标题

Size: px

Start display at page:

Download "标题"

部袜章碧鲁
5 years ago
Views:

1 2016 年 11 月 Vol.34 No.11 October 2016 Chinese Journal of Chromatography 1063 ~ 1069 研究论文 DOI: / SP.J 分子印迹固相萃取超高效液相色谱串联质谱法测定鸡肉中 9 种氟喹诺酮药物残留杨艳菲 1,2, 曹旭敏 2,3, 李雪莲 4, 宋建德 2, 孙晓亮 2,3, 王淑婷 2,3, 王晓茵 2,3, 李琳 1 2,3, 赵思俊 (1. 安徽农业大学动物科技学院, 安徽合肥 ; 2. 中国动物卫生与流行病学中心, 山东青岛 ; 3. 农业部畜禽产品质量安全风险评估实验室 ( 青岛 ), 山东青岛 ; 4. 青岛易邦生物工程有限公司, 山东青岛 ) 摘要 : 建立了分子印迹固相萃取 (MISPE) 超高效液相色谱串联质谱 ( UPLC MS / MS) 同时测定鸡肉中 9 种氟喹诺酮药物残留的分析方法样品经均质处理后, 采用磷酸盐缓冲液提取, 提取液经 MISPE 柱净化后, 采用 BEH C 18 柱分离, 以乙腈 0 1% (v / v) 甲酸水溶液为流动相, 梯度洗脱, 采用电喷雾正离子多反应监测模式, 外标法定量考察了 MISPE 柱对 9 种氟喹诺酮药物的吸附特异性 ;9 种药物在 0 25~ 100 μg / L 范围内线性关系良好, 相关系数 ( r) > ; 检出限和定量限分别为 0 08 μg / kg 和 0 25 μg / kg; 在 μg / kg 添加水平下,9 种药物的回收率为 65 8% ~ 112 2%, 批内批间 RSD 分别为 0 6% ~ 13 5% 和 0 5% ~ 14 9%; MISPE 的最大柱容量为 ~ μg / L 该方法灵敏度好操作简单快速关键词 : 超高效液相色谱串联质谱 ; 分子印迹固相萃取 ; 氟喹诺酮 ; 鸡肉中图分类号 :O658 文献标识码 :A 文章编号 : (2016) Determinat of nine fluoroquinolone residues in chicken by ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry coupled with molecularly imprinted solid phase extract YANG Yanfei 1,2, CAO Xumin 2,3, LI Xuelian 4, SONG Jiande 2, SUN Xiaoliang 2,3, WANG Shuting 2,3, WANG Xiaoyin 2,3, LI Lin 1, ZHAO Sijun 2,3 (1. College of Animal Science and Technology, Anhui Agriculture University, Hefei , China; 2. China Animal Health and Epidemiology Center, Qingdao , China; 3. Livestock and Poultry Products Quality and Safety Risk Assessment Laboratory, Ministry of Agriculture (Qingdao), Qingdao , China; 4. Qingdao Yebio Biological Engineering Co., Ltd., Qingdao , China) Abstract: An ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry ( UPLC MS / MS) method coupled with molecularly imprinted solid phase extract ( MISPE) for the deter minat of nine fluoroquinolone residues in chicken was developed. The samples were extrac ted with phosphate buffer solut, and cleaned up with MISPE columns. Then the drugs were analyzed on a BEH C 18 column by gradient elut with acetonitrile and 0 1% (v / v) formic acid solut as mobile phase. The samples were analyzed in electrospray positive mode and multiple react monitoring ( MRM) mode. The analytes were quantified by external standard method. The specific adsorpt of MISPE for the nine fluoroquinolones in chicken samples was investigated. The linear ranges were μg / L with correlat coefficients ( r) greater 收稿日期 : 通讯联系人.E mail:lilinah@ 126.com( 李琳 );E mail:zhsjun@ 126.com( 赵思俊 ). 基金项目 : 国家畜禽质量安全风险评估项目 (GJFP ); 中国动物卫生与流行病学中心创新基金项目 (2014IF 0003FF). Foundat item: Natal Livestock Quality and Safety Risk Assessment Project ( No. GJFP ); Innovat Fund of China Animal Health and Epidemiology Center ( No. 2014IF 0003FF).

