目 (1704f ); 上海市长三角科技合作项目 ( ). Foundation item: Linkage Research Project for Public Welfare in Anhui ( No. 1704f ); Science and Technology Cooper ation Project of Yangtze River Delta in Shanghai ( No ).

2 1262 色谱第 36 卷 3-15 μg / kg. The recoveries for target compounds spiked in Procambarusclarkii ranged from 62 4% to 105 8%, with relative standard deviations (RSDs) ranging from 2 5% to 13 5%. This method is simple, rapid, accurate, and suitable for simultaneous determination of 39 veterinary drugs, including sulfonamides, quinolones, and triphenylmethane, extracted from Procambar usclarkii. Key words: ultra high performance liquid chromatography quadrupole time of flight mass spec trometry ( UHPLC Q TOF MS); enhanced matrix removal lipid adsorbent; graphitized multi walled carbon nanotubes ( GMWNTs); veterinary drug residues; Procambarusclarkii 克氏原螯虾又称红螯虾淡水小龙虾, 是市场上深受欢迎的水产食品, 同时也是我国重要的出口产品, 而药物残留是当前影响克氏原螯虾养殖质量安全的关键危害因子 [1,2], 根据我国农业部 235 号公告规定, 磺胺类药物在克氏原螯虾肌肉组织中的总量不得超过 100 μg / kg, 恩诺沙星与环丙沙星之和不得超过 100 μg / kg, 达氟沙星不得超过 100 μg / kg, 二氟沙星不得超过 300 μg / kg, 并禁止使用孔雀石绿目前针对动物源性产品中药物残留的检测方法主要有酶联免疫法 [3,4] 液相色谱法 [5-7] 液 [8-11] 相色谱串联质谱法等, 但这些方法所能检测的目标物数量及确证能力有限其中酶联免疫法检测结果易受试剂质量的影响, 对结构类似物有一定程度的交叉反应, 容易出现假阳性 ; 液相色谱法灵敏度较低, 选择性和特异性较差 ; 液相色谱串联质谱法虽然方法灵敏度和特异性都比较高, 但由于难以完全阐明化合物的结构裂解信息, 定性准确度方面尚有欠缺 ; 另外受通道驻留时间限制, 能同时检测的化合物数量有限而超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱 (UHPLC Q TOF / MS) 作为一种结合了超高效液相色谱高分离能力和四极杆飞行时间质谱高分辨功能的联用技术, 不仅可以提供母离子的精确相对分子质量, 还可以提供大量二级碎片离子及其精确分子质量信息, 预测元素组成并辅助结构鉴定, 大大提高了复杂背景下的抗干扰能力, 使检测结果更加准确, 具有选择性高受基质干扰小方法建立过程简单等优点 [12-15], 理论上可以分析的化合物没有数量限制, 能为水产品中大量药物及污染物筛查分析提供更具优势的筛查技术手段样品前处理技术是兽药残留分析的关键步骤, 直接影响检测结果 QuEChERS 作为一种简单快速高效的药物多残留的前处理方法, 近些年已被引入兽药残留分析 [16-18], 其常规净化吸附剂主要包括 C 18 N 丙基乙二胺粉末 ( PSA) 石墨化炭黑等随着技术的快速发展, 目前一些新型材料也被应用于 QuEChERS 方法, 以有效去除样品中的脂肪蛋白质色素等杂质如 EMR Lipid 作为 QuEChERS 增强型脂质去除产品, 已有研究表明其能高效并选择性地去除高脂肪食品中的脂质 [18-20] 另外, 随着纳米技术的快速发展, 石墨烯 [21] [22,23] 多壁碳纳米管等一些新型纳米吸附剂填料也在 QuEChERS 技术中得到了应用研究将新型高效净化吸附剂结合 QuEChERS 法应用于水产品中兽药的残留分析, 将有效提高样品前处理速度及净化效果本文采用增强型脂质去除净化剂 (EMR