2008,28(7) 马爱丽等 : 三重表达肺结核 DNA 疫苗在细胞水平的检测 79 CTL 活性, 协助抗原诱发机体更强的杀伤结核分枝杆菌的活性 研究中选用人源白介素 12(hIL 12) 作为疫苗的基因佐剂, 并通过 sirna 技术抑制负调因子的表达, 企求通过宿主方面攻击结核菌感染途径与机

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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2008,28(7):78~86 殏 檪檪 殏 技术与方法 殏 檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪 殏 三重表达肺结核 DNA 疫苗在细胞水平的检测 马爱丽 曹以诚 张珍武 ( 华南理工大学生物科学与工程学院广州 ) 摘要目的 : 评估整合 sirna 融合抗原基因 hil 12 的新型肺结核 DNA 疫苗在人胚肾细胞 293 中三个表达单元独立互不干扰表达 方法在已构建含有靶向抗调亡基因 Mcl 1L 的 sirna 结核分枝杆菌抗原基因 Ag85B ESAT6(PVAE) hil 12 三个独立表达单位的新型肺结核 DNA 疫苗 pvax sirna PVAE IL 12 基础之上, 将抗原基因与增强型绿色荧光蛋白 (EGFP) 基因融合, 得到真核表达质粒 pvax1 sirna PVAE[EGFP] hil12 并将 DNA 疫苗中的靶向抗凋亡基因 Mcl?1L 的序列置换为靶向 EGFP 基因的 sirna 序列 [siegfp], 得到 pvax1 [siegfp] PVAE[EGFP] hil12 表达质粒 用质粒 pvax1?sirna?pvae[egfp]?hil12 pvax1?[siegfp]?pvae[egfp]? hil12 转染人胚肾细胞 293, 以 EGFP 为报告基因, 分别证实融合抗原基因与 sirna 编码序列的表达 以 ELISA 测定培养细胞上清中 hil 12 的表达 结果经酶切鉴定和测序证实肺结核 DNA 疫苗改造成功 转染细胞中检测到绿色荧光, 证实了融合抗原基因的表达 对照组证实了 sirna 编码序列表达的抑制效果 转染 48h 后细胞培养液中 hil 12 的检出量为 pg/ml;72h 后细胞培养液中 hil 12 的检出量为 pg/ml 结论已构建的肺结核 DNA 疫苗能在真核细胞中有效表达 sirna 抗原基因与 hil 12 为进一步研究该 DNA 疫苗抗肺结核的免疫保护率和基因治疗效果打下基础 关键词肺结核 DNA 疫苗 sirna 融合抗原 hil 12 中图分类号 Q786 中国每年因结核病死亡十三万人, 结核病患者数量居世界第二位 国家卫生部 2008 年 3 月 4 日披露我国是已成为全球二十二个结核病高负担国家之一, 目前有肺结核病人四百五十万 结核病亦是世界上主要传染病的死因 在科技进步的今天, 结核病又有卷土重来之势, 特别是多重耐药性结核病的暴发流行和严重危害性, 引起人们的重视 随着耐药菌株与艾滋病的 同流合污, 它又一次严重地威胁人类的健康与生收稿日期 : 修回日期 : 国家自然科学基金重大研究项目 ( ) 教育部中国网格计划生物信息网格平台子项目 (B ) 国家科技基础条件平台项目 (2005DKA64001) 科技部基础学科平台建设生物计算网络平台项目 (2005DKA64001) 广州市科技攻关计划 (2005Z1 E4023) 资助项目 通讯作者, 电子信箱 :yccao@scut.edu.cn 命 这些都给此病的防御与治疗带来新的挑战, 为此人们不可不对它再次提高警惕 卡介苗 (baciluscalmeteguérinvaccine,bcg) 是由 CalmeteA 和 GuérinC 在 1908~1921 年间发明出来的 时至今日,BCG 仍是预防结核病的惟一可用疫苗 但是,BCG 的免疫保护力却并不令人满意, 因不同地区不同人群差异很大 (0% ~80%), 也缺乏统一的评价标准,BCG 不能应用于免疫缺陷的个体, 可以说 BCG 至多有 50% 的保护效力 [1,2] 所以, 世界各国都在致力于改进 BCG 进一步加强免疫保护性或研制一种新型有效的结核病疫苗 构建含有两个全抗原的 DNA 疫苗 [3], 与每个抗原单独存在时相比, 期望能引起更强烈持久的免疫反应 IL 12 作为一种有效的 Th1 刺激因子, 能显著增强

2 2008,28(7) 马爱丽等 : 三重表达肺结核 DNA 疫苗在细胞水平的检测 79 CTL 活性, 协助抗原诱发机体更强的杀伤结核分枝杆菌的活性 研究中选用人源白介素 12(hIL 12) 作为疫苗的基因佐剂, 并通过 sirna 技术抑制负调因子的表达, 企求通过宿主方面攻击结核菌感染途径与机体免疫机制等多因子相互作用增强疫苗的保护效力, 同时尝试结核病临床治疗新途径 为了方便抗原基因表达的检测, 将其与加强型绿色荧光蛋白 (EGFP) 融合表达, 克隆至 DNA 疫苗表达载体 pvax1 的多克隆位点内 可以根据 EGFP 的荧光示踪抗原的表达, 以及通过观察荧光检测 sirna 单元的能否正常转录并介导 RNA 干扰效应 在细胞水平证实, 