2 1064 色谱第 34 卷 than The limits of detect (LODs, S / N = 3) and the limits of quantificat ( LOQs, S / N = 10) were 0 08 μg / kg and 0 25 μg / kg, respectively. At the spiked levels of 0 25, 2 5, 5 0 μg / kg, the recoveries were 65 8% % with the intra RSDs of 0 6% -13 5% and inter RSDs of 0 5% -14 9%, respectively. The maximum capacities of the MISPE column were μg / L. The method is sensitive, simple and rapid for the simultaneous determinat of the nine fluoroquinolone residues. Key words: ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry ( UPLC MS / MS); molecularly imprinted solid phase extract ( MISPE); fluoroquinolones; chicken 氟喹诺酮 (fluoroquinolones, FQs) 药物是一类人工合成的广谱抗菌药, 因其具有抗菌谱广杀菌能力强半衰期长等特点而广泛用于动物和人类感染性疾病的预防和治疗 [1] 该类药物容易在动物组织中蓄积而导致药物残留, 长时间使用还会使致病菌产生耐药性, 对人类健康危害较大 [2,3] 因此, 基于保护消费者健康安全的目的, 许多国家都制定了氟喹诺酮类药物在动物性食品中的最高残留限量 [4,5] 为更好地保障人类健康安全, 我国农业部于 2015 年发布了第 2292 号公告 [6] : 禁止在动物饲养中使用洛美沙星培氟沙星氧氟沙星诺氟沙星 4 种药物目前我国已对 9 种氟喹诺酮类药物的使用进行了明确规定, 因此, 亟需开展动物性食品中上述 9 种药物残留检测技术的研究, 以满足日常监管的需要动物性食品样品的基质与组成相当复杂, 目标物易被干扰, 因此, 样品前处理成为动物性食品残留检测分析的关键步骤液液萃取法 [7,8] 基质固相分散萃取法 [9] [10-13] 固相萃取法等是目前最常用的样品前处理方法, 液液萃取法通常需大量的化学试剂, 且操作复杂 ; 固相萃取技术具有操作简单价格低廉易于自动化的优点, 但常规的固相萃取吸附剂为非特异性吸附, 吸附性和选择性较差, 对复杂样品的净化和富集较难因此, 开发免疫亲和色谱 [2,14,15] 分子印迹聚合物 ( molecularly imprinted polymer, MIPs) [16-18] 等具有高选择性的吸附剂具有重要意义免疫亲和色谱柱需大量高质量的抗体, 价格昂贵且不易制备, 因而在实际监管时, 大批量的使用受到限制 MIPs 作为一种新型材料, 俗称塑料抗体, 能够特异性的识别与吸附目标物及其结构类似物, 具有稳定性好耐酸碱等特点, 适于分离富集复杂样品中的痕量分析物 [17-19] MIPs 作为固相萃取的吸附剂在动物性食品安全监测中受到越来越多的关注 [19,20] [21] Urraca 等建立了分子印迹固相萃取 ( molecularly imprinted solid phase extract, MISPE) 结合液相色谱串联质谱测定鸡肉中 FQs 残留的方法, 但其仅能对恩诺沙星环丙沙星洛美沙星单诺沙星诺氟沙星沙拉沙星 6 种 FQs 药物进行检测本研究基于 MISPE 的特异性, 通过优化上样淋洗洗脱及液相色谱分离质谱检测等条件, 建立了一种 MISPE 超高效液相色谱串联质谱 (UPLC MS / MS) 测定鸡肉中 9 种 FQs 残留的分析方法 1 实验部分 1.1 仪器与试剂 Acquity UPLC Xevo TQ MS 超高效液相色谱串联质谱仪固相萃取装置 ( 美国 Waters 公司 ); 5804R 台式高速冷冻离心机微量移液器 ( 德国 Eppendorf 公司 ); SupelMIP TM SPE(FQs, 25 mg / 3 ml, 美国 Sigma 公司 ); GHP 针式滤膜 (0 22 μm, 美国 Pall 公司 ) 甲醇乙腈均为色谱纯 ( 德国 Merck 公司 ); 甲酸为色谱纯 ( 北京迪马科技有限公司 ); 乙酸氨水为分析纯 ( 国药集团化学试剂有限公司 ) 环丙沙星 (ciprofloxacin, 纯度 >94%) 达氟沙星 (danofloxacin, 纯度 >93 5%) 恩诺沙星( enrofluxa cin, 纯度 > 99%) 沙拉沙星 ( sarafloxacin, 纯度 > 97%) 二氟沙星(difloxacin, 纯度 >98%) 诺氟沙星 (norfloxacin, 纯度 >99 1%) 氧氟沙星( ofloxacin, 纯度 > 99%) 洛美沙星 ( lomefloxacin, 纯度 > 97 6%) 培氟沙星( pefloxacin, 纯度 >99%) 标准品均购自德国 Dr. Ehrenstorfer 公司喹诺酮母核及 9 种氟喹诺酮药物的化学结构式见图标准溶液的配制分别准确称取 9 种 FQs 标准物质于 25 ml 容量瓶中, 用甲醇溶解并定容至刻度, 配制质量浓度为 mg / L 的标准储备液, 于 - 20 避光保存 ; 分别移取适量标准储备液, 根据需要用流动相逐级稀释, 配制适当质量浓度的 9 种 FQs 混合标准工作液, 现用现配