Lipid, 简称 EMR) 结合石墨化多壁碳纳米管作为 QuECh ERS 法吸附剂对克氏螯虾样品进行前处理, 同时采用超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱技术建立喹诺酮类磺胺类三苯甲烷类 39 种药物残留一级精确质量数据库及二级碎片谱图库通过比对准分子离子的精确质量数同位素丰度比保留时间等信息对目标物进行初筛, 之后通过二级谱图谱库检索比对进行确证, 最终以一级提取离子色谱图峰面积进行定量, 建立适合于克氏螯虾中 39 种兽药残留检测的快速筛查方法 1 实验部分 1.1 仪器与试剂 Agilent 超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱仪 ( Agilent, 美国 ); Avanti J E 高速冷冻离心机 ( Beckman Coulter, 美国 ); N EVAP112 氮吹浓缩仪 ( OA SYS, 美国 ); PL602 L 电子天平 (Mettler, 德国 ); T25 均质器 (IKA, 德国 ); Vortex Genie 2 涡旋混匀器 ( Scientific Industries, 美国 ); Milli Q 超纯水机 (Merck Millipore, 美国 ) 标准品 : 磺胺醋酰 (sulphacetamide) 磺胺嘧啶 (sulfadiazine) 磺胺噻唑 (sulfathiazole) 磺胺吡啶 (sulfapyridine) 磺胺甲基嘧啶 (sulfamerazine) 三

3 第 12 期宋伟, 等 : 超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱法测定克氏螯虾中 39 种兽药残留 1263 甲氧苄氨嘧啶 ( trimethoprim) 磺胺二甲嘧啶( sul fadimidine) 磺胺甲氧哒嗪 ( sulfamethoxypyrida zine) 磺胺甲噻二唑(sulfamethizole) 磺胺对甲氧嘧啶 ( sulfameter) 磺胺间甲氧嘧啶 ( sulfamono methoxine) 磺胺氯哒嗪( sulfachloropyridazine) 磺胺甲基异恶唑 ( sulfamethoxazole) 磺胺二甲异恶唑 ( sulfisoxazole) 磺胺苯酰( sulfabenzide) 磺胺间二甲氧嘧啶 ( sulfadimethoxine) 磺胺喹恶啉 (sulfachinoxalin) 磺胺苯吡唑 ( sulfaphenazole) 磺胺硝苯 ( sulfanitran) 麻保沙星 ( marbofloxa cin) 依诺沙星 ( enoxacin) 氟罗沙星 ( fleroxa cin) 诺氟沙星 ( norfloxacin) 氧氟沙星 ( ofloxa cin) 培氟沙星(pefloxacin) 环丙沙星(ciprofloxa cin) 丹诺沙星 ( danofloxacin) 恩诺沙星 ( enro floxacin) 奥比沙星 ( orbifloxacin ) 沙拉沙星 (sarafloxacin) 双氟沙星 ( difloxacin) 司帕沙星 (sparfloxacin) 氟甲喹( flumequine) 恶喹酸( ox olinic acid) 萘啶酸 ( nalidixic acid) 孔雀石绿 (malachite green ) 隐色孔雀石绿 ( leucomala chitegreen) 结晶紫 ( crystal violet) 隐色结晶紫 (leucocrystalviolet) ( 纯度 99%, 德国 Dr. Ehren storfer 公司 ); 甲酸乙酸乙腈 ( 色谱纯, 美国 Tedia 公司 ); 氯化钠无水硫酸镁乙酸铵 ( 分析纯, 国药集团化学试剂有限公司 ); PSA C 18 吸附剂 ( 美国 Waters 公司 );EMR Lipid( 美国 Agilent 公司 ); 石墨化多壁碳纳米管 ( 直径 >50 nm, 长度 :10 ~ 20 μm, 纯度 >99 9%, 南京先丰纳米材料科技有限公司 ) 兽药标准溶液 : 准确称取上述 39 种兽药标准品各 10 mg( 精确至 0 1 mg), 分别置于 10 ml 棕色容量瓶中, 用乙腈溶解并定容, 标准储备液浓度均为 1 mg / ml, 于 -18 避光保存实验中根据每种目标化合物的定量限, 用空白样品提取液逐级稀释配制成不同浓度的系列基质混合标准工作液, 现用现配 1.2 样品前处理将克氏螯虾样品去头去壳, 取可食部分用匀浆机制样, 于 -18 冷冻贮存备用称取 4 g( 精确至 0 01 