结核新型核酸疫苗的三个表达单位在同一质粒内能够互不干扰地高效表达, 为进一步的疫苗体内试验奠定基础 1 材料与方法 1.1 质粒 菌种及细胞质粒 pvax1 购自 Invitrogen 公司,pcDNA6 EGFP 为本实验室构建保存 [4], 肺结核 DNA 疫苗 pvax1 PVAE hil12 pvax sirna PVAE IL 12 由本实验室构建保存 [3] 大肠杆菌 DH5α 和人胚肾细胞 293 由本实验室保存 1.2 主要试剂 T4DNA 连接酶 限制型内切酶 EcoRI KpnI Nhe I PmeI 购自 NEB 公司,rTaqDNA 聚合酶 PCR 产物纯化试剂盒 DNA 切胶纯化试剂盒购自 Takara 公司, 转染试剂 Lipofectamine 2000 购自 Invitrogen 公司,MEM 高糖培养基购自 Gibco 公司, 胎牛血清购自 Hyclone 公司,hIL 12ELISA 试剂盒和 hil 12 标准品购自博士德公司 1.3 靶向 EGFP 的 sirna 设计及其表达质粒的构建 靶向 EGFP 的 sirna 设计与合成 sirnapro 2.0 由本试验室自主开发的一套在线 sirna 设计程序 (htp://biogrid.scut.edu.cn/bioinfo/) 该程序既考虑了靶基因的一级结构, 也考虑了靶 mrna 的二级结构对 RNAi 的影响, 同时提供多个数据库供用户进行 BLAST 查询 本次实验关于靶向 EGFP 的 sirna 设计使用的是 sirnapro2.0 siegfp 的 DNA oligo 序列应为 :siegfp a:5 TCCCAGCTGACCCTGAAGTTCATCTCAAGAGGATGAAC TTCAGGGTCAGCTT 3 ;siegfp b:5 CAAAAAGCTG ACCCTGAAGTTCATCCTCTTGAGATGAACTTCAGGGTC AGCT 3 划线部分为靶向 EGFP 的 sirna, 即 siegfp 将上述 DNAoligo 序列委托英俊生物公司合成 sirna 表达质粒的构建与鉴定定购的 oligo 进行退火 : 本实验所用的双链 DNA 是由设计合成的单链经退火得到, 混合以下成分以制备退火反应体系,a 链 (25μmol/L)2μl,b 链 (25μmol/L)2μl,0.5mol/L NaCl6μl,ddH 2 O20μl 80 水浴 2min, 然后停止加热, 让其于水浴锅中缓慢冷却至 35 连接 : 反应体系是经 BbsI 消化的 psirna hh1neo 质粒 1μl(100ng), 待插入 DNA 片段 4μl,T4DNA 连接酶 1μl,10 bufer(mg 2+ plus)2μl,ddh 2 O12μl 16 过夜 重组质粒命名为 psiegfp 重组质粒酶切 :NcoI 酶切 psiegfp 反应体系: 质粒 DNA2μl,10 bufer(mg 2+ plus)2μl,0.1% BSA 2μl,NcoI 酶 1μl,ddH 2 O13μl 37 水浴 3h 将原质粒 重组质粒 NcoI 酶切后电泳检测 PCR 鉴定与序列测定 : 在插入序列两侧设计引物, PCR 扩增并测序 扩增片断大小应为 372bp 应用 Oligo6 软件, 设计引物 上游引物 (psiegfp R):5 ACGCTCAGTGGAACGAAAAC 3 ; 下游引物 (psiegfp L):5 CCACACCCTAACTGACACACA 3 PCR 反应液体系 :10 PCR bufer(mg 2+ plus)5μl,dntp( 各 2.5 mmol/l) mixture 4μl, ddh 2 O 38μl, psiegfp R (10μmol/L)1μl,psiEGFP L(10μmol/L)1μl,psiEGFP 模板 0.75μl,rTaqDNA polymerase(5u/μl)0.25μl 反应条件 :94 5min;94 30s,57 30s,72 30s, 共 30 个循环 ;72 7min;16 恒温 将 PCR 产物进行电泳并测序以证实插入序列的正确性 1.4 三重表达质粒 pvax siegfp PVAE IL 12 的构建与鉴定 siegfp 表达单位的 PCR 扩增及酶切 PCR 扩增重组 psiegfp 载体上带 hh1 启动子和转录终止位点的完整 siegfp 表达单元, 并在引物两端带上 MluI 酶切位点, 酶切后将其插入二元表达载体 pvax PVAE IL 12 复制起始位点 pucori 后区域上的 MluI 酶切位点 以 Psm Left:5 CAGCTACGCGTACGCTCAGTGGA ACGAAAAC 3 ;Psm Right:5 CTGGTACGCGTCCACA CCCTAACTGACACACA 3, 划线部分均为 MluI 酶切位点 以 Psm Left 和 Psm Right 引物扩增 psiegfp 表达载体上的 siegfp 表达单元, 反应体系 :10 bufer (Mg 2+ plus)5μl,dntpmixture4μl,ddh 2 O38μl,Psm Left(10μmol/L)1μl,Psm Right(10μmol/L)1μl, 模板 0.75μl,rTaqDNApolymerase(5U/μl)0.25μl 反应条件 :94 5min;94 30s,59 30s,72 30s, 共 30 个循

