2 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.27No.2007 PCR 引物, 并在上 下游引物 5 端分别引入 MluI 和 KpnI 酶切位点, 具体序列如下 : 上游引物 :5?CGACGCGTGAATTCCATCACACAA AGGTAAC?3 下游引物 :5?GGG

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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2007,27():~5 人 CD46 启动子真核表达载体的构建 李国才,2 王劲松 焦红梅 朱立天 潘兴元 季明春 ( 扬州大学医学院扬州 格斯生物医药有限公司上海 20203) 摘要为了构建人 CD46(hCD46) 启动子指导目的基因表达的真核表达载体, 提取 HeLa 细胞基因组 DNA, 用 PCR 扩增出 hcd46 基因的启动子区域, 序列分析结果表明其与 GenBank 中 hcd46 基因 5 端某片段的同源性为 99.9% 用此启动子替换 pcdna3egfp 中的 CMV 启动子, 并在 hcd46 启动子和 EGFP 基因之间插入兔 β? 球蛋白基因第二内含子 (RGI), 得到的重组表达载体转染 CHO 和 SP2/0 两种鼠源细胞, 流式细胞术检测表明 CHO 细胞 EGFP 的表达量高于 SP2/0 细胞, 表达特性与人体 CD46 相似 ;RGI 可以增强 EGFP 的表达量, 但不改变其表达的组织特异性, 提示克隆的 hcd46 启动子可以用于研制模拟人体 CD46 基因表达特性的转基因小鼠 关键词 hcd46 启动子真核表达载体 EGFP 中图分类号 Q782 hcd46 又称补体系统膜辅助蛋白 (complement systemmembranecofactorprotein,mcp), 属于补体激活蛋白调节因子家族的成员, 通过与血浆中丝氨酸蛋白酶因子 Ⅰ 发挥协同作用降解 C3b 与 C4b, 保护自身细胞免遭补体的攻击 [] hcd46 分布甚广, 在人体所有有核细胞中均可表达, 但不同类型的细胞其表达量有所差异 [2~6] 近来发现 hcd46 是几种病原体 ( 如麻疹病毒 [7] 化脓性链球菌 [8] 人疱疹病毒?6 型 [9] 奈瑟 [0] 菌等 ) 的受体, 介导相应病原体的感染 麻疹病毒 人疱疹病毒?6 型和奈瑟菌等以人为唯一自然宿主, 研究这些病原体的感染缺乏有效的实验动物模型 [] Blixenkrone?Moler 等发现麻疹病毒可以感染从 hcd46 转基因小鼠分离的肾和肺细胞, 并导致细胞融 [2] 合 Johanson 等证明 hcd46 转基因小鼠对脑膜炎奈瑟菌具有易感性 淋病奈瑟菌与脑膜炎奈瑟菌属于同一菌属, 二者黏附因子基本相同 [3], 提示 hcd46 转基因小鼠也可用作研究淋病奈瑟菌感染的有效模型, 然而目前还没有相关研究报道 上述转基因小鼠是利用约 400kb 的 hcd46 全基因制备的 [4], 因基因构件大而容易断裂, 而且 DNA 溶液粘稠, 难以进行显微注收稿日期 : 修回日期 : 江苏省自然科学基金资助项目 (BK ), 江苏省高校自然科学基金资助项目 (07KJD30244) 通讯作者, 电子信箱 :gcli@yzu.edu.cn;mcji@yzu.edu.cn 射操作 本研究克隆了 hcd46 启动子, 并利用 RGI 提高了其启动效率, 为研制模拟人体表达特性的 hcd46 转基因小鼠奠定了基础 材料和方法. 质粒 菌株和细胞 pmd8?t 载体购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司 ; 真核表达载体 pcdna3egfp 为本室构建和保存 ; 含 RGI 的载体 psg5 由美国华盛顿大学 JohnP.Atkinson 教授馈赠 ; 大肠杆菌 (E.coli)DH5α 中国仓鼠卵巢细胞 CHO 小鼠骨髓瘤细胞 SP2/0 由本室保存.2 试剂 LA Tag DNA Polymerase Agarose Gel DNA PurificationKit 限制性内切酶和 T4DNA 连接酶购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司 ;25kDa 多聚乙酰亚胺 (polyethylenimine,pei) 胰蛋白酶购自 Sigma 公司 ; 蛋白酶 K 为 Amresco 公司产品 ; 抗生素 G48 为 Promega 公司产品 ; 培养基 DMEM 和 RPMI640 为 GibcoBRL 公司产品 ; 小牛血清为杭州四季青公司产品 ;PCR 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成 ; 其它为国产分析纯.3 PCR 扩增根据发表的 hcd46 启动子序列 (S65879) [6] 设计

