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依玄厚
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1 第 40 卷分析化学 (FENXI HUAXUE) 研究报告第 10 期 2012 年 10 月 Chinese Journal of Analytical Chemistry ~ DOI: /SP.J 基质固相分散 - 超快速液相色谱测定牛肉中磺胺类兽药王重洋王远鹏姜春竹于希宋大千孙颖 * ( 吉林大学化学学院, 长春 ) 摘要采用基质固相分散 - 超快速液相色谱测定了牛肉组织中磺胺噻唑磺胺甲基嘧啶磺胺甲基异恶唑和磺胺间二甲氧嘧啶基质固相分散萃取的最佳条件为 : 硅藻土为分散剂,6 ml 甲醇为洗脱剂, 样品与分散剂的质量比为 1 4 方法的检出限为 4.39~ 7.82 ng/g, 定量限为 14.62~ ng/g,4 种磺胺化合物回收率为 71.73% ~113.13%, 测定的相对标准偏差为 1.9% ~12.7% 关键词基质固相分散 ; 超快速液相色谱 ; 磺胺类药物 ; 牛肉 1 引言磺胺类药物主要通过外用或作为饲料添加剂而引入动物体中近年来, 动物源食品中磺胺类药物残留量超标现象十分严重, 尤其是在猪禽牛等动物源食品中欧盟规定肉类食品中的磺胺类药物的最高残留限量 (MRL) 为 : 单一磺胺类药物 25 mg/kg, 磺胺类药物总量 100 mg/kg 国际食品法典委员会与我国农业部 2002 年 12 月发布的 235 号公告动物性食品中兽药最高残留限量中规定动物组织中磺胺类药物的 MRL 为 100 mg/kg 目前, 已有不少关于食品中兽药残留提取方法的报道, 主要包括固相萃取法 [1] 固相微萃取法 [2] 超 [3] [4] [5] 临界流体萃取法加速溶剂萃取法微波辅助萃取法等这些方法在食品分析中得到了广泛应用, 在特定的样品处理过程中各具优势但是, 以上提取方法存在需要样品净化步骤, 需消耗大量的样品吸附剂和有机溶剂, 费用较高或耗时等不足基质固相分散 (Matrix solid phase dispersion,mspd) 是由 Barker 最先提出的样品前处理技术 [6], 将样品均化预处理过滤净化提取过程一并完成, 避免了样品均化沉淀离心浓缩等造成的检测对象的损失, 节约时间, 并减少了溶剂的用量, 因此被广泛应用于固体半固体和高粘性的生物样品的制备, 可处理动物组织及植物样品 [7,8] 由于 MSPD 具备无需萃取溶剂提取条件温和 ( 室温和大气压 ) 适用范围更广等优点, 而使得现场处理样品成为可能常用的 MSPD 分散剂有硅胶硅藻土氧化铝 C 18 和 C 8 等硅胶硅藻土氧化铝属于极性固体分散剂, 常用于提取极性物质 ;C 18 和 C 8 属于弱极性分散剂, 常用于提取中等极性和非极性的化合物根据磺胺类兽药的极性, 本实验考察了极性分散剂的影响磺胺类兽药的残留检测方法主要有高效液相色谱 (HPLC) [9,10] 气相色谱法 (GC) [11] 液相色谱 - 质谱联用法 (HPLC-MS) [12] 气相色谱 - 质谱联用法 (GC-MS) [13] 毛细管电泳法 (CE) [14] 等 GC 法需要进行样品衍生操作, 不利于实际样品的快速分析 HPLC-MS/MS 和 GC-MS 方法具有准确性好灵敏度高等优点, 但仪器价格昂贵, 普及范围受到限制 CE 法重现性差, 限制了其广泛应用目前, 由于液相色谱仪的普及, 液相色谱法已经广泛应用于磺胺类兽药残留的检测本实验采用超快速液相色谱 (UFLC) 对牛肉中磺胺类兽药残留进行同时测定 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 UFLC 系统 ( 日本岛津公司 ), 配备两个 LC-20AD 泵 SIḺ 20A 自动进样器 CTO-20A 柱温箱和 SPD- 20A 紫外检测器 ;Sulfa C 18 色谱柱 (150 mm 4.6 mm,3 mm, 日本岛津公司 ) MSPD 装置由 10 ml 玻璃注收稿 ; 接受本文系吉林省科技厅科技发展计划重点项目 (No ) 和吉林省科技厅科技人员服务企业行动项目 (No. 2009GJB10049) 资助 * songdq@ jlu.edu.cn

