中国生物工程杂志!!"# 转豇豆胰蛋白酶 基因棉花检测用 标准分子的制备 王旭静 董 雷 苗猛猛 唐巧玲 王志兴 中国农业科学院生物技术研究所 北京! 摘要 利用 ( 的方法克隆豇豆胰蛋白酶基因 基因表达调控元件 ") 启动子 *+) 终止子以及棉花内标基因 ), 连接到克隆载体上 构建成质粒标准分

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1 中国生物工程杂志!!"# 转豇豆胰蛋白酶 基因棉花检测用 标准分子的制备 王旭静 董 雷 苗猛猛 唐巧玲 王志兴 中国农业科学院生物技术研究所 北京! 摘要 利用 ( 的方法克隆豇豆胰蛋白酶基因 基因表达调控元件 ") 启动子 *+) 终止子以及棉花内标基因 ), 连接到克隆载体上 构建成质粒标准分子 -. ( 检测过程中 质粒标准分子和转基因棉花中能扩增出 / 个目的条带 而非转基因棉花中不能扩增出相应的条带 证明构建好的质粒标准分子能用于转基因棉花的定性检测 荧光定量 ( 绘制 / 个目的基因片段的标准曲线 各标准曲线的相关系数均达到 0#!" 以上 说明建立的 ( 具有很好的 $ 初始浓度相关性 达到定量分析的需求 而且荧光定量 ( 反应具有很好的重复性和稳定性 可用于实际样品的定量检测 关键词 标准分子 转基因棉花 定性检测 定量检测中图分类号 1!# 随着转基因技术的飞速发展 越来越多的转基因产品问世并大规模商业化应用 世界各国都在完善对转基因产品的安全监管 核酸检测是对转基因产品进行安全监管的有效方法之一 在核酸检测过程中 为防止假阳性的出现 必须要有标准阳性物质作为参考 目前常用的来源于纯合转基因植物的标准阳性物质在制备 贮藏和测定等方面都受很多因子影响 而且并非所有的作物转基因品系都存在这类标准阳性物质 从而影响到对转基因产品的分子检测 因此 标准阳性物质的缺乏已成为限制转基因产品检测的主要因素 所以研制标准阳性物质的替代品已成为当务之急 等于 年提出 单靶标质粒分子 概念 即将不同目标 * 片段分别克隆到载体上用作 标准分子 年 日本科学家 23 4 等提出了质粒标准分子的概念 质粒标准分子可以通过将需检测的基因片段克隆到克隆载体上而获得 操作很简单 另外 质粒标准分子还具有纯度高 稳定性好 易于保 收稿日期 $ $% 修回日期 $ $ 国家 十一五 重大科技专项资助项目 #&'!! #&'! #!&'! 通讯作者 电子信箱 % 存等优点 经验证质粒标准分子在.5+ 鉴定检测中是很好的标准阳性物质替代物 如 4 等构建的检测 5+*! 的质粒标准分子经欧盟联合研究中心标准物质方法研究所测试 最终注册并命名为有证标准物质 6(5$ / 因此 构建阳性标准分子已经成为国际上转基因检测领域的研究热点 目前 国外已获得多种转基因产品检测用质粒标准分子 /$ 我国也开展了许多阳性标准分子质粒构建方面的研究 成功构建了许多种阳性标准分子 如上海交通大学建立的多种阳性标准分子 $" 东北农业大学构建的转基因水稻 玉米和大豆通用质粒标准分子 % 吉林农科院构建的检测 5+*!#7!! 的质粒标准分子 7 中国农业科学院油料作物研究所构建的转基因作物筛查用阳性标准分子等! 转基因抗虫棉已大规模商业化应用 目前市场上种植的抗虫棉主要有孟山都公司的转 基因的抗虫棉 以及中国农业科学院生物技术研究所研发的转 或 的抗虫棉 上海交通大学构建的转基因棉花质粒分子主要是针对 设计的 尚未有检测含 基因的双价抗虫棉的质粒标准分子 本研究构建了检测转基因棉花的质粒标准分子 此质粒标准分子中含有