3 80 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.28No 环 ;72 5min PCR 产物用 15g/L 的琼脂糖凝胶电泳检测 siegfp 表达单位的 PCR 扩增产物酶切反应体系 :PCR 产物 8μl,10 H Bufer2μl,MluI 酶 1μl, ddh 2 O9μl 37 温育 1h 酶切产物用 DNA 凝胶回收试剂盒纯化 pvax PVAE IL 12 酶切及去磷酸化 MluI 酶切位点位于 pvax1 的复制起始位点 pucori 与 CMV 启动子之间的区域上, 以 MluI 酶切, 反应体系 :pvax PVAE IL 12 质粒 10μl,10 HBufer2μl,MluI 酶 1μl, ddh 2 O7μl 37 温育 1h 酶切产物用 DNA 凝聚回收试剂盒纯化 由于单酶切载体克隆是易发生自连, 筛选时假阳性过高, 故连接之前采用小牛肠碱性磷酸酶 (CIAP) 将载体去磷酸化, 反应体系 : 纯化的线性载体 20μl,10 CIAP Bufer4μl,CIAP2μl,ddH 2 O 14μl,37 温育 1.5h 载体去磷酸化之后, 加入 0.5mol/L(pH8.0) 的 EDTA, 使终浓度为 5mmol/L,65 温育 30min, 以灭活去磷酸化酶 DNA 凝聚回收试剂盒纯化去磷酸化载体 外源片段与载体连接将酶切纯化的 PCR 产物和去磷酸化后的线性载体用 T4DNALigase 连接, 连接体系 : 外源片段 8ul, 线性化载体 1μl,10 T4DNA LigaseBufer2μl,T4DNALigase1μl,ddH 2 O8μl 16 连接过夜 重组质粒的酶切鉴定以 MluI 酶切鉴定重组质粒, 反应体系 : 重组质粒 3μl,10 HBufer2μl,MluI 酶 1μl,ddH 2 O14μl 37 温育 1h 酶切反应产物用 0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测, 并设 pvax PVAE IL 12 MluI 酶切组做对照 重组质粒命名为 :pvax siegfp PVAE IL PCR 与测序鉴定 MluI 插入位点两端适当位置设计 PCR 扩增引物, 分别为 Pvm Left:5 GCGGAGCCTATGGAAAAAC 3, Pvm Right: 5 ATGTAACGCGGAACTCCATA 3 反应体系:10 bufer (Mg 2+ plus)5μl,dntpmixture4μl,ddh 2 O38μl,Pvm Left(10μmol/L)1μl,Pvm Right(10μmol/L)1μl, 模板 0.75μl,rTaqDNApolymerase(5U/μl)0.25μl 反应条件 :94 5min;94 30s,58 30s,72 30s, 共 30 个循环 ;72 5min PCR 产物用 1.5g/L 的琼脂糖凝胶电泳检测 经过酶切 PCR 扩增鉴定正确的重组质粒以引物 Pvm Left 测序 1.5 三重表达质粒 pvax sirna/siegfp PVAE EGFP IL 12 的构建与鉴定 PCR 引物的设计合成设计 PVAE 融合抗原基因的扩增引物, 上游引物序列为 :Pv left:5 AATAT GGTACCGCTAGCCCACCATGTGGCTG 3, 斜体部分分别为 KpnI NheI 酶切位点 ; 下游引物为 :Pv right:5 GTTGCGAATTCCATGCGAACATCCCAGTGACGTT 3, 斜体部分为 EcoRI 酶切位点 该引物去除了多表位抗原的终止密码子 TAA, 并保证三联体密码子的完整, 以便与标记用的 EGFP 融合表达 pvax sirna/siegfp PVAE EGFP IL 12 的构建去终止密码子的 PVAE 融合抗原基因获得 : 以 pvax1 PVAE hil12 为模板, 用引物 Pv left 和 Pv right 扩增 PVAE 融合抗原基因, 反应体系 :10 bufer (Mg 2+ plus)5μl,dntpmixture(10μmol/l)4μl,ddw 38μl,Pv left(10μmol/l) 1μl,Pv right(10μmol/l) 1μl, 模板 0.75μl(10μmol/L),rTaqDNA polymerase (5U/μl)0.25μl 反应条件:94 5min;94 30s; 57 30s;72 1min;72 5min; 共 30 个循环 扩增产物用 15g/L 的琼脂糖凝胶电泳检测 用 EcoRI 和 KpnI 双酶切 PCR 产物并切胶回收 PVAE 融合抗原基因构入 pcdna6 EGFP 载体 : 为了方便在细胞水平上检测抗原的表达, 采取的方法是将融合抗原基因与加强型绿色荧光蛋白基因融合表达 pcdna6 EGFP 为本实验室构建的载体,EGFP 在目的基因的 C 端, 并有适当的 Linker 保证融合基因互不干扰 以 pcdna6 EGFP 为过渡载体, 构建融合抗原基因与 EGFP 的融合基因, 抗原基因插入的位点在 EcoRI 和 KpnI 之间 将上面实验所得片段与 EcoRI 和 