2 分析化学第 40 卷射器自制而成磺胺噻唑 (Sulfathiazole,ST) 磺胺甲基嘧啶 (Sulfamerazine,SM1) 磺胺甲基异恶唑 (Sulfamethoxazole,SMZ) 磺胺间二甲氧嘧啶 (Sulfadimethoxine,SDM), 购于北京百灵威科技有限公司 ( 结构式见图 1); 乙腈甲醇 ( 色谱纯, 美国 Fisher 公司 ); 甲醇丙酮乙酸乙酯 ( 分析纯, 北京化工厂 ); 硅胶 ( 粒径 150 m m) 硅藻土 ( 粒径 38 mm) 氧化铝 ( 粒径 75 mm), 购于中国药品生物制品检定所, 在 650 下灼烧 4 h, 烘干 2 h, 储藏于干燥器中二次蒸馏水由 Milli-Q 水纯化系统 ( 美国 Millipore 公司 ) 制得配制 500 mg/l 磺胺标准储备液 : 称取磺胺标准品各 2.50 mg, 分别用乙腈定容至 5 ml, 保存于 4 恒温冰箱中待用工作溶液采用乙腈稀释标准储备液得到牛肉购于当地超市 2.2 实验方法色谱条件流动相 : 乙腈 - 水 (30 70,V/V), 流速 :0.4 ml/min, 进样量 5 ml, 柱温 40, 等度洗脱, 检测波长 :270 nm 样品前处理称取 0.2 g 牛肉样品, 加入磺胺工作溶液, 研磨混合均匀在该加标样品中加入适量分散剂, 研磨至分散均匀将混合物转移到 10 ml 注射器中转移之前, 注射器底部放一层脱脂棉, 加入 0.5 g 分散剂作为净化层, 将混合物转移其中, 上方再放置一层脱脂棉, 压实用适量洗脱液重力洗脱目标待测物收集洗脱液, 用氮气吹干, 以乙腈定容至 100 ml, 过 0.22 mm 滤膜, 进样量 5 ml, 进行 UFLC 分析图 1 Fig.1 磺胺类药物的结构式 Chemical structures of sulfonamides 3 结果与讨论 3.1 色谱条件优化选择 270 nm 作为紫外检测波长为了得到较好的分离效果, 分别考察了甲醇 - 水和乙腈 - 水作为流动相时的分离效果, 并同时考察了流速的影响结果表明, 乙腈 - 水 (30 70,V/V) 作为流动相时, 分离效果好,15 min 之内即可分离完全 ( 图 2) 3.2 基质固相分散法条件优化分散剂的选择为了获得最佳提取条件, 分别考察了硅胶硅藻土氧化铝作分散剂时的提取效果准确称取 0.2 g 牛肉样品, 牛肉样品加标水平为 1250 ng/g, 分散剂用量为 0.8 g, 以 6 ml 乙腈为洗脱剂, 进行基质固相提取, 每个样品平行制备 3 组实图 2 标准溶液的色谱图验结果表明 ( 图 3), 使用硅胶和氧化铝作为分散剂 Fig.2 Chromatograms of standard solution 时, 分散效果不好, 磺胺化合物回收率较低当使用硅藻土作为分散剂时, 回收率明显高于其它 2 种分散剂因此本实验最终选择硅藻土作为分散剂洗脱剂及其用量的选择考察了乙腈甲醇丙酮和乙酸乙酯 4 种洗脱剂对磺胺类物质的洗脱能力 ( 图 4) 准确称取 0.2 g 牛肉样品, 牛肉样品加标水平为 1250 ng/g, 硅藻土用量为 0.8 g, 洗脱剂用量为 6 ml, 进行基质固相提取, 每个样品平行制备 3 组结果表明, 丙酮对磺胺类物质的洗脱能力很弱 ; 乙腈和乙酸乙酯作为洗脱剂时回收率略高于丙酮, 但仍然不能充分洗脱 ; 甲醇作为洗脱剂, 洗脱效果明显优于其它洗脱剂, 因此选择甲醇作为洗脱剂

第期王重洋等 : 基质固相分散 - 超快速液相色谱测定牛肉中磺胺类兽药在上述条件下, 分别选用 4, 6, 8 和 10 ml 的甲醇进行洗脱 ( 图 5) 结果表明, 当甲醇体积从 4 ml 增加到 6 ml 时, 由于洗脱更加充分,ST, SM1, SMZ 和 SDM 的回收率随洗脱剂体积增加而明显提高 ;

3 Effect of dispersant on the recoveries of the sulfoṉ amides 图 4 洗脱剂对磺胺化合物回收率的影响 Fig.

3 样品与分散剂质量比的影响样品与分散剂的用量比对提取效果有一定的影响本实验中, 准确称取 0.2 g 牛肉样品, 牛肉样品加标水平为 1250 ng/g, 分别考察 0.4, 0.6, 0.8 和 1.

