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薰芯车
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1 生物工程学报 Chin J Biotech 2009, January 25; 25(1): journals.im.ac.cn Chinese Journal of Biotechnology ISSN cjb@im.ac.cn 2009 Institute of Microbiology, CAS & CSM, All rights reserved 医学与免疫生物技术人 IL35-IgG4(Fc) 融合蛋白在 CHO/DG44 细胞中的稳定表达唐静 1, 高闻达 2, 张青 1, 张大为 1, 陈洋 1, 何波 1, 刘全胜 1 四川大学生命科学学院医学细胞生物学教研室, 成都哈佛大学医学院, 波士顿 02115, 美国摘要 : 本研究利用基因重组技术构建人 IL35-IgG4(Fc) 融合基因真核表达载体, 稳定转染 CHO/DG44 细胞并检测重组蛋白的表达主要采用聚合酶链式反应 (PCR) 从脂多糖 (Lipopolysaccharides, LPS) 诱导的人髓性白血病细胞株 KG-I cdna 文库中克隆 EBI3 和 IL-12p35 cdna, 重叠 PCR 法连接 2 个片段, 并克隆到 IgG4(Fc)- poptivec -TOPO 载体上, 对新构建的 IL-35-IgG4 (Fc) poptivec -TOPO 真核表达载体并进行酶切测序 PCR 鉴定 ; 脂质体法转染 CHO/DG44 细胞 ; RT-PCR 检测转染结果, 采用 a-mem 培养基筛选实验组细胞, 对筛选的阳性克隆细胞再进行氨甲喋呤 (Methotrexate, MTX) 的加压筛选, ProteinG-Agarose 纯化阳性克隆培养上清, 免疫印迹检测目的蛋白表达结果显示 IL-35-IgG4 (Fc) poptivec -TOPO 表达载体稳定转染 CHO/DG44 细胞并获得阳性克隆 ; SDS-PAGE 电泳得到一条与预期相对分子质量大小相符的蛋白条带 ; 该蛋白能与羊抗人 IgG4 抗体特异结合本实验获得了能够稳定表达具有稳定结构的 IL35-IgG4(Fc) 融合蛋白的 CHO/DG44 细胞株关键词 : IL-35-IgG4(Fc) 融合蛋白, 重叠 PCR, 稳定转染, CHO/DG44 细胞, MTX 诱导的基因扩增 1 Expression of humane IL-35-IgG4 (Fc) fusion protein in CHO/DG44 cells Jing Tang, Wenda Gao, Qing Zhang, Dawei Zhang, Yang Chen, Bo He, and Quansheng Liu 1 College of Life Science, Sichuan University, Chengdu , China 2 Harvard Medical School, Boston 02115, USA Abstract: We constructed the eukaryotic expression vector of human IL-35-IgG4 (Fc)-pOptiVEC -TOPO by gene recombination technique and expressed the fusion protein human IL-35-IgG4 (Fc) in CHO/DG44 cells. The two components of the newly discovered cytokine human IL-35, EBI3 and IL-12p35, were amplified by PCR from the cdna library derived from the KG-I cells after LPS induction. The two PCR-amplified cdna fragments of human IL-35 were linked by over-lapping PCR and then cloned into the IgG4 (Fc)-pOptiVEC -TOPO vector. The constructed plasmid with the recombinant cdna IL-35-IgG4 (Fc) was verified by restriction enzyme digestion analysis, PCR and DNA sequencing. The verified plasmid with the recombinant cdna was transfected into CHO/DG44 cells using Lipofectamine The success of the transfection was examined and confirmed by RT-PCR. After selection in α-mem (-) medium, the IL-35-Ig G4 (Fc) positive CHO/DG44 clones were chosen and the media from Received: July 30, 2008; Accepted: November 7, 2008 Supported by: the National Natural Science Foundation of China (No ). Corresponding author: Quansheng Liu. qliu@shmu.edu.cn Wenda Gao. wgao@bidmc.harvard.edu 国家自然科学基金项目 (No ) 资助