3 杨艳菲等分子印迹固相萃取超高效液相色谱串联质谱法测定鸡肉中９种氟喹诺酮药物残留第１１期Ｆｉｇ１１３１０６５图１喹诺酮母核及９种氟喹诺酮的化学结构式Ｃｈｅｍｉｃａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓｏｆｍｏｔｈｅｒｎｕｃｌｅｕｓｏｆｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓａｎｄｔｈｅｎｉｎｅｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ液相色谱质谱条件色谱柱ＡｃｑｕｉｔｙＵＰＬＣＢＥＨＣ１８柱１００ｍｍ２１ｍｍ１７ μｍ美国Ｗａｔｅｒｓ公司柱温３５流动相Ａ乙腈和Ｂ０１ｖｖ甲酸水溶液梯度洗脱程序０２０ｍｉｎ１０Ａ２０３０ｍｉｎ溶液洗脱将洗脱液于５０水浴下氮气吹至近干用１ｍｌ０１ｖｖ甲酸乙腈９１ｖｖ复溶过０２２ μｍ滤膜供检测２结果与讨论１０Ａ１５Ａ３０４０ｍｉｎ１５Ａ５５Ａ４０２１１０Ａ５５７０ｍｉｎ１０Ａ流速０３ｍｌｍｉｎ碱两性在酸性溶液的条件下呈阳离子状态在电喷雾正离子模式下极易形成ＭＨ准分子离子通５０ｍｉｎ５５Ａ８０Ａ５０５５ｍｉｎ８０Ａ进样量５０ μｌ离子源电喷雾离子ＥＳＩ源正离子模式离子源温度１５０检测方式多反应监测模式ＭＲＭ毛细管电压２７００Ｖ雾化室温度４５０雾化气氮气流量１０００Ｌｈ锥孔气氮气流量５０Ｌｈ碰撞气氩气流量０２４Ｌｈ１４献样品前处理取鸡肉样品匀浆于２０保存参照文１１准确称取２０ｇ均质后的鸡肉样品于５０ｍｌ离心管中加入８ｍｌ０５ｍｏｌＬ磷酸二氢钾溶液质谱条件的优化ＦＱｓ的分子结构中含有羧基和叔氨基具有酸过优化各药物的特征离子对毛细管电压雾化室温度碰撞电压等质谱条件选取相对丰度强干扰小的离子对作为９种ＦＱｓ药物的定性定量离子９种待测物的保留时间母离子子离子锥孔电压碰撞能量见表１为提高方法的灵敏度降低基质干扰本研究采用分段扫描的方式进行数据采集９种ＦＱｓ药物的ＭＲＭ色谱图见图２２２ＭＩＳＰＥ柱的吸附特征ＭＩＳＰＥ柱在净化基质中的痕量目标物时除特ｐｈ５０涡旋混合以８０００ｒｍｉｎ离心５ｍｉｎ收异性地吸附目标物外还存在非特异性吸附需通过酸二氢钾溶液溶解残渣合并上清液待净化ＭＩＰｓ结合位点与目标物间的选择性吸附降低非特液上样分别经２ｍｌ水甲醇和０１ｖｖ氨水溶镇静剂地西泮劳拉西泮阿扎哌隆３种磺胺类集上清液于５０ｍｌ离心管中用８ｍｌ０５ｍｏｌＬ磷依次用２ｍｌ甲醇和水活化ＭＩＳＰＥ柱取上清液淋洗用洗耳球挤干用３ｍｌ５ｖｖ氨化甲醇优化ＭＩＳＰＥ柱的淋洗和洗脱条件最大限度地提高异性吸附和基质效应１６１８１９因此本实验对３种磺胺噻唑磺胺间甲氧嘧啶磺胺对甲氧嘧啶及３