的回收率最高, 因此样品与分散剂最佳质量比为 1 4 图 6 样品与分散剂的质量比对磺胺化合物回收率的 3.3 标准曲线影响在最佳提取条件和色谱条件下, 检测不同加标 Fig.

3 第期王重洋等 : 基质固相分散 - 超快速液相色谱测定牛肉中磺胺类兽药在上述条件下, 分别选用 4, 6, 8 和 10 ml 的甲醇进行洗脱 ( 图 5) 结果表明, 当甲醇体积从 4 ml 增加到 6 ml 时, 由于洗脱更加充分,ST, SM1, SMZ 和 SDM 的回收率随洗脱剂体积增加而明显提高 ; 但洗脱剂体积增加到 10 ml 时, 回收率略有降低, 这是由于在洗脱及氮气吹干等操作中, 大体积的洗脱剂容易在装置及试管内壁产生残留, 导致磺胺类药物不能彻底有效全部分离, 因此对其回收率产生了一定影响, 因此选择 6 ml 的甲醇进行洗脱图 3 分散剂对磺胺化合物回收率的影响 Fig.3 Effect of dispersant on the recoveries of the sulfoṉ amides 图 4 洗脱剂对磺胺化合物回收率的影响 Fig.4 Effect of elution solvent on the recoveries of sulfoṉ amides 图 5 甲醇体积对磺胺化合物回收率的影响 Fig.5 Effect of methanol volume on the recoveries of suḻ fonamides 样品与分散剂质量比的影响样品与分散剂的用量比对提取效果有一定的影响本实验中, 准确称取 0.2 g 牛肉样品, 牛肉样品加标水平为 1250 ng/g, 分别考察 0.4, 0.6, 0.8 和 1.0 g 硅藻土对提取效果的影响 ( 图 6), 采用 6 ml 甲醇洗脱, 进行基质固相提取, 每个样品平行制备 3 组由于牛肉样品较粘稠, 不利于目标物的分散和提取, 因此当牛肉用量不变的条件下, 分散剂用量增大, 提取效果随之增强结果表明, 两者质量比为 1 4 时,ST, SM1,SMZ 和 SDM 的回收率最高, 因此样品与分散剂最佳质量比为 1 4 图 6 样品与分散剂的质量比对磺胺化合物回收率的 3.3 标准曲线影响在最佳提取条件和色谱条件下, 检测不同加标 Fig.6 Effect of mass ratio of the sample to dispersant on 浓度 (25, 50, 100, 250, 1250 和 2500 ng/g) 的牛肉样品, the recoveries of sulfonamides 对 4 种磺胺目标物的峰面积 A 与浓度 c 进行线性回归, 得到线性回归方程 4 种磺胺化合物在 25~2500 ng/g 范围内线性关系良好 (r>0.999) 回归方程线性范围相关系数等见表检出限及定量限检出限 (LOD) 和定量限 (LOQ) 分别为测量信号是空白样品信号标准偏差的 3 倍和 10 倍时所对应的被测物浓度 4 种磺胺化合物检出限及定量限见表 1, 检出限在 4.39~ 7.82 ng/g 之间, 定量限在 14.62~26.08 ng/g 之间

4 分析化学第 40 卷表 1 4 种磺胺化合物的线性方程线性范围相关系数检出限和定量限 Table 1 Calibration equations, linear range, correlation coefficient, limit of detection and limit of quantification of 4 kinds of suḻ fonamides 分析物 Analyte 线性范围 Linear range 线性方程 Calibration equations 相关系数 Correlation coefficient (r) 检出限 LOD Sulfathiazole 25~2500 y=22.67x Sulfamerazine 25~2500 y=25.11x Sulfamethoxazole 25~2500 y=24.76x Sulfadimethoxine 25~2500 y=28.90x 定量限 LOQ 3.5 精密度为了考察本方法的重现性, 分别测定了加标浓度为 75,200 和 500 ng/g 的牛肉样品的日内及日间精密度日内精密度是通过 1 d 之内平行测定 5 次 3 组加标水平下的牛肉样品, 得到的相对标准偏差日间精密度是通过连续 5 d 测定 3 组加标水平下的牛肉样品, 每天测定一次, 得到的相对标准偏差如表 2 所示,4 种磺胺类化合物的日内精密度为 1.9% ~12.4 %, 日间精密度为 2.1% ~12.7% 表 2 4 种磺胺化合物回收率和相对标准偏差 Table 2 Recoveries and relative standard deviation of 4 kinds of sulfonamides 分析物 Analyte Sulfathiazole Sulfamerazine Sulfamethoxazole Sulfadimethoxine 加标浓度 Concentration of standard addition Recovery (% ) 日内 Intra-day RSD (%,n=5) Recovery (% ) 日间 Inteṟ day RSD (%,n=5) 样品分析将市场上购买的 3 份牛肉样品, 在最优 MSPD 条件下进行处理, 并通过液相色谱进行分析, 均未检测出 4 种磺胺类药物残留分别在 0.2 g 牛肉样品 1 中, 添加 100 ml 浓度为 0.15,0.40 和 1.00 mg/l 的混合标准品溶液, 使牛肉中被测物浓度为 75,200 和 500 ng/g, 在最优条件下进行基质固相分散处理, 并进入液相色谱进行测定, 结果见图 7 根据峰面积 A 计算回收率 : R=A/A 标式中 :R 为回收率 (% );A 标分析标准溶液时所测得的峰面积 ;A 为分析相同浓度的样品提取液测到的峰面积由表 2 可见,ST, SM1, SMZ 和 SDM 在 3 个加标水平下的回收率均在 71.73% ~113.13% 之间 ;RSD 在 1.9% ~12.7% 之间图 7 牛肉空白样品 (a) 及加标样品 (b) 的色谱图 Fig.7 Chromatograms of blank sample ( a) and spiked sample (b) 加标浓度为 250 ng/g 1. 磺胺噻唑 ; 2. 磺胺甲基嘧啶 ; 3. 磺胺甲基异恶唑 ; 4. 磺胺间二甲氧嘧啶 Spiked concentration: 250 ng/g; 1. ST, 2. SMI, 3. SMZ, 4. SDM.