2 !% 中国生物工程杂志 8 0 *0! 基因 基因表达调控元件 ") 启动子 *+) 终止子 以及棉花内标基因 ), 以期为转 抗虫棉的检测提供阳性标准物质 材料与方法 材 料 非转基因棉花由本实验室保存 9 酶 荧光定量检测试剂盒 * 回收试剂盒及 载体购自 2( 公司 常用限制性内切酶购自 *6 公司 其它试剂为化学纯 引物合成由上海生物工程有限公司和博迈德生物技术有限公司合成 序列见表 和表 表 目的基因片段扩增所需引物!! "! " # $ % " 引物名称 : ( 序列 "; ; "; ; ") ( ";; ") : "; ;,: "; ;,( "; ; * : "; ; 引物名称 "): ")( "): ")( ) : ) ( : ( : ( * : * ( * : * ( * ( "; ; 表 & 质粒标准分子定性和定量检测引物 &$ ' " ' " # % " " "% & 实验方法 序列 "; ; 扩增片段长度 4- 备注 #" ") 定性检测 7 7 %!! ") 定量检测 定性 定量检测 定性检测 定量检测 * 定性检测 * 定量检测 0 0 ")$ $* 融合基因片段的扩增 以 : 和 ( 为引物 以质粒 - 为模板进行 ( 扩增 反应条件为 #/ " #/ % 7 个循环 7 " 结果扩增出预期大 小的 * 条带 以 ")$: 和 ")$( 为引物 以 - 为模板进行 ( 扩增 反应条件为 #/ " #/ "! 7 个循环 7 " 结果扩增出预期大小的 * 条带 以 ")$: 和 ( 为引物 以步骤 和 的 ( 产物为模板进行 ( 扩增 反应条件为 #/ " #/ "! 7 个循环 7 " 结果扩增出预期大小的 * 条带 / 以 * $: 和 * $( 为引物 以 - 为模板进行 ( 扩增 反应条件为 #/ " #/ "! 7 个循环 7 " 结果扩增出预期大小的 * 条带 " 以 ")$: 和 * $( 为引物 以步骤 和 / 的 ( 产物为模板进行 ( 扩增 反应条件为 #/ " #/ "! 7 个循环 7 " 结果扩增出预期大小的 * 条带 % 将步骤 " 的 ( 产物回收后与 $ 载体连接 并进行测序 阳性克隆命名为 - ")$$* 0 0 棉花内标基因 ), 基因片段的克隆 以,: 和,( 为引物 以苏棉 基因组 * 为模板进行 ( 扩增 反应条件为 #/ " #/ "% 7 个循环 #/ " 7 个循环 7 " 将 ( 产物回收后与 $ 载体连接 并进行测序 阳性克隆命名为 -., 0 0 质粒标准分子的制备 ( 双酶切 - ")$$* 和 -., 分别回收 0# 4 和 7!4- 左右的 * 条带 连接后形成质粒标准分子 / 质粒标准分子的 ( 验证 以转基因棉花 非转基因棉花 质粒标准分子为模板进行 ( 扩增 引物为常用定性检测引物 表 ( 反应条件为 #/ " #/ "" 7 个循环 7 " 0 0" 质粒标准分子的定量标准曲线的绘制 构建的质粒用限制性内切酶 进行酶切线性化 作为转基因棉花定量分析的标准分子 凝胶回收线性化的质粒 * 用分光光度计测量线性质粒 * 质量数 根据质粒分子大小 根据公式质粒拷贝数 < 质粒质量 = 质粒分子碱基对数 4- > /0" > >%0 > 将质粒的质数换算成拷贝数 将线性质粒 * 稀释成 > % > % > % > % > / % > " % > % % > 7 拷贝 = 用于标准曲线的建立和方法重复性评估