KpnI 双酶切的 pcdna6 EGFP 载体连接, 得到重组质粒命名为 pcdna6 AE EGFP, 酶切鉴定正确后测序验证 融合 EGFP 的融合抗原基因构入 pvax sirna/ siegfp PVAE IL 12 质粒中将 pcdna6 AE EGFP 用 NheI PmeI 双酶切并切胶回收 AE EGFP 片段, 与 Nhe I PmeI 双酶切的 pvax sirna/siegfp PVAE IL 12 连接得到 pvax sirna/siegfp PVAE EGFP IL 12 共表达载体, 酶切鉴定并测序 1.6 重组质粒瞬时转染细胞 293 细胞用含 10% 胎牛血清的 MEM 高糖培养基培养 取对数生长期的细胞接种 24 孔板, 接种密度为 ~ 个细胞 / 孔, 培养 24h, 待其汇合度达

4 2008,28(7) 马爱丽等 : 三重表达肺结核 DNA 疫苗在细胞水平的检测 81 到 70% ~80% 时转染 每孔加入 0.8μg 质粒和 2μl Lipofectamine 2000 混合物, 轻轻混匀, 置于 37 5% CO 2 培养箱中培养 6h 后换液, 然后继续培养以分析外源基因的表达 1.7 表达产物的检测由于 pvax1 并非共表达载体, 载体经过较大的工程改造, 将三个独立表达的基因构入其中, 希望它们互不干扰, 能够正常表达 抗原融合了 EGFP, 可以根据 EGFP 的荧光示踪抗原的表达, 并观察抗原 PVAE 中分泌信号肽是否能够起到分泌抗原的作用 通过观察 EGFP 的荧光量, 可以检测靶向 EGFP 的 siegfp 的表达, 进而证明三重表达载体上的 sirna 表达单元是否可以正常表达并介导 RNAi 效应 取转染 48h 的细胞, 置于倒置荧光显微镜下观察拍照 并设空载体转染组做对照 hil 12 为分泌型表达的细胞因子, 分别收集 24h 48h 72h 细胞培养上清, 以双抗夹心 ELISA 检测, 二抗为 HRP 标记, 加入显色底物 TMB 后以浓硫酸终止反应, 置于酶标仪读 OD 450nm 值 同时取 hil 12 标准品, 分别稀释成 7.8pg/ml 15.6pg/ml 31.2pg/ml 62.5 pg/ml 125pg/ml 250pg/ml 500pg/ml, 于同等条件下测定, 绘制 hil 12 标准曲线以计算转染细胞中 hil 12 的表达量 2 结果 2.1 重组质粒 psiegfp 的鉴定 psiegfp 酶切鉴定 psirna hh1neo 质粒的两个 BbsI 酶切位点之间有一个 NcoI 酶切位点, 在进行 BbsI 酶切时,NcoI 酶切位点被切掉, 也就是说重组质粒缺失了 NcoI 酶切位点 所以采用 NcoI 酶对原质粒和重组质粒进行酶切比较来初步验证重组质粒的正确性 若为重组成功的质粒则不会被 NcoI 酶切, 而原质粒则会被 NcoI 酶切成约 3000bp 的 DNA 片断 电泳结果 ( 图 1),1 泳道为经 NcoI 酶切后 psirna hh1neo 质粒, 电泳条带约为 3000bp;2 泳道为未经 NcoI 酶切的 psirna 质粒 ;3,4 为经 NcoI 酶切后的三组重组质粒, 由于重组质粒是在原质粒切除约 300bp 后, 插入不足 100bp 的合成序列, 因此相对质粒 psirna hh1neo 分子量较小, 电泳条带稍靠前 因此, 通过 NcoI 酶切实验初步验证了重组质粒 psiegfp 的正确性 PCR 鉴定结果将 psiegfp 与 psirna 质粒的 PCR 产物电泳鉴定 电泳结果 ( 图 2):1 泳道为 图 1 重组质粒酶切鉴定 Fig.1 Fragmentofrecombinantplasmid digestedwithendonucleases M:Marker;1:psiRNA hh1neodigestdwithbbs1enzyme; 2:psiRNA hh1neo;3,4:recombinantplasmidpsiegfp 图 2 重组质粒 PCR 产物结果 Fig.2 PCRproductofpsiEGFP M:Marker;1:PCRproductofpsiRNA;2,3:PCR productofpsiegfp;4:control psirna 质粒的 PCR 产物, 其大小为 550bp 左右 ;2,3 泳道为 psiegfp 质粒 PCR 产物, 条带大小理论值为 372bp;4 泳道为阴性对照 由此可知,psiEGFP 质粒的 PCR 产物条带大小全部正确 序列测定结果纯化后的 PCR 产物连同引物送至英俊生物有限公司进行测序, 将所得的测序结果与设计得序列进行比对分析可以得知测序结果与所设计的相符, 进一步证实了我们所构建的重组质粒 psiegfp 的正确性 2.2 重组质粒 pvax siegfp PVAE IL 12 的鉴定 酶切鉴定筛选出的重组质粒以 MluI 酶切验证, 显示大片段为 7600bp, 与 pvax PVAE IL 12MluI 酶切大小一致, 小片段长为 260bp, 与 sirna 表达单元的 PCR 产物一致 ( 图 3), 证明三元表达质粒构建成功 重组质粒 PCR 鉴定 PCR 扩增产物大小约为 500bp, 与预计大小相一致 ( 图 4), 证实 sirna 表达单元成功插入于 MluⅠ 酶切位点