5 第期王重洋等 : 基质固相分散 - 超快速液相色谱测定牛肉中磺胺类兽药 4 结论本研究建立了牛肉中 4 种磺胺类兽药残留的基质固相分散 - 超快速液相色谱测定方法采用基质固相分散技术进行样品前处理, 具有样品处理简单快速提取效率高消耗溶剂少和吸附剂成本低等优点, 超快速液相色谱技术也具有高通量样品分析的能力 References 1 FangGZ,HeJX,WangS.J.Chromatogr.A,2006,1127(1-2): WeiF,FengY Q.AnalyticalMethods,2011,3(6): CrossRF,EzzelJL,RichterBE.JournalofChromatographicScience,1993,31(5): BerradaH,BorrulF,FontG,MarceR M.J.Chromatogr.A,2008,1208(1-2): KANG Yong-Feng,ZOU Shi-Wen,DUAN Wu-Ping,LIYan,SUN Tao.ChineseJournalofChromatography, 2010,28(11): 康永锋, 邹世文, 段吴平, 李艳, 孙涛. 色谱,2010,28(11): García-LópezM,CanosaP,RodríguezI.Anal.Bioanal.Chem.,2008,391(3): BarkerSA.J.Biochem.Biophys.Methods,2007,70: BogialiS,CorciaA D.J.Biochem.Biophys.Methods,2007,70: MaudensK E,ZhangGF,LambertW E.J.Chromatogr.A,2004,1047(1): JIANG Yuan,SHENChong-Yu,YAO Yi-Gang,DING Tao,JIA Tao,ZHAO Hou-Min,XUJiṉZhong.Journal ofinstrumentalanalysis,2009,28(7): 蒋原, 沈崇钰, 姚义刚, 丁涛, 贾涛, 赵厚民, 徐锦忠. 分析测试学报,2009,28(7): WonSY,LeeC H,ChangH S,KimSO,LeeSH,Kim DS.FoodControl,2011,22(7): ValerieB.Reeves.J.Chromatogr.B,1999,723: Fuh MRS,ChuSY.Anal.Chim.Acta,2003,499(1-2): MatrixSolidPhaseDispersioncoupledwithUltra-FastLiquid ChromatographyforDetectionofSulfonamidesinBeefTisue WANGChong-Yang,WANG YuaṉPeng,JIANGChuṉZhu,YU Xi,SONGDa-Qian,SUN Ying * (ColegeofChemistry,JilinUniversity,Changchun130012,China) Abstract Thematrixsolidphasedispersion (MSPD)coupledwithultra-fastliquidchromatography (UFLC)wasappliedforthesimultaneousdetermination ofsulfonamides,includingsulfathiazole (ST),sulfamerazine(SM1),sulfamethoxazole (SMZ)andsulfadimethoxine (SDM)inbeeftissue. TheoptimizedconditionsforMSPDandUFLCwereasfolows:kieselguhrwasusedasdispersant,6 ml methanolwasusedaselutionsolventandthemassratioofsampletodispersantwas1 4.Limits ofdetectionandquantificationsoftheanalyteswere ng/gand ng/g,respectively.thespikedsamples wereanalyzedandtherecoveriesofst,sm1,smz and SDM were 71.73% %.RSDvalueswere1.9%-12.4%. Keywords Matrixsolidphasedispersion (MSPD);Ultra-fastliquidchromatography;Sulfonamides; Beef (Received24 May2012;accepted17July2012)

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.