4 1066 色谱第 34 卷 Table 1 表 1 9 种氟喹诺酮药物的保留时间母离子子离子及其他质谱参数 Retent times (t R ), precursor s, daughter s and other MS parameters of the nine fluoroquinolones t R / min Precursor Daughter Cone voltage / V Collis energy / ev t R / min Precursor Daughter Cone voltage / V Ofloxacin Lomefloxacin Collis energy / ev Norfloxacin Enrofluxacin Pefloxacin Sarafloxacin Ciprofloxacin Difloxacin Danofloxacin Quantitative 图 2 空白鸡肉样品和加标鸡肉样品 (0 25 μg / kg) 中 9 种氟喹诺酮类药物的色谱图 Fig. 2 Chromatograms of the nine fluoroquinolones in blank chicken samples and chicken samples spiked with 0 25 μg / kg

5 第 11 期杨艳菲, 等 : 分子印迹固相萃取超高效液相色谱串联质谱法测定鸡肉中 9 种氟喹诺酮药物残留 1067 种喹诺酮类 ( 氟甲喹恶喹酸萘啶酸 ) 药物进行了 MISPE 特异性吸附试验, 分别比较了水甲醇 0.1% (v / v) 氨水 0.5% ( v / v) 乙酸乙腈溶液对 MISPE 柱进行淋洗及 2% (v / v) 氨化甲醇和 5% ( v / v) 氨化甲醇进行洗脱时,9 种 FQs 药物及非目标物的回收率将含有镇静剂磺胺类喹诺酮类药物及 9 种目标物的磷酸二氢钾溶液加入 MISPE 柱, 分别收集上样液淋洗液和洗脱液, 测定各药物的回收率结果表明, 上样液流经 MISPE 柱后, 镇静剂磺胺类喹诺酮类药物不能被有效保留, 有 26 4% ~ 87 5% 直接流出 ; 经水甲醇 0 1% ( v / v) 氨水溶液淋洗后, 残留的非目标物均被淋洗下来, 而目标物的回收率极低 ; 经淋洗液淋洗后, 采用 5% ( v / v) 氨化甲醇溶液洗脱时, 仅 9 种 FQs 药物被洗脱, 且回收率均高于 65%, 而未发现非目标物其原因可能是镇静剂和磺胺类药物的化学结构 ( 见图 3) 与 FQs 药物相差较大, 且不具有 FQs 侧链中的羧基哌嗪基等活性官能团, 不易与 MIPs 相互作用, 在上样淋洗过程中直接被淋洗下来 ;3 种喹诺酮类药物虽具有与 FQs 药物共同的母核结构 ( 见图 1), 但侧链 R7 位无哌嗪环, 缺少与 MIPs 特异性结合的位点本方法采用的 MISPE 柱对镇静剂磺胺类及喹诺酮类药物无特异性吸附, 对 9 种氟喹诺酮药物具有良好的特异性 2.3 MISPE 柱柱容量的测定柱容量是指 MISPE 柱的活性功能基团能够吸附待测物的最大容量, 是考察 MISPE 柱的重要参数之一称取 2 0 g 鸡肉样品, 分别添加系列质量浓度的 FQs 混合标准溶液, 检测各药物的回收率, 从而计算 MISPE 柱的最大柱容量结果表明, 该 MISPE 柱对 9 种目标物的最大柱容量为 ~ μg / L ( 见表 2) 表 2 MISPE 柱对 9 种氟喹诺酮药物的最大柱容量 Table 2 Maximum capacities of the MISPE column for the nine fluoroquinolones Maximum capacity / (μg / L) Ofloxacin Norfloxacin Pefloxacin Ciprofloxacin Danofloxacin Lomefloxacin Enrofluxacin Sarafloxacin Difloxacin MISPE: molecularly imprinted solid phase extract. 2.4 基质效应在空白鸡肉样品中添加不同质量浓度的混合标准溶液, 以各药物的峰面积对质量浓度绘制标准曲线,9 种 FQs 的基质标准曲线与试剂标准曲线的斜率比为 85 3% ~ 113 8% 程志等 [22] Matuszewski [23] 等的研究表明, 基质标准曲线与试剂标准曲线的斜率比为 80% ~120% 时, 基质效应对各药物的影响不明显说明本方法采用基质加标标准曲线对加标回收率进行定量时, 基质效应对检测结果几乎无影响 Fig. 3 图 3 喹诺酮类镇静剂和磺胺类药物的化学结构 Chemical structures of quinolones, sedatives and sulfonamides