2 2 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.27No.2007 PCR 引物, 并在上 下游引物 5 端分别引入 MluI 和 KpnI 酶切位点, 具体序列如下 : 上游引物 :5?CGACGCGTGAATTCCATCACACAA AGGTAAC?3 下游引物 :5?GGGGTACCGCATCGGAGAAGGAGT ACAG?3 提取 HeLa 细胞基因组 DNA 为模板, 用高保真 PCR 扩增 hcd46 启动子 50μlPCR 反应体系包括 :5 μl0 缓冲液,300μmol/LdNTPs,.2mmol/LMg 2+, 200nmol/L 上 下游引物,2μgHeLa 细胞基因组 DNA 和 8ULATagDNAPolymerase 30 次循环的 PCR 程序为 94 /50s( 第一次循环为 5min),52 /40s,72 / 2min( 最后一次循环为 0min) PCR 产物经 0.8% 琼脂糖凝胶电泳, 用 AgaroseGel DNAPurificationKit 回收后, 将目的片段插入 pmd8?t 载体, 重组载体命名为 pmd8?cdp.4 序列测定与分析对重组质粒进行限制性酶切分析, 插入片段大小正确的重组质粒由宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司进行序列测定 所获序列用 DNAStar 软件进行分析和拼接, 并用 BLAST 程序与 GenBank 中已发表的 hcd46 基因序列进行比较.5 重组真核表达载体的构建用限制性内切酶 MluI 和 KpnI 从 pmd8?cdp 将 hcd46 启动子切出, 并用以替换 pcdna3egfp 中相同酶切位点间的 CMV 启动子, 构建重组质粒 pcdpegfp 根据发表的 RGI 序列设计 PCR 引物, 并在上 下游 5 端分别引入 KpnI 酶切位点 引物序列如下 : 上游引物 :5?GGGGTACCGATCCTGAGAACTTCA GGGTG?3 下游引物 :5?GGGGTACCCTTTGCCAAAATGATG AGACAG?3 以含 RGI 的 psg5 载体为模板进行扩增 50μl 的扩增体系包括 :5μl0 缓冲液,300μmol/LdNTPs,.2mmol/LMg 2+,200nmol/L 上 下游引物,0.μg psg5dna 和 8ULATagDNAPolymerase 30 次循环的 PCR 程序为 94 /30s( 第一次循环为 5min),57 /30 s,72 /45s( 最后一次循环为 0min) PCR 产物用 Kpn I 酶切并纯化后, 插入到 pcdpegfp 的相同酶切位点, 用 hcd46 基因启动子的上游引物和 RGI 的下游引物进行 PCR 鉴定目的片段的插入方向, 构建重组质粒 pcdpegfp?rgi.6 细胞表达试验按标准的 PEG 沉淀法制备和纯化重组真核表达载体 pcdpegfp 和 pcdpegfp?rgi 分别将 CHO 细胞和 SP2/0 细胞转移到 96 孔板, 待细胞生长达到对数期, 且密度为 70% 时, 每孔用 300ngPEI 包裹的重组质粒 ( μgdna/2μgpei) 进行转染,4h 后换液,72h 后在培养基中加入终浓度为 800μg/ml 的 G48 以筛选稳定转染目的基因的细胞 然后通过流式细胞仪检测不同质粒转染细胞中 EGFP 的表达量 共分 3 组 : 未转染质粒的空白细胞 ; 转染 pcdpegfp 的细胞 ; 转染 pcdpegfp?rgi 的细胞 2 结果 2. hcd46 启动子的克隆琼脂糖凝胶电泳分析表明, 从 HeLa 细胞基因组 DNA 中扩增出大小约为.5kb 的特异性条带 ( 图 ), 与预计大小相符 图 hcd46 启动子 PCR 产物的凝胶电泳分析 M:250bpDNAmarker;:hCD46 启动子 Fig. PCRproductofhCD46promoter PCR 产物插入 pmd8?t 载体后测序, 序列分析结果表明, 克隆的 hcd46 启动子与 GenBank 中发表的序列 (S65879) [6] 同源性为 97.2%, 二者间有 2 处共 43 个碱基出现差异 但是, 克隆的 hcd46 启动子序列与人类基因组中 hcd46 基因 5 端某片段 (NT_ Hs_22033) 仅 2 个碱基的差异, 同源性达到 99.9% 克隆的 hcd46 启动子序列已被 GenBank 收录, 收录号为 :DQ 重组载体 pcdpegfp 和 pcdpegfp?rgi 的构建用 KpnI 和 MluI 将克隆的 hcd46 启动子从 pmd8? CDP 中切下, 替换 pcdna3egfp 中相同酶切位点间的 CMV 启动子, 重组载体命名为 pcdpegfp( 图 2) 以 psg5 载体为模板用 PCR 扩增出 RGI( 图 3) 扩增产物经 KpnI 酶切后连接入 pcdpegfp 中的相同酶切位点, 得到重组载体 pcdpegfp?rgi( 图 2) 利用 CD46 启动子的上游引物和 RGI 的下游引物进行 PCR,