2 110 ISSN CN /Q Chin J Biotech January 25, 2009 Vol.25 No.1 these positive clones were collected to be used to purify the fusion protein. The positive CHO/DG44 clones were further cultured in increasing concentrations of MTX and the expression levels of the fusion protein IL-35-Ig G4 (Fc) were repetitively induced by MTX-induced gene amplification. The IL-35-Ig G4 (Fc) fusion protein was purified from the media collected from the positive CHO/DG44 clones by protein G affinity chromatography and then identified by SDS-PAGE and Western blotting. The results showed that one protein band was found to match well with the predicted relative molecular mass of human IL-35-IgG4 (Fc) and this protein could specifically bind to anti-human IgG4 (Fc) monoclonal antibody. In conclusion, our study successfully established an IL-35-IgG4 (Fc) positive DG44 cell line which could stably express IL-35-IgG4 (Fc) fusion protein. Keywords: IL-35-IgG4 (Fc) fusion protein, over-lapping PCR, stable transfection, CHO/DG44cell lines, MTX-induced gene amplification 白介素 35(Interleukin 35, IL-35) 是 2007 年最新命名的新型细胞因子, 是由 EBI3(Epstein-Barr virus- induced gene 3) 和 IL-12p35 两个亚基共价结合形成的异源二聚体 [1] EBI3(Epstein-Barr virus-induced gene 3) 是 IL-12p40 和睫状节神经细胞营养因子的同源物, 最初是在感染了 EBV 病毒的 B 淋巴细胞中被发现的 [2], 主要由髓样细胞系所分泌 [3] EBI3 编码分子量为 34 kd 的糖蛋白, 与 IL-12p40 有 27% 的氨基酸同源性 ; IL-12p35 编码分子量为 35 kd 的糖蛋白, 与 IL-6 粒细胞集落刺激因子有同源性 [4] [5] 2007 年 Lauren W 等报道, 在小鼠体内, Foxp3 + 的 Treg 细胞能高表达 EBI3 和 IL-12p35, 并且 EBI3 IL-12p35 组成型表达后被分泌到胞外, 而 CD4 + T (Teff) 和初始性 T 细胞并无此功能 ; 当 Treg 细胞和 Teff 细胞共培养的时候, Treg 细胞内 EBI3 和 IL-12p35 的 mrna 水平显著提高 [5] [1] Wanda N 等的研究发现在体外 IL-35 可以抑制 Th17 细胞的分化 ; 在小鼠体内, IL-35 可以减轻由 Ⅱ 型胶原所诱导的关节炎的症状 [1] 因此, IL-35 是一种新型抗炎症细胞因子, 在小鼠体内主要通过诱导调节性 T 细胞增殖以及抑制 Th17 细胞来达到抑制炎症的作用并且认为 IL-35 在炎症疾病以及免疫相关疾病的治疗中发挥重要的作用, 鉴于目前人类 IL-35 的研究较少且及其重要性, 本实验通过体外构建人 IL-35 真核表达载体并转染 CHO/DG44 细胞来研究 IL-35 抗体融合蛋白的表达, 旨在为进一步研究其在人体内的调控生理功能和临床上的应用 1 材料和方法 1.1 材料质粒细胞株和菌株人髓性白血病细胞株 KG-I cdna 文库和 poptivec TNFR-TOPO -IgG4(Fc 段 ) 载体 (dhfr + ) 中华仓鼠卵巢细胞 (dhfr gene deficient CHO/DG44 cells) 细胞株, 均由哈佛大学医学院 Wenda Gao 博士惠赠, 感受态菌 DH5α 由本实验室保存主要试剂 RNA 提取试剂 (Invitrogen), AMV 逆转录酶 (Promega); 限制性内切酶 Nhe I Xho I 和 Nsb I