5 82 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.28No bp, 与预计大小一致 ; 大片段与载体双酶切片断大小一致 测序结果证实插入序列与 AE 基因完全一致 图 3 重组质粒 pvax siegf PVAE IL 12 酶切电泳图 Fig.3 AnalysisofrecombinantplasmidspVAX siegfp PVAE IL 12byenzymedigestion M:1kbDNALadder;1:pVAX PVAE IL 12digestedwithMluⅠ; 2:pVAX siegfp 1 PVAE IL 12digestedwithMluⅠ; 3:pVAX siegfp 2 PVAE IL 12digestedwithMluⅠ; 4:pVAX PVAE IL 12;5:pVAX siegfp 1 PVAE IL 12 图 5 AE 基因获得 Fig.5 AbtaintionofAEgene M:DNAmarker;1:PCRproduct 2.4 重组质粒 pvax sirna/siegfp PVAE EGFP IL 12 的酶切鉴定 将 pvax sirna/siegfp PVAE IL 12 质粒用 Nhe I PmeI 双酶切, 酶切后大片段大小约为 6600bp, 小片段大小为 1383bp pcdna6 AE EGFP 质粒上的 PVAE 抗原 EGFP 融合基因用 NheI PmeI 双酶切, 连接后以实现 hil 12 与 PVAE 抗原 -EGFP 的共质粒表达 将筛选得到的重组质粒用 NheI PmeI 双酶切鉴定, 切下的小片段约为 2120bp 左右, 与 PVAE 抗原 EGFP 融合基因的大小一致, 大片段大小约为 6600bp, 与上述片段大小一致 ( 图 6) 质粒命名为 pvax sirna/siegfp PVAE EGFP hil12 图 4 重组质粒 pvax siegfp PVAE IL 12PCR 鉴定 Fig.4 PCRanalysisofrecombinantplasmid pvax siegfp PVAE IL 12 M:MarkerDGL2000;1,2:PCRproductsoftheplasmid pvax siegfp 1 PVAE IL 12;3,4:PCRproductsoftheplasmid pvax siegfp 2 PVAE IL 三元重组质粒测序结果以引物 Pvm Left 测序重组质粒的 sirna 插入序列与目标序列完全一致, 证实三元重组质粒构建成功 2.3 重组质粒 pcdna6 AE EGFP 的构建以 pvax1 PVAE hil12 为模板,PCR 法扩增去终止密码子的 PVAE 融合抗原基因, 获得 1383bp 的目的片段, 用 EcoRI 和 KpnI 双酶切 PCR 产物得到 1371bp 片段 ( 图 5) 同时, 用 EcoRI 和 KpnI 双酶切 pcdna6 EGFP 载体, 得到线性 5kb 多片段 再将 1371bp 片段与 5kb 多的载体片段连接, 筛选重组质粒命名为 pcdna6 AE EGFP 将筛选得到的重组质粒用 NheI PmeI 双酶切, 可以切成两个片段, 小片段大小约为 图 6 重组质粒 pvax sirna /siegfp PVAE EGFP IL 12 的酶切鉴定 Fig.6 PlasmidpVAX sirna /siegfp PVAE EGFP IL 12digestedbyenzyme M:1kbmarker;1:pVAX sirna PVAE IL 12digestedwithNheIand PmeI;2:pVAX siegfp PVAE IL 12digestedwithNheIandPmeI; 3:pVAX sirna PVAE IL 12;4:pVAX sirna PVAE EGFP IL 12; 5:pVAX siegfp PVAE EGFP IL 12digestedwithNheIandPmeI; 6:pVAX sirna PVAE EGFP IL 12digestedwithNheIandPmeI

6 2008,28(7) 马爱丽等 : 三重表达肺结核 DNA 疫苗在细胞水平的检测 83 最终构建成功的共表达的 pvax sirna/siegfp PVAE EGFP IL 12 真核载体长为 8.7kb,siRNA/siEGFP 抗原基因 hil 12 基因分别带有自己一套完整的表达单位, 重组载体的物理图谱如图 7 示 图 7 重组质粒的物理图谱 Fig.7 Physicalmapofrecombinantplasmid (a)pvax1(b)pvax sirna/siegfp PVAE EGFP IL 12 图 8 pvax sirna PVAE EGFP IL 12 pcdna6 EGFP pvax1 质粒转染 293 细胞的荧光照片 Fig.8 Fluorescencemicroscopeanalysisoftransfected293celswithplasmidsof pvax sirna PVAE EGFP IL 12 pvax1 pcdna6 EGFP A1,A2,A3:293celstransfectedwithpVAX sirna PVAE EGFP IL 12; B1,B2,B3:293celstransfectedwithpcDNA6 EGFP;C1,C2,C3:293celstransfectedwithpVAX1