g) 样品于 50 ml 离心管中, 加入 10 ml 1% (v / v) 甲酸乙腈溶液, r / min 均质提取 1 min, 于 r / min 冷冻离心 20 min 取 5 ml 上清液至预先用 5 ml 水浸润活化过的 EMR Lipid 管中, 涡旋振荡 2 min, 之后于 4 条件下 r / min 离心 5 min 取上清液 5 ml 移入加有 0 5 g 氯化钠 2 0 g 无水硫酸镁的反萃管中, 涡旋振荡 1 min 后, 于 4 条件下 r / min 离心 5 min, 再将上层乙腈层转移至加有 30 mg 石墨化多壁碳纳米管的净化管中, 涡旋振荡 2 min, 于 4 条件下 r / min 离心 5 min 最后取上层清液至 10 ml 玻璃管中, 在 45 用氮气浓缩仪吹干, 准确加入 500 μl 初始流动相溶解残渣, 过 0 2 μm 滤膜, 待上机检测 1.3 UHPLC Q TOF / MS 条件色谱条件色谱柱 : 安捷伦 ZORBAX Eclipse Plus C 18 柱 (100 mm 2 1 mm, 1 8 μm); 流动相 :A 相为 5 mmol / L 乙酸铵 0 1% (v / v) 甲酸水溶液,B 相为乙腈梯度洗脱程序 :0 ~ 1 min, 5% B; 1 ~ 6min, 5% B ~ 15% B; 6 ~ 20 min, 15% B ~ 30% B; 20 ~ 22 min, 30% B ~ 90% B; 然后保持 3 min; 之后由 90% B 降到 5% B, 保持 5 min 流速 :0 3 ml / min; 柱温 :40 ; 进样量 10 μl 质谱条件离子源 : 电喷雾电离 ( ESI) 源, 正离子模式 ; 干燥气温度 :325 ; 干燥气流速 :10 L / min; 雾化器压力 :276 kpa; 鞘流气温度 :300 ; 鞘流气流速 :11 L / min; 毛细管电压 (capillary voltage): V; 扫描方式 : 正离子扫描,target MS / MS 模式 ;TOF 一级质谱和二级质谱扫描质量范围 ( m / z): 50 ~ 1 000; 碎裂电压 (FP): 100 V UHPLC Q TOF / MS 配置了双喷雾器电喷雾源, 可以连续导入参比溶液对仪器质量轴进行实时校正选取 m / z 和 m / z 作为参比离子, 对测定的目标物实时进行质量数校正, 确保质量数误差小于 (5 ppm) 2 结果与讨论 2.1 质谱条件的优化质谱条件中的碎裂电压和碰撞能量是影响离子丰度的重要条件, 与方法的灵敏度密切相关首先通过化合物结构式建立 39 种兽药的一级精确质量数据库, 之后在 ESI + 模式下对单个分析物的标准品溶液进行全扫描, 确定各化合物的母离子并优化碎裂电压 (FP) FP 过低时不利于离子聚焦和传输, FP 过高时会造成离子的源内裂解, 两种情况都会对母离子响应造成影响由于在 TOF / MS 扫描时质

4 1264 色谱第 36 卷谱 FP 参数只能设置一个通用值, 为兼顾各种化合物的响应以获得较高灵敏度,FP 电压设为 100 V 以不同药物一级质谱获得精确质量数的分子离子峰进行二级质谱扫描, 得到不同碰撞能量下各化合物的二级质谱图, 然后通过仪器自带谱库编辑软件, 建立 39 种兽药信息及二级谱图库根据各化合物不同碰撞能下的二级谱图对比, 选出合适的碰撞能量作为该药物筛查方法的二级碰撞能 ( 见表 1) 表 1 39 种兽药化合物的分子式保留时间及碰撞能 Table 1 Formula, retention times ( RT) and collision energies (CE) of the 39 veterinary drugs Compound Formula RT / min CE / V Sulphacetamide C 8 H 10 N 2 O 3 S Sulfadiazine C 10 H 10 N 4 O 2 S Sulfathiazole C 9 H 9 N 3 O 2 S Sulfapyridine C 11 H 11 N 3 O 2 S Sulfamerazine C 11 H 12 N 4 O 2 S Trimethoprim C 14 H 18 N 4 O Sulfadimidine C 12 H 14 N 4 O 2 S Sulfamethoxypyridazine C 11 H 12 N 4 O 3 S Sulfamethizole C 9 H 10 N 4 O 2 S Sulfameter C 11 H 12 N 4 O 3 S Sulfamonomethoxine C 11 H 12 N 4 O 