T4 DNA 连接酶, 蛋白 Marker(MBI 公司 ); DNA 纯化回收试剂盒 ( 北京百泰克生物技术有限公司 ); 制粒提取试剂盒 ( 上海博泰生物公司 ); pfx DNA 合成酶 Lipofectamine 2000 脂质体 (Invitrogen); 山羊抗人 IgG(H+I)( 中山金桥 ); 亲和层析柱 Protein G-Agarose 购自 Roche 公司 ; 其他试剂为国产分析纯试剂培养基 a-mem(+) a-mem(-) 培养基购自 GIBICO; 无血清培养基 CD OptiCHO Medium 购自 Invitrogen 公司 ; 透析胎牛血清购自 Hyclone 公司 1.2 方法 PCR 扩增人 EBI3 和 IL-12p35 基因利用 Primer 5 软件, 根据 EBI3 和 IL-12p35 在 GenBank 中的序列设计引物在 EBI3 上游引物 (UP primer) 的 5 端加上 4 个保护碱基并引入 NheⅠ 酶切位点和 Kozak 序列 ( 核糖体进入位点, 防止核糖体在翻译过程中的滑行脱落, 增加基因的表达水平 ) 在 EBI3 下游引物 (Antisense primer) 的 5 端引入 linker; UP primer: 5 GTTAGCTAGCCGCCACCATGAC CCCGCAGCTTCTCCTGGCCC 3 (42); Antisense primer: 5 ACC TCC ACC TGA ACC TCC ACC ACCCGAACCACCTCCACCCTTGCCCAGGCTCATT GTGGC 3 (60) 扩增产物包括了 EBI3 整个编码区 687 bp PCR 反应参数 : 95 o C 4 min; 94 o C 1 min, 54 o C 1 min, 72 o C 1 min, 30 个循环 ; 72 o C 7 min 1% 琼脂糖

3 唐静等 : 人 IL35-IgG4(F c) 融合蛋白在 CHO/DG44 细胞中的稳定表达 111 凝胶电泳, 凝胶成像系统观察并照相回收目的片段在 IL-12p35 上游引物 (Sense primer) 的 5 端引入 linker, 下游引物 (DN primer) 的 5 端加上 4 个保护碱基, 并引入 Xho I 酶切位点 Sense primer: 5 -GTG GTT CGG GTG GTG GAG GTT CAG GTG GAG GTG GTT CT AGAAACCTCCCCGTGGCCACTC-3 (60) DN primer: 5 - GTAACTCGAGGGAAGCATTC AGATAGCTCATCACTC-3 (36) 扩增产物 IL-12p35 去掉了信号肽序列和起始密码子终止密码子后, 共有 591 bp PCR 反应参数 : 95 o C, 4 min; 94 o C 1 min; 54 o C 1 min; 72 o C 1 min; 30 个循环 ; 72 o C 7 min 0.8% 琼脂糖凝胶电泳, 紫外线透射仪下观察并照相, 胶回收目的片段 ( 引物中带下划线分别为 NheⅠ 和 XhoⅠ 酶切位点, 带框的部分为保护碱基, 阴影部分为 Kozak 序列, 斜体部分为 linker) 重叠 PCR 扩增 IL-35 以 PCR 扩增得到的 EBI3 和 IL-12p35 为模板, EBI3 的上游引物 (UP primer) 和 IL-12P35 的下游引物 (DN primer) 作为一对引物, 扩增得到 EBI3-IL- 12p35(IL-35), 即重叠 PCR 法将 2 个片段连接起来 PCR 反应参数 : 95 o C 4 min; 94 o C 1 min, 52 o C 2 min, 72 o C 1 min, 30 个循环 ; 72 o C 7 min 0.8% 琼脂糖凝胶电泳, 紫外线透射仪下观察并照相胶回收目的片段 IL-35-IgG4(Fc)pOptiVEC -TOPO 重组质粒的构建挑取 TNFR-IgG4(Fc)-pOptiVEC -TOPO 菌株单克隆于 10 ml LB 培养基中, 37 o C 恒温培养过夜, 碱裂解法抽提质粒, NheⅠ 和 XhoⅠ 双酶切质粒, 胶回收含有 IgG4(Fc) 的 poptivec -TOPO 载体片段 NheⅠ 和 XhoⅠ 双酶切 IL-35 的重叠 PCR 产物, 乙醇沉淀法纯化浓缩用 T4 连接酶将酶切的 IL-35 和同样酶切的含有 IgG4(Fc) 的 poptivec -TOPO 载体片段进行粘性末端的连接, 转化 DH5α 感受态细胞, 挑取单克隆 37 o C 恒温摇动培养, 提取制粒 DNA, 利用 NheⅠ 和 XhoⅠ 双酶切, XhoⅠ 单酶切以及 PCR 鉴定后测序细胞培养 CHO/DG44 细胞培养于 a-mem+ 含 10% 新生小牛血清的培养基中, 于 37 o C 5% CO 2 的培养箱中培养脂质体法转染 CHO/DG44 细胞及阳性克隆的筛选采用 Invitrogen 公司的脂质体转染技术 ( 参考试剂说明书 ) Nsb I 酶切 IL-35-IgG4(Fc) poptivec - TOPO 质粒使其线性化, 乙醇沉淀后纯化回收, 双蒸水溶解, 最终质粒浓度为 0.5 μg/μl 按照转染试剂 Lipofectamine 2000 说明书将线性化的重组质粒转染 CHO/DG44 细胞同时设置空载体组和未转染组细胞转染 24 h 之后加入 a-mem 