6 1068 色谱第 34 卷 2.5 线性关系检出限和定量限将空白鸡肉样品按 1.4 节处理后, 添加不同质量浓度 ( μg / L) 的混合标准溶液, 以各药物定量子离子的峰面积 (Y) 为纵坐标, 基质标准溶液的质量浓度 (X, μg / L) 为横坐标, 绘制标准曲线 ( 见表 3) 各药物在 0 25 ~ 100 μg / L 范围内线性关系良好, 相关系数 ( r) 均 > 分别以 3 倍和 10 倍信噪比 (S / N) 确定检出限 (LOD) 和定量限 ( LOQ), 分别为 0 08 μg / kg 和 0 25 μg / kg 2.6 准确度和精密度分别在空白鸡肉样品中添加 LOQ 10 倍 LOQ 20 倍 LOQ 3 个水平 ( μg / kg) 的标准物质, 每个水平做 6 个平行试验, 重复 3 次, 考察方法的准确度和精密度 9 种 FQs 的平均回收率为 65 8% ~ 112 2%, 批内和批间 RSD 分别为 0 6% ~ 13 5% 和 0 5% ~14 9% ( 见表 4) 2.7 实际样品测定采用本研究建立的方法和 GB / T 方表 3 9 种氟喹诺酮类药物的回归方程及相关系数 (r) Table 3 Regress equats and correlat coefficients (r) of the nine fluoroquinolones Regress equat r Ofloxacin Y = X Norfloxacin Y = X Pefloxacin Y = X Ciprofloxacin Y = X Danofloxacin Y = X Lomefloxacin Y = X Enrofluxacin Y = X Sarafloxacin Y = X Difloxacin Y = X Y: peak area; X: mass concentrat, μg / L; linear range: μg / L. 法分别对山东省某屠宰场采集的 60 份鸡肉样品进行检测结果表明, 有 2 份鸡肉样品中含有诺氟沙星, 其余样品均未检出 FQs 药物残留本方法检测出的残留值为 3 78 μg / kg 和 6 27 μg / kg, GB / T 方法的检测值为 3 05 μg / kg 和 6 73 μg / kg 两种方法检测结果基本一致,RSD<15 1% Table 4 表 4 空白鸡肉样品中 9 种氟喹诺酮类药物的加标回收率批内和批间相对标准偏差 Recoveries, intra and inter RSDs of the nine fluoroquinolones spiked in blank chicken samples Added / (μg / kg) Recovery (n = 18) / % Intra RSD (n = 6) / % Inter RSD (n = 3) / % Added / (μg / kg) Recovery (n = 18) / % Intra RSD (n = 6) / % Inter RSD (n = 3) / % Ofloxacin Lomefloxacin Norfloxacin Enrofluxacin Pefloxacin Sarafloxacin Ciprofloxacin Difloxacin Danofloxacin 结论本研究基于 MIPs 特异性吸附的特点, 有效降低了样品基质的干扰, 并通过优化 MISPE 柱的上样淋洗和洗脱条件, 建立了 UPLC MS / MS 测定鸡肉中 9 种 FQs 残留的分析方法该方法选择性好灵敏度高重复性好且操作简单快速, 可以用于畜禽产品质量安全监测时大批量样品中 FQs 药物残留的筛查和确证参考文献 : [1] Chen Z L. Veterinary Pharmacology. 3rd ed. Beijing: China Agricultural Press, 2009: 272 陈杖榴. 兽医药理学. 第 3 版. 北京 : 中国农业出版社, 2009: 272 [2] Zhao S J, Jiang H Y, Li X L, et al. J Agric Food Chem, 2007, 55: 3829 [3] Chai M J, Xiao Y, Zhang M, et al. Food Research and Development, 2013, 34(6): 129 柴铭骏, 肖妍, 张曼, 等. 食品研究与开发, 2013, 34(6): 129