3 S Sulfachloropyridazine C 10 H 9 ClN 4 O 2 S Sulfamethoxazole C 10 H 11 N 3 O 3 S Sulfisoxazole C 11 H 13 N 3 O 3 S Sulfabenzide C 13 H 12 N 2 O 3 S Sulfadimethoxine C 12 H 14 N 4 O 4 S Sulfachinoxalin C 14 H 12 N 4 O 2 S Sulfaphenazole C 15 H 14 N 4 O 2 S Sulfanitran C 14 H 13 N 3 O 5 S Marbofloxacin C 17 H 19 FN 4 O Enoxacin C 15 H 17 FN 4 O Fleroxacin C 17 H 18 F 3 N 3 O Norfloxacin C 16 H 18 FN 3 O Ofloxacin C 18 H 20 FN 3 O Pefloxacin C 17 H 20 FN 3 O Ciprofloxacin C 17 H 18 FN 3 O Danofloxacin C 19 H 20 FN 3 O Enrofloxacin C 19 H 22 FN 3 O Orbifloxacin C 19 H 20 F 3 N 3 O Sarafloxacin C 20 H 17 F 2 N 3 O Difloxacin C 21 H 19 F 2 N 3 O Sparfloxacin C 19 H 22 F 2 N 4 O Flumequine C 14 H 12 FNO Oxolinic acid C 13 H 11 NO Nalidixic acid C 12 H 12 N 2 O Malachite green C 23 H 24 N Crystal violet C 25 H 29 N Leucomalachite green C 23 H 26 N Leucocrystal violet C 25 H 31 N 色谱条件优化流动相是影响化合物离子化的重要条件, 影响色谱峰形和分离效果实验比较了乙腈水乙腈 0 1% ( v / v) 甲酸水乙腈 5 mmol / L 乙酸铵 0 1% (v / v) 甲酸水溶液 3 种流动相条件下色谱峰的分离及响应情况, 发现在 ESI + 模式下, 流动相中加入一定比例的甲酸有利于提高目标物的离子化效率, 增大化合物的响应值但孔雀石绿隐性孔雀石绿结晶紫隐性结晶紫 4 种物质的色谱峰峰形及响应较差而在流动相中再加入少量乙酸铵时, 以上 4 种物质的出峰情况得到明显改善为了尽量减少干扰提高化合物响应并实现同分异构体的分离, 实验最终采用乙腈 5 mmol / L 乙酸铵 0 1% ( v / v) 甲酸水溶液作为流动相, 以节的梯度洗脱条件实现了 39 种化合物的分离检测, 特别是对同分异构体磺胺甲氧哒嗪磺胺对甲氧嘧啶磺胺间甲氧嘧啶实现了有效分离测定 ( 见图 1), 39 种化合物的保留时间见表确定筛查检索标准为保证筛查结果的准确性, 实验基于化合物的保留时间一级母离子精确质量数同位素丰度比及二级质谱特征碎片谱图作为指标建立检索标准采用 target MS / MS 扫描模式, 一针进样同时获取一级二级质谱数据经优化, 当一级筛查以 ± (20 ppm) 精确质量偏差提取化合物的分子离子峰, 保留时间限定范围在 ± 0 5 min, 离子化形式选择 +H +NH 4 +Na 模式时, 检索结果得分值 70 的化合物可初步确定为疑似阳性之后对二级谱图进行检索确证, 检索得分 60 的化合物被确证为目标药物检索得分 <60 的化合物可通过背景扣除来降低杂质离子对检索的影响 ; 如果仍不能达到得分要求, 则需对比其主要碎片离子, 若有两个及两个以上的主要碎片离子匹配, 则可确证为目标药物对加标样本进行测定, 化合物锁定的保留时间误差范围均小于 0 2 min, 经参比溶液实时校准, 所有化合物的质量数误差绝对值均小于 5 0 ppm, 满足欧盟的定性要求, 方法实现了 39 种药物的无标准品高选择性的快速筛查和确认以三甲氧苄胺嘧啶为例进行说明, 如图 2 所示, 化合物经保留时间一级母离子精确质量数同位素丰度比比对, 与三甲氧苄胺嘧啶的匹配得分为 97 5, 之后进入二级质谱图检索比对, 与谱图库中三甲氧苄胺嘧啶二级质谱图的相似度得分为 95 4, 确证为三甲氧苄胺嘧啶