3 2007,27() 李国才等 : 人 CD46 启动子真核表达载体的构建 3 3 讨论 图 2 hcd46 真核表达载体结构示意图 (a)pcdpegfp(b)pcdpegfp?rgi Fig.2 StructuresofhumanCD46promoterdriven eukaryoticexpresionvectors 扩增出约 2.kb 的 DNA 片段 (CDP+RGI), 表明 RGI 为正向插入 图 3 兔 β- 球蛋白第二内含子的 PCR 扩增 M:250bpDNAmarker;: 兔 β? 球蛋白第二内含子 RGI Fig.3 AmplificationofRGIbyusingPCR 2.3 hcd46 启动子的启动特性 pcdpegfp 和 pcdpegfp?rgi 分别转染 CHO 和 SP2/0 细胞, 经 G48 筛选获得稳定的基因转染细胞, 用流式细胞仪检测 EGFP 的表达 ( 图 4 表 ) 结果表明, 克隆的 hcd46 启动子可以驱动 EGFP 基因在转染细胞中有效表达 但是不同组织来源的细胞转染后表达效率有所差别, 在生殖道来源的 CHO 细胞中表达效率明显高于骨髓来源的 SP2/0 细胞 另外, 在转染的两种细胞中, 均可看到 RGI 增强了目的基因的表达量, 但是没有改变 hcd46 启动子的组织特异性启动特性 表 流式细胞仪检测基因转染后 EGFP 表达细胞的比例 a) (%) Table ThepercentageofEGFPexpresingcelsin CHO andsp2/0celstransfectedwithpcdpegfp andpcdpegfp?rgi,respectively 未转染转染 pcdpegfp 转染 pcdpegfp?rgi CHO 细胞 SP2/0 细胞 a) 表中数据为 3 次实验 每次实验 3~4 个重复孔的均值 hcd46 为单链穿膜糖蛋白, 细胞分布甚广, 包括粒细胞 血小板 T 细胞 (Th Ts Tc) B 细胞 NK 细胞 造血细胞系 成纤维细胞 表皮细胞 内皮细胞及星状胶质细胞等 [2~6] 但不同类型的细胞上表达的数量有所不同, 外周血单个核细胞和粒细胞为 万个 / 细胞, 造血细胞系为 2~5 万个 / 细胞,HeLa 和 Hep?2 细胞分别为 0 万个 / 细胞和 25 万个 / 细胞 表明 hcd46 基因启动子具有组织特异性启动的特性 制备表达特性与人类相似的 CD46 转基因小鼠可为研制以 hcd46 为受体的多种病原体感染的实验动物模型开辟新的方向 为此, 本文克隆了 hcd46 启动子, 但其序列与 GenBank 中发表的该区原始序列 (S65879) [6] 具有一定的出入, 原因可能是原始序列的 [6] 测序结果有误差 Cui 等发表此 hcd46 基因启动子原始序列的年代是 993 年, 限于当时的技术, 测序结果很有可能不是非常精确 实际上, 将自行克隆的 hcd46 基因启动子序列与人类基因组计划结果进行比较, 发现与其中 hcd46 基因 5 端某个片段 (NT_ Hs_22033) 的同源性就达到 99.9%,54 个碱基中只有 2 个有差异 这可能是由于本研究与人类基因组计划中所用模板不同造成的, 也可能是 PCR 扩增过程中产生的随机差错 利用克隆的 hcd46 启动子指导 EGFP 基因在 CHO 细胞和 SP2/0 细胞中表达, 结果显示其启动效率在 CHO 细胞中高于 SP2/0 细胞, 初步说明克隆的 hcd46 基因启动子的启动功能具有本来的组织细胞特异性 [2~6] 利用 cdna 基因构建转基因小鼠, 其表达水平往往比完全基因的低 cdna 基因中缺少许多调控序列, 如内含子, 尤其是第一内含子, 往往是一些增强子, 可以提高基因的表达量 [5] 我们用克隆的 hcd46 基因启动子分别指导 hcd46cdna 基因在 CHO 和 COS? 细胞中进行了表达, 结果也显示, 目的蛋白表达水平比人体同类组织细胞中的低 因此, 为了在转基因小鼠体内提高目的蛋白的表达水平, 我们在重组表达载体中插入了 RGI 该内含子是从 psg5 载体中扩增出来的 psg5 是一个商品化的常用表达载体, 其中用于增强目的基因表达的调控序列即是 RGI 重组表达载体 pcdpegpf 和 pcdpegpf?rgi 的细胞表达实验结果显示,RGI 增强了报告基因在相应细胞中的表达水平, 但是没有改变 hcd46 启动子的组织特异性 这些实验结