培养基进行筛选 12 d 后表达质粒组和空载体组可见有阳性克隆形成, 阴性细胞组全部死亡, 用克隆环套取单克隆, 胰酶消化, 挑出 20 个生长旺盛的单克隆扩大培养, 在扩大培养的基础上重复挑取 20 个单克隆扩大培养冻存和检测 RT-PCR 检测表达的目的基因 RT-PCR 检测 CHO-DG/44 细胞中 IL-35mRNA 的表达, 分别取制粒表达组空载体组未转然对照组各细胞用 RT-PCR 检测 IL-35mRNA 的表达 ( 方法参照 Promega 说明书 ) IL-35 目的基因的扩增诱导表达与纯化在每个单克隆扩大培养稳定生长达到 70%~ 80% 时, 分别用浓度 50 nmol/l 100 nmol/l 250 nmol/l 500 nmol/l 和 1 μmol/l 的 MTX 进行加压筛选, 然后加入 a-mem 筛选培养基使细胞生长达到 70%~80% 后, 离心除去杂质, 超滤法浓缩细胞上清, 将浓缩以后的细胞上清用 ProteinG-Agarose 纯化, 最后分别收集在 ph 9.0 的预冷的 2 mol/l 的 Neutralization Buffer 中 SDS-PAGE 电泳以及 Western blotting 检测分别收集质粒表达组空载体组及未转然对照组 CHO-DG44 细胞培养上清 ProteinG-A garose 纯化后, 用 10% 的分离胶和 5% 的浓缩胶进行 SDS-PAGE 电泳 ( 制两块胶, 点相同的样 ) 电泳完毕后, 一块胶用考马斯亮蓝 G250 染色 1 h, 脱色后观察另一块电转印至硝酸纤维素膜, 5% 脱脂牛奶封闭, TBST 洗膜后孵育二抗, 山羊抗人 IgG, 稀释倍数为 1:2 500~ 显色, 曝光 2 结果 2.1 EBI3 IL-12p35 和 IL-35 基因 PCR 扩增结果以及载体的获得 PCR 产物经 1% 琼脂糖电泳显示约为 bp 的特异性扩增条带, 同预期结果相符 ( 图 1)

112 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech January 25, 2009 Vol.25 No.

2 Identification of the recombinate plasmid by enzyme digestion.

4: IL-35 PCR. 图 1 PCR 产物和载体的琼脂糖凝胶电泳图 Fig. 1 Analysis of IL-35-IgG4(Fc)-pOptiVEC -TOPO vector by enzymatic digestion and the vector.

IL-12p35 591 bp; 3: IL-35 1278 bp; 4: IgG4(F c)- poptivec -TOPO vector 5089 bp. 2.

4 112 ISSN CN /Q Chin J Biotech January 25, 2009 Vol.25 No.1 载体的获取 : NheⅠ 和 XhoⅠ 双酶切 TNFR- IgG4-pOptiVEC -TOPO 质粒, 胶回收法获取含有 IgG4(Fc) 段的 poptivec -TOPO 载体片段, 经 1% 琼脂糖凝胶电泳显示有 1 条分子量为 5089 bp 的片段, 与预期的结果相符合 ( 图 1) 图 2 重组质粒的酶切鉴定 Fig. 2 Identification of the recombinate plasmid by enzyme digestion. M: marker; 1: recombinant plasmid IL-35-IGg4(Fc)- poptivec -TOPO ; 2: IL-35 IGg4(Fc)-pOptiVEC -TOPO is digested by xhoⅠ; 3: the vector IL-35-IGg4(Fc)-pOptiVEC - TOPO is digested by NheⅠ and Xho I ; 4: IL-35 PCR. 图 1 PCR 产物和载体的琼脂糖凝胶电泳图 Fig. 1 Analysis of IL-35-IgG4(Fc)-pOptiVEC -TOPO vector by enzymatic digestion and the vector. M: marker; 1: EBI3 687 bp; 2: IL-12p bp; 3: IL bp; 4: IgG4(F c)- poptivec -TOPO vector 5089 bp. 2.2 重组 IL-35-IGg4(F c)-poptivec -TOPO 真核表达载体的鉴定将重组获得的 IL-35-IGg4(Fc)-pOptiVEC - TOPO 真核表达载体双酶切, 单酶切和 PCR 鉴定, 将酶切后的结果经 1% 的琼脂糖凝胶电泳显示 ( 图 2), 用 poptivec -TOPO 载体的通用测序引物进行双向测序 (Invitrogen 公司 ), 测序结果与 GenBank 上的序列 (EBI3 NM , IL-12p35 NM ) 完全一致 2.3 重组质粒转染 CHO/DG44 重组质粒 IL-35-IGg4(Fc)- poptivec -TOPO, poptivec -TOPO 采用脂质体转染试剂盒转染 CHO/DG44 细胞, 加入 a-mem ( 含 5% 透析胎牛血清 ) 筛选培养基筛选, 12 d 后出现分散的阳性克隆, 未转染对照组细胞全部死亡 ( 图 3) 2.4 IL-35 基因表达产物的鉴定 IL-35 基因表达产物的 RT-PCR 分析结果提取实验组细胞 RNA, RT-PCR 法和利用重叠 PCR 的引物扩增 IL-35mRNA, 结果显示质粒表达组扩增出大小为 1278 bp 的 DNA 带, 而未转染对照组和质粒组未扩增出 DNA 带 ( 图 4) 图 3 细胞克隆 Fig. 3 The clone of the cells. A: untransfected control; B: cells transfected with poptivec -TOPO vector; C: cells transfected with IL-35-IGg4(Fc)-pOptiVEC -TOPO. 