5 第 12 期宋伟, 等 : 超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱法测定克氏螯虾中 39 种兽药残留 1265 图 1 39 种兽药混合标准液的总离子流色谱图 Fig. 1 Total ion current ( TIC) chromatogram of the 39 veterinary drug standards Peak identifications: 1. sulphacetamide; 2. sulfadiazine; 3. sulfathiazole; 4. sulfapyridine; 5. sulfamerazine; 6. trimethoprim; 7. mar bofloxacin; 8. enoxacin; 9. sulfadimidine; 10. fleroxacin; 11. norfloxacin; 12. ofloxacin; 13. pefloxacin; 14. sulfameter; 15. ciprofloxa cin; 16. sulfamethizole; 17. sulfamethoxypyridazine; 18. danofloxacin; 19. enrofloxacin; 20. orbifloxacin; 21. sulfamonomethoxine; 22. sulfachloropyridazine; 23. sarafloxacin; 24. difloxacin; 25. sparfloxacin; 26. sulfamethoxazole; 27. sulfisoxazole; 28. oxolinic Acid; 29. sulfabenzide; 30. sulfadimethoxine; 31. sulfachinoxalin; 32. sulforal; 33. nalidixicacid; 34. flumequine; 35. sulfanitran; 36. malachile green; 37. crystalviolet; 38. leucomalachilegreen; 39. leucocrystalviolet. 图 2 三甲氧苄胺嘧啶的提取离子色谱图 (EIC) 一级质谱图及二级碎片离子检索对比图 Fig. 2 Extracted ion chromatogram ( EIC), first order mass spectrum and fragment ion contrast diagram of trimethoprim 2.4 提取方法的优化实验比较了乙腈 1% ( v / v) 甲酸乙腈乙酸乙酯甲醇作为提取溶剂时的提取效果其中以乙酸乙酯甲醇提取时, 提取液浑浊, 提取效率低 ; 以乙腈作为提取试剂时, 虽能够更有效地沉淀蛋白质, 减少杂质干扰, 但部分化合物提取回收率较低 ; 而采用 1% (v / v) 甲酸乙腈提取时,39 种兽药均取得了较好的提取效果, 回收率均高于 60% 因此实验最终采用 1% (v / v) 甲酸乙腈作为提取溶剂为减少样品中脂类物质的干扰, 实验在样品提取后采用冷冻离心法, 将乙腈提取液于 r / min 冷冻离心 20 min, 吸取 5 ml 上清液进行下一步实验

对含有直链烃结构的脂类等大分子物质去除率较高, 当采用 EMR 处理时, 仅有 3 种药物的回收率低于 70%, 质谱图中的杂质峰相对其他两种吸附剂明显减少按照基质效应 (ME)= (1- 基质匹配标准曲线的斜率 / 溶剂标准曲线的斜率 ) 100% 计算目标兽药的基质效应,3 种方式净化后的基质效应分布见图 4 结果表明, 采用 EMR 吸附净化手段, 基质效应明显降低, 最终选取 EMR

实验最终选取净化分散剂 EMR 的量为 1 0 g NaCl 可使样品中的水分充分析出, 从而有利于吸水剂的吸附无水 MgSO 4 吸水容量大, 能明显减少水相, 从而促进兽药在有机相中的分配和两相的分层, 在提取步骤中,MgSO 4 水合作用是一个强放热过程, 可使提取液变热, 有利于提高提取效率 [24] 实验选取 NaCl 和无水 MgSO 4 分别作为盐析剂和脱水剂

6 1266 色谱第 36 卷 2.5 净化条件的优化本文分别考察了 C 18 PSA EMR 3 种吸附净化剂的效果 C 18 可吸附样品中的脂肪和蛋白质,PSA 可吸附样品中的脂肪酸和糖类杂质, 但实验发现在 20 μg / kg 添加水平下,C 18 PSA 的净化效果不理想, 对部分药物均有不同程度的吸附, 分别有 7 种和 14 种目标物的回收率低于 70% ( 见图 3) EMR 具有疏水选择性和吸附作用, 对含有直链烃结构的脂类等大分子物质去除率较高, 当采用 EMR 处理时, 仅有 3 种药物的回收率低于 70%, 质谱图中的杂质峰相对其他两种吸附剂明显减少按照基质效应 (ME)= (1- 基质匹配标准曲线的斜率 / 溶剂标准曲线的斜率 ) 100% 