3 ! 王旭静等 转豇豆胰蛋白酶 基因棉花检测用标准分子的制备!7 在定量反应的标准曲线构建中 使用 梯度稀释的线性化质粒 * 作为模板 其对应的拷贝数分别为 > % > % > % > % > / % > " % > % % > 7 拷贝 中的绝对量 每个样品重复次 每次设个平行 定量检测体系的重复性 - 4 用相对标准偏差,,, () 来表示 本研究中所有的定量反应都在 ()7"++ 荧光定量 ( 仪器上完成 并使用仪器自带软件 7"? 8 00/ 对数据进行分析 荧光定量 ( 反应体系为 )@( A6' 9 5 > :, 0/ (0/ (+'(? " > 0/ * 模板 0,, + %0! 0 反应条件为 " #/ "" "! " 7 /" / 个循环 其中 ")*+)) 的退火温度为 "" 的退火温度为 "7 图 & 棉花内标基因 部分基因片段的克隆 *!+& " "! % " "%! "! " 4- ),? 4- ( 和 双酶切含有 ")$ $* 融合基因片段的 - ")$$* 质粒和含有内标基因 ), 的 -., 质粒 分别回收 7!4- 和 0# 4 左右的 * 条带 连接后形成质粒标准分子 -. 图 获得的质粒标准分子经测序确认 证明是正确的 在此质粒标准分子中 内标基因 ), 与 ")$ $* 融合基因片段反方向连接 & 结 果 & 质粒标准分子的制备本研究首先通过 ( 技术扩增出 ")- 基因和 * 终止子的序列 然后通过融合 ( 技术扩增得到了 ")$ $* 融合基因片段 为了方便构建标准分子 在此融合基因片段的 "; 端添加了 ( ; 端添加了 酶切位点 图 另外 通过优化的 ( 扩增条件 以棉花基因组 * 为模板扩增得到了内标基因 的部分基因片段 图 本研究获得的目的基因片段经测序证明是正确的 图 构建的质粒标准分子 $,- 示意图 *! %. %!. "!! " ". %" % $ $,- ),??, 3? ), ")??58 ") - *+)??*+) - - 图 (() 融合基因片段的克隆 *!+ " "! "! "! " (() 4- ") -? / *? " ")$?3? % ")$$*?3? && 质粒标准分子的 # 验证为了检测质粒标准分子能否用于转基因材料的定性分子检测 以转基因棉花 非转基因棉花 质粒标准分子为模板进行 ( 扩增 同时设空白对照 结果发现质粒标准分子和转基因棉花中能扩增出 / 个目的基因片段 而非转基因棉花中只能扩增出内标基因 ), 空白对照中不能扩增出任何目的基因片段 图 / 以上结果说明构建的质粒标准分子能用于转基因产品的定性检测

4 !! 中国生物工程杂志 8 0 *0! 图 / 质粒标准分子的 # 验证 *!+/0 " " "% $,- 4- ") -? 3 - ") -? 3 $ - / ") -? 3 - " ") -? %), -? 3-7), -? 3 $ -!), -? 3 - # ), -? ? 3 - -? 3 $ - -? 3 - -? /* -? 3 - " * -? 3 $ - % * -? 3-7* -? & 质粒标准分子的定量标准曲线的绘制及重复性验证 在定量允许范围内选择合适浓度的线性化质粒作 为标准 * 样品 绘制定量 ( 检测标准曲线 图 " 中分别显示了 " *+)), 的扩增曲线和标准曲线 各标准曲线的相关系数均达到 0#!" 以上 说明 图 质粒标准分子 $,- 荧光定量标准曲线 *!+ * % "% ' " " % $ " "% $,- ), 3? -. -, > % > % > % > % > / % > " % > % % > , -? (