图 4 RT-PCR 检测未转染组空载体组和质粒表达组细胞中 IL-35 mrna 的表达 Fig. 4 Analysis of PCR product in untransfected group, blank vector group and plasmid-expressed group. M: marker; 1: untransfected group; 2: blank vector transfected group; 3: plasmid-transfected group IL-35 基因表达产物的 SDS-PAGE 电泳结果 ProteinG-Agarose 纯化的 IL-35-IGg4 (Fc) 融合蛋

唐静等 : 人 IL35-IgG4(F c) 融合蛋白在 CHO/DG44 细胞中的稳定表达 113 白, 在变性条件下进行 SDS-PAGE 电泳, 考马氏亮兰染色, 发现在 78 kd 处见 1 条蛋白带 ( 图 5) 和预期的 IL-35-IGg4 (Fc) 融合蛋白相对分子质量相符 3.2 μg/ml 4.6 μg/ml 7.5 μg/ml 和 11.

M: marker; 1: blank vector transfected group; 2: untransfected group; 3: IL-35-IgG4(

3 IL-35 基因表达产物的 Western blotting 检测结果各实验组细胞培养上清经 SDS-PAGE 电泳分离和 Western blotting 分析, 发现质粒转染组有一分子质量约为 78 kd 大小的特异性条带与山羊抗人 IgG 特异结合, 而未转染组和空载体组 ( 不含 IgG4 (Fc) 段 ) 细胞培养上清中, 未见相应条带 ( 图 6) 图 7 BSA 半定量滴定结果

5 唐静等 : 人 IL35-IgG4(F c) 融合蛋白在 CHO/DG44 细胞中的稳定表达 113 白, 在变性条件下进行 SDS-PAGE 电泳, 考马氏亮兰染色, 发现在 78 kd 处见 1 条蛋白带 ( 图 5) 和预期的 IL-35-IGg4 (Fc) 融合蛋白相对分子质量相符 3.2 μg/ml 4.6 μg/ml 7.5 μg/ml 和 11.2 μg/ml 用浓度为 1 μg/μl 2 μg/μl 4 μg/μl 8 μg/μl 和 16 μg/μl 的 BSA ( 牛血清白蛋白 ) 滴定 MTX 五种浓度条件下加压的无血清培养上清图 5 IL-35-IgG4(F c) 融合蛋白 SDS-PAGE 分析图 Fig. 5 Analysis of IL-35-IgG4 (Fc) fusion protein by SDS-PAGE. M: marker; 1: blank vector transfected group; 2: untransfected group; 3: IL-35-IgG4(Fc)fusion protein IL-35 基因表达产物的 Western blotting 检测结果各实验组细胞培养上清经 SDS-PAGE 电泳分离和 Western blotting 分析, 发现质粒转染组有一分子质量约为 78 kd 大小的特异性条带与山羊抗人 IgG 特异结合, 而未转染组和空载体组 ( 不含 IgG4 (Fc) 段 ) 细胞培养上清中, 未见相应条带 ( 图 6) 图 7 BSA 半定量滴定结果 Fig. 7 Result of BSA semiquantitative titration. 1 5: amount of BSA is 1 μg, 2 μg, 4 μg, 8 μg, 16 μg separately; 6: the medium without serum; 7: culture supernatant of untransfected group in serum-free medium; 8 10: culture supernatants of cells cultivated in serum-free medium and selected by 0 nmol/l, 50 nmol/l, 100 nmol/l of MTX separately; A: culture supernatant of cells transfected with empty vector in serum-free medium; B D: culture supernatants of cells cultivated in serum-free medium and selected by 250 nmol/l, 500 nmol/l, and 1000 nmol/l, MTX separately. 