计算目标兽药的基质效应,3 种方式净化后的基质效应分布见图 4 结果表明, 采用 EMR 吸附净化手段, 基质效应明显降低, 最终选取 EMR 作为净化分散剂实验通过比较不同用量 ( g) 分散剂的吸附净化效果, 发现随着 EMR 的使用量从 0 4 g 增加到 1 0 g, 39 种兽药的平均回收率由 72 6% 上升到 82 3%, 平均基质效应 ( 基质效应取绝对值后平均 ) 由 35 9% 降低到 25 7%, 但增加到 1 2 g 时平均回收率为 80 6%, 略有降低实验最终选取净化分散剂 EMR 的量为 1 0 g NaCl 可使样品中的水分充分析出, 从而有利于吸水剂的吸附无水 MgSO 4 吸水容量大, 能明显减少水相, 从而促进兽药在有机相中的分配和两相的分层, 在提取步骤中,MgSO 4 水合作用是一个强放热过程, 可使提取液变热, 有利于提高提取效率 [24] 实验选取 NaCl 和无水 MgSO 4 分别作为盐析剂和脱水剂另外为减少色素等其他基质的干扰, 实验分别对加入 mg 石墨化多壁碳纳米管的净化效果进行了考察, 发现当石墨化多壁碳纳米管用量从 5 mg 增至 30 mg 时, 净化后的溶液能够更澄清干净, 杂质干扰峰减少但当石墨化多壁碳纳米管用量增至 40 mg 时, 大部分兽药的提取回收率开始出现下降, 说明吸附剂过多会导致目标物的吸附损失 ( 见图 5) 实验最终选择加入 30 mg 石墨化多壁碳纳米管为净化吸附剂 Fig. 3 图 3 不同净化方式下兽药回收率分布图 Distribution of recoveries of veterinary drugs using different purification methods 图 5 不同用量石墨化多壁碳纳米管下 39 种兽药的平均回收率 Fig. 5 Average recoveries of the 39 veterinary drugs with different quantity of GMWNTs Fig. 4 图 4 不同净化方式下兽药基质效应分布图 Distribution of matrix effects of veterinary drugs with different purification methods 2.6 方法的线性关系定量限回收率和精密度根据目标化合物在质谱中的响应, 以空白样品提取液配制不同浓度的混合标准系列, 在选定的色谱和质谱条件下进行测定, 以标准品的质量浓度为横坐标, 以相应组分的响应值为纵坐标, 结果显示 39 种兽药的标准曲线线性关系良好, 线性相关系数 (r 2 ) 均在 0 99 以上以不同添加水平下空白基质的仪器响应为基准, 分别以 3 倍信噪比和 10 倍信噪比考察了方法的检出限 ( LOD) 和定量限 ( LOQ), 39 种兽药的 LOQ 为 3 ~ 15 μg / kg( 见表 2)

7 第 12 期宋伟, 等 : 超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱法测定克氏螯虾中 39 种兽药残留 1267 Table 2 表 2 39 种兽药的线性回归方程 r 2 线性范围检出限及定量限 Linear regression equations, correlation coefficients (r 2 ), linear ranges, LODs and LOQs of the 39 veterinary drugs No. Compound Linear equation r 2 Linear range / (μg / kg) LOQ / (μg / kg) LOD / (μg / kg) 1 sulphacetamide Y = 171.1X sulfadiazine Y = X sulfathiazole Y = X sulfapyridine Y = X sulfamerazine Y = X trimethoprim Y = X sulfadimidine Y = X sulfamethoxypyridazine Y = X sulfamethizole Y = X sulfameter Y = X sulfamonomethoxine Y = X sulfachloropyridazine Y = 108.6X sulfamethoxazole Y = 617.0X sulfisoxazole Y = 670.8X sulfabenzide Y = X sulfadimethoxine Y = X sulfachinoxalin Y = X sulfaphenazole Y = 107.1X sulfanitran Y = X