7 84 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.28No 融合 EGFP 的抗原表达 重组质粒 pvax1 sirna PVAE EGFP hil12 瞬时转染 293 细胞 48h 后置于倒置荧光显微镜下观察, 可见有大量荧光 ( 图 8) 同时空载体 pvax1 转染组未检测到荧光表达, 并且在 400 倍镜下, 该组发出的荧光与 pcdna6 EGFP 对照组的荧光有明显不同 前者的荧光环绕分布在细胞膜及其周质附近, 这可能是由于抗原基因带有信号肽, 可使表达产物分泌至胞外的缘故 而后者荧光集中在包内 可知融合 EGFP 的多表位抗原在细胞中成功表达 2.6 siegfp 的表达用脂质体法将重组质粒 pvax siegfp PVAE EGFP IL 12 以及对照组质粒转染 293 细胞, 收集 48h 转染细胞, 置于荧光显微镜下观察 ( 图 9) 可见 pvax sirna PVAE EGFP IL 12 质粒组均有大量荧光, 而 pvax siegfp PVAE EGFP IL 12 质粒组荧光很少, 靶向 EGFP 的 sirna 可明显抑制 EGFP 的表达,pVAX1 质粒组未检测到荧光 证实三重表达载体上的 siegfp 表达单元可以正常表达并介导 RNAi 效应 即三重表达结核 DNA 疫苗表达载体 pvax sirna PVAE EGFP IL 12 中 sirna 单元可以正常启动转录并介导 RNAi 效应, 而不受抗原 IL 12 存在的影响 2.7 ELISA 测定 hil 12 的表达收集 24h 48h 72h 细胞培养上清, 进行 ELISA 检测, 并做量化分析 经绘制 hil 12 标准曲线, 计算得到转染后 48hIL 12 的检出量为 pg/ml 细胞上清 ;72h 检出量为 pg/ml 细胞上清 空质粒转染组细胞未检测到 hil 12 的分泌 结果见表 1 表 1 ELISA 测定结果 (n=5,x±s) Table1 ELISAresultofhIL 12 Groups A450nmvalue 24h 48h 72h pvax ± ± ±0.002 pvax1 AE EGFP hil ± ± ±0.030 p<0.01,vspvax1group 3 讨论 DNA 疫苗作为继蛋白质疫苗之后的第三代疫苗, 能刺激机体产生较全面的免疫反应, 持续时间长, 和第一代疫苗 ( 减毒 灭活疫苗 ) 及第二代疫苗 ( 亚单位疫苗 ) 相比, 具有明显的优势 [5] 基因疫苗制备简单, 又可持续诱导体液及细胞免疫应答, 已成为结核病疫苗 图 9 pvax sirna PVAE EGFP IL 12 pvax siegfp PVAE EGFP IL 12 pvax1 质粒转染 293 细胞的荧光照片 Fig.9 Fluorescencemicroscopeanalysisoftransfected 293celswithplasmidsofpVAX sirna PVAE EGFP IL 12 pvax1 pvax siegfp PVAE EGFP IL 12 A1,A2,A3:293celstransfectedwithpVAX sirna PVAE EGFP IL 12;B1,B2,B3:293celstransfectedwithpVAX siegfp PVAE EGFP IL 12;C1:293celstransfectedwithpVAX1 研究的热点之一 如何选择 DNA 疫苗的抗原基因是这项疫苗技术的关键 由于在结核病亚单位疫苗中积累的大量经验, 证明结核杆菌在体外培养早期分泌的蛋白质是主要的抗结核保护性原 结核分枝杆菌培养滤液中包含大约 200 种蛋白 在小鼠模型中, 均能够表现出不同的保护作用, 若与强烈的 Th1 细胞反应诱导佐剂联合应用效果更明显 主要包括 Ag85 家族 MPT32 MPT51 MPT64 GroES ESAT 6 DnaK 和 GlnA, 其中 Ag85 和 ESAT 的保护力最强 [6] [7] Langermans 等研究的基于 ESAT 6/Ag85B 两个抗原的融合蛋白疫苗, 此疫苗已经在动物模型中证明了其保护效力 [8,9]

8 2008,28(7) 马爱丽等 : 三重表达肺结核 DNA 疫苗在细胞水平的检测 85 一个有效的 TB 疫苗应该能够诱导长期持续的 Th1 介导的免疫反应 [10] 为了增强 DNA 疫苗的免疫原性, 细胞因子被用作 DNA 疫苗的有效基因佐剂 白细胞介素 12(IL 12) 具有诱导 Th1 细胞发育和增值, 活化 T 细胞, 增加 T 细胞和 NK 细胞杀伤能力, 促进 APC 功能, 诱导 IFN γ 等细胞因子的分泌等功能, 是诱生 CTL 免疫应答的最佳细胞因子 [11] IL 12 与各种基因疫苗联合应用, 可发挥其良好的分子佐剂效应, 调节机体免疫应答向着具有保护性的 Th1 型免疫应答发展, 预防各种病原体尤其是胞内病原体感染 hil 12 