5 ! 王旭静等 转豇豆胰蛋白酶 基因棉花检测用标准分子的制备!# 建立的 ( 具有很好的 $ 初始浓度相关性 达到定量分析的需求 在优化的定量 ( 反应条件下 分别以不同拷贝数的质粒分子 * 作标准品进行重复性测试 以同样的方法和条件做次重复 每次个平行 结果如表 所示 不同重复间获得的 的相对标准偏差小于 B 标准要求 "B 以内可以接受 说明定量 ( 反应的重复性很好 具有很好的稳定性 可以用于实际样品的进一步定量分析 表 以质粒 1) 为标准品建立的荧光定量 # 重复性分析 # $ $,- % " % "% ' " # 目标标准 目标标准 () B 序列含量 序列含量 () B ) > 0%/ /0#/ /0/ /0/ 0"" > #0/ #0/!07 #0% 0" % > 0// 0" 0 7 0/ 07/ % > #0% #0!0/!0!7 0 % > #0% #0%/!0 #0 0# % > %07 70! 0" % > %0# "07 /0# "0% 07 % > /0 /0" /0% /0 0% % > / # 0/ 0!! % > / 0 0/ 0 0" 07 % > "!0!0!/ 70"!!0 0! % > " 70%# %0## %07/ 70/ 0% % > % /0# /07! /0 /0"% 07/ % > % 0" 0# 0/" 0// % > 7 0 0% 0# 0 / 70/ % > 7 0%/ 0% 0% 0% 0 目标序列 标准含量 () B 目标序列 标准含量 ") > #0! #0%! #07" #0% 0"" *+) > 07 "0/ /0 /0/ 0 / % >!0%%!0#7 #0"7 #07 0 % > 0/ 0# 0! 0! 0#/ % > 70"! 70% 70!/ 70" 0 % > % 70% 70/7 07! % > /0"# /0# /0"! /0/" 07% % > 0# /0! /07 /0 0 % > / 0# % /0 % > / 0/ 0%/ 0# 0%7 0## % > " %0# 70 %0! %0/# 0 % > " %0! %0## %0# 0"" % > % 0% 0/ 0 0!# 0/ % > % 0" 0!7 07# 07 0/ % > 7 0 0% 0" 0" 0# % > 7 0% 0# 0" 0/ 0"# () B 讨 论 在转基因 ( 检测中 目前常用的标准物质包括来源于原始植物材料的标准品和质粒标准分子两类 其中质粒标准分子由于具有操作简单 稳定性好 经济高效 检测范围广等特点而受到研究者的广泛关注和重视 并逐渐取代传统阳性标准品用于转基因成分 ( 检测 现已构建出了适合转基因玉米 棉花 大豆 马铃薯 油菜等作物检测的质粒标准分子 # 个 经验证检测指标均达到 )+ 国际标准的域范围 可以用于转基因定量和定性 ( 检测 $#$#$ / 转 = 基因抗虫棉是中国农业科学院生物技术研究所郭三堆研究员研发的 已经进行商业化种植 目前构建的质粒标准分子大部分都是针对孟山都公司的抗虫棉设计的 尚未有关于检测转 棉花的质粒标准分子的报道 融合 ( 技术 + -- ( 采用具有互补末端的引物 形成具有重叠链的 ( 产物 通过 ( 产 物重叠链的延伸 从而将不同来源的任意 * 片段连接起来 此技术在不需要内切酶消化和连接酶处理的条件下实现 * 片段的体外连接 为同源重组片段的构建提供了快速简捷的途径 本研究将 棉花内标基因 ), 通用元件 ") 启动子和 *+) 终止子通过 + - ( 技术构建到克隆载体 -C# 上 形成质粒标准分子 通过 ( 验证和荧光定量分析 证明我们构建的质粒标准分子 -. 能够用于转 棉花的定性和定量检测 本研究还将对此质粒标准分子进行多个实验室的认证和实际样品的测定 以保证其在以后应用中的准确性和可靠性 参考文献 D, 68 C?, *?? -? 93??,?, -3, A,?, -,3 63 :, ( %/7$/ / *?

6 # 中国生物工程杂志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沈惶琳 李想 王姝 等 四种转基因玉米新型质粒标准分子协同实验验证 中国农业科技导报 #"#$#" ) 2 'D ) 3? 3 3 )? # "#$#" % 敖金霞 高学军 曲波 等 转基因大豆 玉米和水稻外源基因检测通用标准分子的构建 中国农业大学学报! %#$ / '.' 13 3? 3 3 C! %#$ / 7 李飞武 邵改革 邢珍娟 等 转基因大豆 5+*!#7!! 检测质粒标准分子的构建与应用 安徽农业科学! $ : D ).. ' & 3? * C 3 3 )! # $! 胡尚杰 吴刚 武玉花 等 转基因作物筛查用阳性质粒分子的构建及应用研究 中国油料作物学报 7 $7# 3 ) D3. 3?+ - ) 7 $7# #, ) 4 :, 7""# %!$ 7/ ) 4 (3 D , )- 4 *@, ) , -, *? 4?.5+,? $,3- A93 (, / 7!#!$ 7 D,: 4 ( $ - $4, --? 93?? - " + /!7 / $ "" D, - E? (3,3- (, 4 63 :, ( 7$ & 2,?, 93??,?, 3, 95 $ -, :, "" % $% #

7 ! 王旭静等 转豇豆胰蛋白酶 基因棉花检测用标准分子的制备 # " % " " # "% 1 % "!, " " "! " % " D *.'3$ +* $ *.1$ D *.&$A ( 3,? 3 3 )! % 4? - - ") - *+),, 3? ),, 4 (,,, 3,,? -, -. D -., $ * 3, - -? ")*+), ),?3 *? 4 -?,? -., 43 ), 4 -?,? $, 93,, 3? ")*+), ), 4 93 (,??,, 3, 0#!", 93 (, 4 3, 93 ( -,3 4, 4 4 3,? 93? - ),,? 13, 13,

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