marbofloxacin Y = 701.6X enoxacin Y = X fleroxacin Y = X norfloxacin Y = X ofloxacin Y = X pefloxacin Y = X ciprofloxacin Y = 786.1X danofloxacin Y = X enrofloxacin Y = X orbifloxacin Y = X sarafloxacin Y = 778.8X difloxacin Y = 878.1X sparfloxacin Y = X flumequine Y = X oxolinic Acid Y = X nalidixic Acid Y = X malachite Green Y = 111.8X crystal Violet Y = X leucomalachitegreen Y = X leucocrystalviolet Y = X Y: peak area; X: mass concentration, μg / L. 为了评估方法的准确性, 在 LOQ 2LOQ 及 4LOQ 3 个添加水平下进行加标回收率试验, 每个水平做 6 个平行样品,39 种兽药的回收率及 RSD 见表 3, 结果表明方法能够满足实际检测的要求表 3 39 种兽药的回收率及相对标准偏差 (n = 6) Table 3 Recoveries and relative standard deviations of the 39 veterinary drugs (n = 6) Added Recovery / % RSD / % LOQ LOQ LOQ 实际样本检测在最佳实验条件下对 20 个克氏螯虾样品中的兽药残留进行筛查, 其中 1 份克氏螯虾样品检出禁用药物孔雀石绿, 一级筛查得分 90 3, 二级确证得分 75 4, 含量为 4 63 μg / kg; 1 份克氏螯虾检出恩诺沙星, 一级筛查得分 96 5, 二级确证得分 92 1, 含量为 μg / kg, 未超出我国限量标准 ( 见图 6); 剩余样品均未检出这 39 种兽药残留为了验证检测结果, 实验室参照国家标准 [25,26], 采用超高效液相色谱三重四极杆质谱法对上述检出的阳性样品

8 1268 色谱第 36 卷图 6 阳性样品的 EIC 图 Fig. 6 EIC of positive samples 进行了对比测试, 分别测得孔雀石绿含量平均值为 5.01 μg / kg, 恩诺沙星含量平均值为 μg / kg, 经 t 检验法分析,p 值均大于 0 05, 两种方法所测结果无显著性差异 3 结论本工作建立了克氏螯虾中喹诺酮类磺胺类三苯甲烷类共 39 种兽药的快速筛查方法样品经酸化乙腈提取,EMR Lipid 结合石墨化多壁碳纳米管净化,UHPLC Q TOF MS 一针进样, 同时进行一级初筛及二级确证, 方法简便快速准确, 可有效避免假阳性结果的出现, 为克氏螯虾中 39 种兽药残留的快速筛查和确证提供了技术支持, 同时也可以为其他水产品中多兽药残留的筛查提供方法参考参考文献 : [1] Song C T. Freshwater Fisheries, 2001, 31(1): 28 宋长太. 淡水渔业, 2001, 31(1): 28 [2] Mao Y Z, Meng Y H, Zhou L, et al. Occupation and Health, 2012, 28(9): 1092 毛云中, 孟元华, 周磊, 等. 职业与健康, 2012, 28(9): 1092 [3] Xing W W, Wang R M, Wang J Q, et al. Chemical Research and Application, 2010, 22(1): 42 邢玮玮, 王榕妹, 王俊卿, 等. 化学研究与应用, 2010, 22 (1): 42 [4] Li X P, Jiang J Q, Qian A D, et al. Scientia Agricultura Sini ca, 2014, 47(23): 4726 李新朋, 姜金庆, 钱爱东, 等. 中国农业科学, 2014, 47(23): 4726 [5] Chen Z G, Zhan C R, Guo P, et al. Food Science, 2007, 28 (10): 448 陈振桂, 占春瑞, 郭平, 等. 食品科学, 2007, 28(10): 448 [6] Wang C Y, Wang Y P, Wang N, et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2013, 41(1): 83 王重洋, 王远鹏, 王宁, 等. 