3 讨论图 6 免疫印迹检测 IL-35-IgG4(Fc) 融合蛋白的表达 Fig. 6 The expression of fusion protein IL-35-IgG4 (Fc) by Western blotting. 1: culture supernatant of untransfected control; 2: culture Supernatant of cells with empty vector; 3: IL-35-IgG4(Fc) fusion protein 蛋白浓度测定结果通过紫外分光光度计测定 5 种 MTX 浓度条件下的纯化蛋白浓度, 根据波长 595 nm 的光吸收值鉴定含有免疫球蛋白的洗脱组分溶液 (A mg/ml), 在 MTX 浓度分别为 0 nmol/l 50 nmol/l 100 nmol/l 250 nmol/l 500 nmol/l 和 1 μmol/l 下, 蛋白表达产量依次为 : 0.4 μg/ml 1.8 μg/ml IL-35 是由 EBI3 和 IL-12p35 两个亚基构成的异源二聚体, 属于 IL-12 家族 [1] 调节性 T 细胞 (Treg) 可组成性的分泌 EBI3 和 IL-12p35, 但在静息状态下和效应 T 细胞 (Teff) 中不表达 [5] IL-35 在功能上主要涉及抑制 IL-17 IL-22 等细胞因子的表达, 抑制机体免疫反应 [1] IL-12p35 组成性的表达于多种组织内 [6,7], 而 EBI3 则主要在造血细胞中表达 [2] 在人体内, EBI3 主要在淋巴组织内表达 [2] Devergne O 等人的研究发现在人的扁桃体, 肾脏细胞尤其是在足月的胎盘滋养层细胞中 EBI3 有很高的表达水平, 在患有溃疡性结肠炎病人的粘膜内 EBI3 也有表达 [8] EBV 感染后, Th1 样细胞因子的表达水平是升高的, 目的在于

6 114 ISSN CN /Q Chin J Biotech January 25, 2009 Vol.25 No.1 清除感染的细胞 [9] ; EBI3 在霍奇金淋巴瘤中也有很高的表达水平 [10] 已有研究发现在胎盘滋养层细胞内, EBI3 和 IL-12p35 的表达水平同时都有很大水平的提高 [11], 同时在足月的人的正常胎盘的滋养层细胞中可以分离得到 EBI3 和 IL-12p35 [12], 滋养层在母体免疫耐受中扮演着重要的角色, 其中部分作用是通过分泌细胞因子来实现的 [13 16] 由此可以推测出 IL-35 在炎症反应的控制中起着非常重要的作用在急性感染 ( 如 EBV 感染 ), IL-35 可以明显地诱导 Th1 细胞的增殖, 目的在于清除掉感染的细胞 [1], IL-35 也可以抑制 Th17 细胞的分化来阻止重度自身免疫疾病的发生 [5] ; 同时在急性感染下, IL-35 也可以诱导调节性 T 细胞的增殖 ; 在慢性感染中, 调节性 T 细胞 (Treg) 通过抑制效应性细胞的作用来阻止感染中的并行破坏作用 [1], 更为重要的是 : IL-35 在胎盘的滋养层细胞中出现, 可能用来抑制潜在的效应细胞的破坏, 其在母体免疫耐受中起到重要作用 [1] 将抗体分子片段与其他蛋白融合, 可以得到具有 [17, 抗体活性和其他生物活性或功能的抗体融合蛋白 18] 抗体融合蛋白能改善免疫分析免疫治疗和抗体纯化等 [19] 利用抗体的 Fc 片段的特有生物效应功能, 将抗体的 Fc 片段与另一活性蛋白相融合, 可构建 Fc 抗体融合蛋白这些融合蛋白除了保持功能蛋白的活性外, 也获得了 Fc 片段的活性, 这可以增加该蛋白在血液中的半衰期, 并发挥 Fc 片段的生物学效应, 如激活机体的免疫功能或是提高药物的动力学活性, 同时也有利于目的蛋白的分离纯化 Fc 和酶标如碱性磷酸酶等融合, 用于细胞活性的分析和研究 [21], 同时也会引起抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用 (ADCC) 和补体激活作用给机体造成伤害 [22] 本实验构建的抗体融合蛋白 IL-35-IgG4(Fc) 表达质粒使用的是 IgG4 的 Fc 段, 在其基因中引入了一个突变 (Mutation), 使其中一个亮氨酸密码子 (tta) 变成了一个谷氨酸密码子 (gaa), 完全敲除了 ADCC 和补体激活作用, 这将避免抗体融合蛋白药物所带来的副作用在本实验所构建的 IL-35-IgG4(Fc)- poptivec - TOPO 表达载体中, EBI3 和 IL-12p35 是通过 linker 连接的, 其中所设计的 linker peptide 是 GGGSGGG- GSGGG 为防止连接的过程中 2 条 linker 互补配对形成二聚体, 在 linker 的设计中本实验对部分甘氨酸的密码子作了同义突变, 将 linker 分别加在扩增 EBI3 的下游引物的 3 端, IL-12p35 上游引物的 5 端, 然后以 PCR 扩增的 EBI3 和 IL-12p35 为模板, EBI3 的上游引物, IL-12p35 的下游引物作为一对引物通过重叠 PCR 扩增, 就可以通过 linker 来连接 2 个片段, 扩增得到 EBI3-IL-12p35 即 (IL35) 在表达系统方面, 本研究采用了 CHO 真核表达系统 CHO 细胞属于成纤维细胞, 很少分泌自身内源性蛋白, 且能保持重组蛋白的生物活性, 这些都保障了重组蛋白的分离纯化, 