是目前发现的对体内免疫活性细胞诱导和调节作用最强 应用范围最广的细胞因子, 在肿瘤 病毒性疾病及自身免疫性疾病中起重要作用 在控制结核分枝杆菌的感染中具有重要的作用 由于 IL 12 是由两个亚基 (p40 和 p35) 组成的异二聚体,P40 的过度表达可能抑制 IL 12 的生物学活性 [12,13] 为使 p35 和 p40 在体内等量表达, 避免发生免疫抑制, 我们将带 CMV 启动子的完整 [14] hil 12 表达单元克隆进质粒空白区域 李晖等构建的 Mtb8.4/hIL 12 嵌合基因疫苗免疫小鼠, 作用较 BCG 和 Mtb8.4 基因疫苗强 sirna(smalinterferingrna) 技术是近年来迅速发展的一项基因沉默技术, 它是通过向生物体内注入或者由质粒 病毒等载体引入 dsrna(doublestranded DNA), 高效特异地抑制靶的基因的表达, 从而导致该基因沉默 它主要应用在肿瘤 癌症 病毒感染等疾病的治疗中, 用于治疗原核生物引起的传染病还未见报道, 但是随着结核病致病机制的阐明和分子免疫学 基因工程及生物信息学等多学科的相互协作, 对结核的致病过程进行有目的的干预 ( 如改变巨噬细胞的摄取方式 诱导巨噬细胞的凋亡 对细胞因子的调节等 ), 已经成为人类战胜结核病的一个新思路 在 DNA 疫苗的构建方面, 抗原基因和佐剂基因分别构建在不同的载体上, 共同转染靶细胞, 虽可自由调节各表达载体间的比例, 但转染效率较低 而在同一载体上构建含多个基因的共表达载体则可提高转染及表达的效率, 并且能够更有效地增强抗原递呈, 发挥 hil 12 的佐剂效应 虽然目前已有很多的候选疫苗已经陆续进入了临床试验, 但是距离真正成为能够广泛应用的疫苗还有很长的路要走 研究构建了基于 pvax1 载体的肺结核融合抗原基因和人源 IL 12 共载体表达的 DNA 疫苗, 分别以各自的 CMV 启动子启动表达, 经酶切 测序 鉴定, 该 DNA 疫苗构建成功, 转染 293 细胞后抗原基因和 hil 12 都得到了成功表达 同时, 将体内表达 sirna 整合到质粒中, 以抑制细胞凋亡负调因子 Mcl 1 为靶标 本文报道三重表达质粒的构建, 并在细胞水平证实同一质粒骨架中三个表达单元互不干扰地分别高效表达 在后续的研究中, 将检测该 DNA 疫苗在动物模型体内的免疫应答和抗结核分枝杆菌免疫保护的效果 参考文献 [1] BrewerT F, ColditzG A. Relationship between Bacile Calmete Gu erin(bcg)strainsandtheeficacyofbcg vaccineinthepreventionoftuberculosis.clininfectdis, 1995,20(1):126~135 [2]FinePE.VariationinprotectionbyBCG:implicationsofand forheterologousimmunity.lancet,1995,346(8986):1339~ 1345 [3] 程春明, 曹以诚, 杜正平, 等. 结核分枝杆菌融合抗原 Ag85B ESAT6 真核表达载体的构建及鉴定. 河南工业大学学报 ( 自然科学版 ),2006,27(3):29~31 ChengC M,CaoY C,DuZP,etal.JournalofHenan UniversityofTechnology(NaturalScienceEdition),2006,27 (3):29~31 [4]LiXJ,CaoYC.ConstructionofaNovelEukaryoticExpresion Plasmid pcdna6/myc his EGFP Band Its Applications in Expresion ofrecombinantgenes. China Biotechnology, 2006,26(12):22~28 [5] HelenLC,StefanH E.Prospectsforbetertuberculosis vaccines.thelancetinfectiousdiseases,2001,1:21~28 [6]AndersenP. TB vaccines: progresand problems. Trends Immunol,2001,22(3):160~168 [7] LangermansJA, DohertyT M, Vervenne R A, etal. Protection ofmacaquesagainstmycobacterium tuberculosis infectionbyasubunitvaccinebasedonafusionproteinof antigen85bandesat 6.Vaccine,2005,23(21):2740~ 2750 [8]OlsenAW,WiliamsA,OkkelsLM,etal.Protectiveefectof atuberculosissubunitvaccinebasedonafusionofantigen85b andesat 6intheaerosolguineapigmodel.InfectImmun, 2004,72:6148~6150 [9]DohertyTM,OlsenAW,WeischenfeldtJ,etal.Comparative analysisofdiferentvaccine constructs expresing defined antigensfrommycobacteriumtuberculosis.jinfectdis,2004, 190:2146~2153 [10]DohertyTM,AndersenP.Vaccinesfortuberculosis:novel