4 4 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.27No.2007 图 4 重组表达载体转染细胞的流式细胞仪检测 A: 正常 CHO 细胞 ;B:pCDPEGFP 转染的 CHO 细胞 ;C:pCDPEGFP?RGI 转染的 CHO 细胞 ;D: 正常 SP2/0 细胞 ; E:pCDPEGFP 转染的 SP2/0 细胞 ;F:pCDPEGFP?RGI 转染的 SP2/0 细胞 Fig.4 DetectionoftheEGFPexpresionintransfectedcellinesbyusingFACS 果表明, 本研究成功构建了 hcd46 启动子指导目的基因表达的真核表达载体, 为研制模拟人体 CD46 基因表达特性的转基因小鼠奠定了基础 参考文献 []Riley?VargasRC,GilDB,KemperC,etal.CD46:expanding beyondcomplementregulation.trendsimmunol,2004,25(9): 496~503 [2]LiszewskiM K,PostTW,AtkinsonJP.Membranecofactor protein(mcporcd46):newestmemberoftheregulatorsof complementactivationgenecluster.annrevimmunol,99,9: 43~455 [3]Gordon D L,Sadlon T A,Weselingh S L,etal.Human astrocytesexpres membrane cofactorprotein (CD46),a regulatorofcomplementactivation.jneuroimmunol,992,36 (2~3):99~208 [4]SeyaT,HaraT,MatsumotoM,etal.Quantitativeanalysisof membranecofactor protein (MCP) ofcomplement.high expresionofmcponhumanleukemiacellines,whichisdown?regulatedduringceldiferentiation.jimmunol,990,45 ():238~245 [5]ChoSW,OglesbyTJ,HsiBL,etal.Characterizationofthree monoclonalantibodiestomembraneco?factorprotein(mcp)of the complement system and quantification of MCP by radioasay.clinexpimmunol,99,83(2):257~26 [6]CuiW Y,HourcadeD,PostT,etal.Characterizationofthe promoterregionofthemembranecofactorprotein(cd46)gene ofthehumancomplementsystemandcomparisontoamembrane cofactorprotein?likegeneticelement.jimmunol,993,5 (8):437~446 [7] NanicheD,Varior?Krishnan G,CervoniF,etal.Human membranecofactorprotein(cd46)actsasacelularreceptor formeaslesvirus.jvirol,993,67(0):6025~6032 [8]OkadaN,LiszewskiMK,AtkinsonJP,etal.Membranecofactor protein(cd46)isakeratinocytereceptorforthem proteinof thegroupastreptococcus.procnatlacadsciusa,995,92 (7):2489~2493 [9]SantoroF,KennedyPE,LocateliG,etal.CD46isacelular receptorforhumanherpesvirus6.cel,999,99(7):87~827 [0]Kalstrom H,LiszewskiM K,AtkinsonJP,etal.Membrane cofactorprotein(mcporcd46)isacelularpilusreceptorfor pathogenicneiseria.molmicrobiol,997,25(4):639~647 []Blixenkrone?MolerM,BernardA,BencsikA,etal.Roleof CD46inmeaslesvirusinfection in CD46 transgenicmice. Virology,998,249(2):238~248 [2] Johanson L,Rytkonen A,Bergman P,etal.CD46 in meningococcaldisease.science,2003,30(563):373~375 [3]GilDB,AtkinsonJP.CD46inNeiseriapathogenesis.Trends MolMed,2004,0(9):459~465 [4]KemperC,LeungM,StephensenCB,etal.Membranecofactor protein(mcp;cd46)expresionintransgenicmice.clinexp Immunol,200,24(2):80~89 [5]LiHW,GaoYX,RaizadaM K,etal.Intronicenhancementof angiotensin Itype2receptortransgeneexpresioninvitroand invivo.biochembiophysrescommun,2005,336():29~35