7 第 11 期杨艳菲, 等 : 分子印迹固相萃取超高效液相色谱串联质谱法测定鸡肉中 9 种氟喹诺酮药物残留 1069 [4] European Commiss. Regulat 99 / 508 / EEC of 9 March Off J Eur Communities. 1999, L60: 305 [5] Ministry of Agriculture. No. 235 Bulletin of the Ministry of Agriculture of the People s Republic of China 农业部. 中华人民共和国农业部第 235 公告 [6] Ministry of Agriculture. No Bulletin of the Ministry of Agriculture of the People s Republic of China 农业部. 中华人民共和国农业部第 2292 公告 [7] Liu Y, Xie M X, Ding L, et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2004, 32(3): 352 刘媛, 谢孟峡, 丁岚, 等. 分析化学, 2004, 32(3): 352 [8] Gajda A, Posyniak A, Zmudzki J, et al. Food Chem, 2012, 135: 430 [9] Cao P, Mou Y, Gao F, et al. Chinese Journal of Chromatog raphy, 2013, 31(9): 862 曹鹏, 牟妍, 高飞, 等. 色谱, 2013, 31(9): 862 [10] Liu P Y, Shen J, Liu L. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2012, 40(5): 693 刘芃岩, 申杰, 刘磊. 分析化学, 2012, 40(5): 693 [11] Zhao S J, Li C, Jiang H Y, et al. Chinese Journal of Analyt ical Chemistry, 2007, 35(6): 786 赵思俊, 李存, 江海洋, 等. 分析化学, 2007, 35(6): 786 [12] Wang J Q, Ma J M, Xia X, et al. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society, 2014, 35(2): 185 王金秋, 马建民, 夏曦, 等. 质谱学报, 2014, 35(2): 185 [13] Hermo M P, Barron D, Barbosa J. J Chromatogr A, 2008, 1201: 1 [14] Yao K, Zhang W, Yang L Y, et al. J Chromatogr B, 2015, 1003: 67 [15] Wang Y, Xu Y, Zhang X, et al. J Chromatogr B, 2011, 879: 2149 [16] Cristina B, Yolanda P. J Agric Food Chem, 2012, 60: [17] Martin P D, Jones G R, Stringer F, et al. J Pharm Biomed Anal, 2004, 35: 1231 [18] Wang L J, Cao X M, Sun X L, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2016, 34(3): 240 王丽君, 曹旭敏, 孙晓亮, 等. 色谱, 2016, 34(3): 240 [19] Liu S T, Yan H Y, Wang M Y, et al. J Agric Food Chem, 2013, 61: [20] Yan H Y, Wang F, Wang H, et al. J Chromatogr A, 2012, 1256: 1 [21] Urraca J L, Castellari M, Barrios C A, et al. J Chromatogr A, 2014, 1343: 1 [22] Cheng Z, Zhang R, Liu W H, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2014, 32(1): 57 程志, 张蓉, 刘韦华, 等. 色谱, 2014, 32(1): 57 [23] Matuszewski B K. J Chromatogr B, 2006, 830: 293

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.