对工业化生产提供了可行性 [22] 本实验结果显示, 通过基因工程手段所构建的 IL35-IgG4(Fc) 融合基因的真核表达载体 IL-35-IGg4(Fc)-pOptiVEC -TOPO 稳定转染 CHO/ DG44 细胞, 已成功表达了 IL-35-IGg4(Fc) 抗体融合蛋白 Western blotting 证实转染 CHO/DG44 细胞上清液中 IL-35-IGg4(Fc) 融合蛋白有表达, 且这种融合蛋白具有免疫学活性 BSA 半定量滴定实验显示, 每毫升的无血清培养上清中 IL-35-IGg4(Fc) 融合蛋白的表达量随着 MTX 浓度的增加, 呈现递增的趋势 ; 而利用紫外分光光度计测定 5 种 MTX 浓度加压条件下的纯化蛋白浓度的结果也显示了这种趋势通过这种方法可以筛选出高效表达 IL-35-IGg4(Fc) 融合蛋白的细胞株已有的研究表明 IL-35 在 Treg 细胞存在表达特异性, EBI3 是转录因子 Foxp3 的靶作用物 [5], 研究同时还发现 EBI3-/- Treg 或 IL-12p35-/- Treg 调控作用显著降低 [5] 从这些研究中, 可以推测 Treg 细胞在维持自身免疫耐受抑制自身免疫限制慢性炎症和调节淋巴细胞稳态等作用过程中, IL-35 发挥了关键作用目前国内外对于 IL-35 的研究相对不足, 本实验建立的重组 IL-35 表达可为以后 IL-35 受体发现设计的信号通路及其作用机制提供一定的理论参考 REFERENCES [1] Niedbala W, Wei XQ, Cai BL, et al. IL-35 is a novel cytokine with therapeutic effects against collagen-induced arthritis through the expansion of regulatory T cells and suppression of Th17 cells. Eur J Immunol, 2007, 37: [2] Devergne O, Hummel M, Koeppen H, et al. A novel interleukin-12 p40-related protein induced by latent

7 唐静等 : 人 IL35-IgG4(F c) 融合蛋白在 CHO/DG44 细胞中的稳定表达 115 Epstein-Barr virus infection in B lymphocytes. J Virol, 1996, 70(4): [3] Pflanz S, Timans JC, Cheung J, et al. IL-27, a heterodimeric cytokine composed of EBI3 and p28 protein, induces proliferation of naive CD41 T cells. Immunity, 2002, 16: [4] Merberg DM, Wolf SF, Clark SC. Sequence similarity between NKSF and the IL-6/G-CSF family. Immunol Today, 1995, 13: 77. [5] Lauren WC, Creg JW, Timothy TK, et al. The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function. Nature, 2007, 22(450): [6] Stern FJ, Podlaski JD, Hulmes YE, et al. Purification to homogeneity and partial characterization of cytotoxic lymphocyte maturation factor from human B-lymphoblastoid cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1990, 87(87): [7] Wolf SF, Temple PA, Kobayashi M, et al. Cloning of cdna for natural killer cell stimulatory factor, a heterodimeric cytokine with multiple biologic effects on T and natural killer cells. J Immunol, 1991, 9(146): [8] Christ AD, Stevens, AC, Koeppen H, et al. An interleukin 12-related cytokine is up-regulated in ulcerative colitis but not in Crohn s disease. Gastroenterology, 1998, 115: [9] Ohga S, Nomura A, Takada H, et al. Immunological aspects of Epstein-Barr virus infection. Crit Rev Oncol Hematol, 2002, 44: [10] Niedobitek G, Pazolt D, Teichmann M, et al. Frequent