9 86 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.28No conceptsandrecentprogres.clinmicrorev,2005,18:687 ~702 [11] 杨家和, 钱其军, 吴孟超, 等. 白介素 12: 重要的免疫调节因子. 世界华人消化杂志,1999,7(1):71~72 YangJH,QiangQJ,WuMC,etal.WorldChineseJournal ofdigestology,1999,7(1)71~72 [12]HanlonL,ArgyleD,BainD,etal.Felineleukemiavirus DNAvaccineeficacyisenhancedbycoadministrationwithIn terleukin 12(IL 12)andIL 18expresionvectors.JVirol, 2001,75(18):8424 ~8433 [13]SykesKF,LewisMG,SquiresB,etal.EvaluationofSIV libraryvaccineswithgeneticcytokinesinamacaquechalenge. Vaccine,2002,20(17/18):2382~2395 [14] 李晖, 李榕, 钟森, 等. 结核病 Mtb8.4 hil 12 嵌合基因疫苗免疫保护效果研究. 免疫学杂志,2007,23(2):139~143 LiH,LiR,ZhongS,etal.TheJournalofImmunology, 2007,23(2):139~143 TheDetectionofTripleExpresionofTuberculosis DNAVaccinesontheCelLevel MAAi li CAOYi cheng ZHANGZhen wu (SchoolofBioscienceandBioengineering,SouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou ,China) Abstract Objective:AnoveltuberculosisDNAvaccineintegratingsiRNA,fusionalantigenandhIL?12 tripleexpresionunitswasconstructedinourlaboratory.methods:toevaluatetheindependentexpresionofthe threeexpresionunits,twoeukaryoticexpresionplasmidpvax1?sirna?pvae[egfp]?hil12withtbfusional geneag85b?esat6(pvae)andenhancedgreenfluorescentprotein(egfp),andpvax1?siegfp?pvae [EGFP]?hIL12withsiRNA codingsequencetargetingegfpinsteadofmcl?1lwereconstructed.thentwo plasmidswereused totransferhuman embryonickidney293 cels. Based on EGFP reportgene, itwas demonstratedthatsirnaexpresionunitandfusionalantigengenewereindependentlyexpresed.results:the hil12expresionat48hand72hposttransfectionwerealsodetectedbyelisaanalysisupto pg/mland pg/mlrespectivelyinthecelculturefluid.Conclusion:TheresultsdemonstratedthatthenovelDNA vaccinewithsirna,tb fusionalantigenandhil12 threeexpresionunitsinthesameplasmidframeis succesfulyconstructedandindependentlyexpresedineukaryoticcels.itlaidafoundationforfurtheranimal modelstudyonanti?tuberculosisefectsofthisnoveldnavaccine. Keywords Tuberculosis DNAvaccine sirna Fusionalantigen hil?12

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