5 2007,27() 李国才等 : 人 CD46 启动子真核表达载体的构建 5 ConstructionofEukaryoticExpresionVectorsbyUse ofhumancd46promoter LIGuo?cai WANGJin?song,2 JIAOHong?mei ZHULi?tian PANXing?yuan JIMing?chun (YangzhouUnversityColegeofMedicine,Yangzhou 22500,China 2GesiBio?MedCo.,Ltd,Shanghai 20203,China) Abstract ToconstructeukaryoticexpresionvectorsthatutilizehumanCD46promotertodriveexpresion ofgenes,hcd46promoterwasamplifiedbypcr usinggenomicdna from HeLacelsastemplate.ThePCR productof.5kbwassubclonedintopmd8?tvectorandsubmitedtosequenceanalysis.nucleotidesequence alignmentshowedthattheself?clonedhcd46promoterwas99.9% homologouswithadnafragmentfromthe5 endofhcd46genepublishedin2006,diferingonlyin2nucleotides.thehcd46promoterwasusedtoreplace thecmvearlypromoterinpcdna3egfp;andtherabbitβ?globulingeneintron2(rgi)wasinsertedbetween hcd46promoterandegfpgeneinordertoenhancetheexpresionlevelofthegeneofinterest.therecombinant expresionvectors,pcdpegfpandpcdpegfp?rgi,weretransfectedintochoandsp2/0cels,respectively. DetectionbyFACSrevealedthattheexpresionlevelofEGFPintransfectedCHOcelswashigherthanthatin transfectedsp2/0cels,similarlytotheexpresionpropertyofhcd46invivoinhuman.rgicouldenhancethe expresionlevelofegfpineachcellinewithoutalteringthecelline?specificexpresioncharacterization.these dataindicatethattheeukaryoticexpresionvectorscontaininghumancd46promotercouldbesuitableforthe developmentoftransgenicmicethatmimictheexpresionpropertiesofhcd46. Keywords hcd46promoter Eukaryoticexpresionvector EGFP 中国兴奋剂检测中心与赛默飞世尔科技开展合作 2007 年 0 月 9 日世界领先的赛默飞世尔科技 ( 原热电公司 ) 与中国兴奋剂检测中心在北京签署 2008 年奥运会兴奋剂检测项目合作计划书 协议确定了赛默飞世尔参与和支持 2008 年奥运会兴奋剂检测的仪器和技术服务, 以保证奥运会期间兴奋剂的检测任务的完成 中国兴奋剂检测中心承担了 2008 年奥运会兴奋剂检测主要任务, 先后购买了赛默飞世尔科技的 DFSGC/MS 高分辨磁式气相色谱质谱联用仪等多台高端质谱系统 同时, 为实现 2008 北京奥运会期间兴奋剂检测高标准要求, 赛默飞世尔科技将特别为国家兴奋剂检测中心免费提供两套 DFSGC/MS 高分辨磁式气相色谱和质谱联用仪, 一套 DeltaVGC/C/IRMS 同位素质谱系统和四套三重四级杆液质联用系统, 以应对数以千计复杂而多样的样品 2008 年奥运期间, 赛默飞世尔科技承诺 : 维修工程师及应用工程师将 24 小时待命, 确保仪器和应用的顺利运作, 全力以赴志愿为兴奋剂检测中心工作 届时, 所有的运动员从入住奥运村到离开, 其尿样和血样都将通过国际奥委会 (IOC) 反兴奋剂规定的禁止使用药物的分析 更多信息请登录

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