expression of the Epstein-Barr virus (EBV)-induced gene, EBI3, an IL-12 p40-related cytokine, in Hodgkin and Reed-Sternberg cells. J Pathol, 2002, 198: [11] Devergne O, Coulomb-L'Hermine A, Capel F, et al. Expression of Epstein-Barr virus-induced gene 3, an interleukin-12 p40-related molecule, throughout human pregnancy: Involvement of syncytio trophoblasts and extravillous trophoblasts. Am J Pa, 2001, 159: [12] Devergne O, Birkenbach M, Kieff E. Epstein-Barr virus-induced gene 3 and the p35 subunit of interleukin 12 form a novel heterodimeric hematopoietin. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 22(94): [13] Jokhi PP, King A, Loke YW. Cytokine production and cytokine receptor expression by cells of the human first trimester placental-uterine interface. Cytokine, 1997, 9: [14] Le BP, Solier C, Proll J, et al. Placental HLA-G protein expression in vivo: Where and what for? Hum Reprod Update, 1999, 5: [15] Roth I, Corry DB, Locksley RM, et al. Human placental cytotrophoblasts produce the immunosuppressive cytokine interleukin 10. J Exp Med, 1996, 184: [16] Dealtry GB, Clark DE, Sharkey A, et al. Expression and localization of the Th2-type cytokine interleukin-13 and its receptor in the placenta during human pregnancy. Am J Reprod Immunol, 1998, 40: [17] Oppmann B., Lesley R, Blom B, et al. Novel p19 protein engages IL-12 p40 to form a cytokine, IL-23, with biological activities similar as well as distinct from IL-12. Immunity, 2000, 13: [18] Pflanz S, Timans JC, Cheung J, et al. IL-27, a heterodimeric cytokine composed of EBI3 and p28 protein, induces proliferation of naive CD 4+ T cells. Immunity, 2002, 16: [19] Zhang XH, Zhang WJ. Construction of genetically engineered antibody fusion Proteins. Prog Biotechnol, 2001, 21(4): 张雪洪, 张惟杰. 基因工程抗体融合蛋白的构建. 生物工程进展, 2001, 21(4): [20] Wang CL, Huang M, Wesson CA. A single Fc binding domain alkaline phosphatase gene fusion expresses a protein with both IgG binding ability and alkaline phosphatase enzymatic activity. Protein Eng, 1994, 5(7): [21] Junghans RP. IgG Biosynthesis: No Immunoregulatory Feedback. Trends Biotechnol, 1997, 15: 155. [22] Shen YH, Geng XD. The recent progress in the upstream studies on the culture with CHO cell. Prog Biotechnol, 2000, 20(4): 申烨华, 耿信笃. CHO 细胞表达系统研究进展. 生物工程进展, 2000, 20(4):

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