分析化学, 2013, 41(1): 83 [7] Huang D M, Huang X Y, Gu R R, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2014, 32(8): 874 黄冬梅, 黄宣运, 顾润润, 等. 色谱, 2014, 32(8): 874 [8] Li H, Kijak P J, Turnipseed S B, et al. J Chromatogr B, 2006, 836 (1 / 2): 22 [9] Li N, Zhang Y T, Liu L, et al. Chinese Journal of Chroma tography, 2014, 32(12): 1313 李娜, 张玉婷, 刘磊, 等. 色谱, 2014, 32(12): 1313 [10] Kung T A, Tsai C W, Ku B C, et al. Food Chem, 2015, 175: 189 [11] Zhang Z W, Li X W, Ding S Y, et al. Food Chem, 2016, 204: 252 [12] Chen Y S, Schwack W. J Chromatogr A, 2013, 1312: 143 [13] Li X J, Peng T, Li C J. Journal of Instrumental Analysis, 2012, 31(5): 628 李晓娟, 彭涛, 李重九. 分析测试学报, 2012, 31(5): 628 [14] Meng Z, Shi Z H, Lü Y K, et al. Chinese Journal of Analyti cal Chemistry, 2014, 42(10): 1493 孟哲, 石志红, 吕运开, 等. 分析化学, 2014, 42(10): 1493 [15] Huang L, Dai Y F, Wang P Y, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2015, 33(10): 1097 黄鹂, 戴意飞, 王萍亚, 等. 色谱, 2015, 33(10): 1097 [16] Kaufmann A, Butcher P, Maden K, et al. J Chromatogr A, 2008, 1194(1): 66 [17] Li N, Zhang Y T, Liu L, et al. Chinese Journal of Chroma tography, 2014, 32(12): 1313 李娜, 张玉婷, 刘磊, 等. 色谱, 2014, 32(12): 1313 [18] Zhang K M, Liang F Y, Deng M, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2016, 34(9): 860 张科明, 梁飞燕, 邓鸣, 等. 色谱, 2016, 34(9): 860 [19] Wang F, Mi J B, Li S J, et al. Journal of Instrumental Anal ysis, 2017, 36(2): 272 王飞, 宓捷波, 李淑静, 等. 分析测试学报, 2017, 36( 2): 272 [20] Zhang F Y, Jiang W F, Wang X Q. China Dairy Industry, 2018(4): 57 张凤艳, 蒋万枫, 王锡青. 中国乳品工业, 2018(4): 57 [21] Lu Y, Cheng Z, Liu C, et al. Food Anal Methods, 2016, 9 (6): 1857 [22] Li J, Zhang J, Liu H, et al. J Sci Food Agr, 2016, 96(2): 555 [23] Peng X J, Zeng L Z, Wu C C, et al. Journal of Instrumental Analysis, 2017, 36(6): 738 彭晓俊, 曾丽珠, 伍长春, 等. 分析测试学报, 2017, 36(6): 738 [24] Chen G D, Wang Y. China Food Safety Magazine, 2015, 33 (99): 159 陈国栋, 王颖. 食品安全导刊, 2015, 33(99): 159 [25] GB / T [26] GB / T

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.