李伟军, 等 PRL 3 基因 C104S 位点突变体和 CAAX 缺失体的构建及表达 517 报道在我们的前期工作中, 本研究室已构建了 pcdna3 myc PRL 3(p PRL 3) pegfp PRL 3(pE PRL 3) 等质粒, 并对 PRL 3 的有关功能进行了研究, 结果显示,

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兑潘
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1 516 北京大报 ( 医版 ) JOURNALOFPEKINGUNIVERSITY(HEALTHSCIENCES) Vol.41 No.5 Oct.2009 PRL 3 基因 C104S 位点突变体和 CAAX 缺失体的构建及表达李伟军, 邢晓芳, 曲立科, 孟麟, 寿成超论著 ( 北京大临床肿瘤院, 北京肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所生物化与分子生物研究室, 恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室, 北京 ) [ 摘要 ] 目的 : 分别构建肝再生磷酸酶 3(phosphataseofregeneratingliver3,PRL 3) 基因 C104S 位点突变和 C 端 CAAX 缺失的 myc 标签和 GFP 荧光标签重组质粒 pcdna3 myc PRL 3(C104S) pegfp PRL 3(C104S) pcdna3 myc PRL 3( CAAX) 和 pegfp PRL 3( CAAX), 并进行真核表达, 为 PRL 3 的后续功能研究提供有效的工具方法 : 设计 PRL 3 基因 C104S 点突变 C 端 CAAX 缺失的特异性引物, 以 pcdna3 myc PRL 3 质粒为模板, 通过基因克隆一步法点突变的方法构建各重组质粒, 通过酶切和测序鉴定后转染真核细胞, 检测其在细胞中的表达并观察定位情况结果 : 成功构建了 4 种重组质粒, 并能在结肠癌细胞 LoVo 中表达用激光共聚焦扫描显微镜对细胞中绿色荧光融合蛋白的定位观察发现, 当 PRL 3 的 CAAX 位点缺失后,PRL 3 由内膜系统大量入核, 与理论预期相符结论 : 获得了 PRL 3 基因 C104S 位点突变体和 CAAX 缺失体重组真核表达质粒并能在细胞中表达, 为进一步研究 PRL 3 的功能提供了条件 [ 关键词 ] 蛋白质酪氨酸磷酸酶 ; 肿瘤 ; 点突变 ; 基因缺失 [ 中图分类号 ]R73 37 [ 文献标识码 ]A [ 文章编号 ] X(2009) doi: /j.isn X ConstructionandexpresionofPRL 3plasmidwithC104SpointmutationandCAAX deletion LIWei jun,xingxiao fang,quli ke,menglin,shoucheng chao (KeylaboratoryofCarcinogenesisandTranslationalResearchofMinistryofEducation,DepartmentofBiochemistryand MolecularBiology,PekingUniversitySchoolofOncology,BeijingCancerHospital&Institute,Beijing100142,China) ABSTRACT Objective:ToconstructPRL 3geneC104SpointmutationandCAAXdeletionmutants: pcdna3 myc PRL 3 (C104S), pegfp PRL 3 (C104S), pcdna3 myc PRL 3 ( CAAX) and pegfp PRL 3( CAAX),andexprestheseplasmidsineukaryoticcels.Methods:Recombinant plasmidsweremutatedwithpcdna3 myc PRL 3plasmidastemplateandspecificprimers.Mutantswere identifiedbyrestrictionenzymedigestionanddnasequencing.thentheserecombinantplasmidswere transfectedintolovocels.theexpresionoffusionproteinsweredetectedbywesternblotingandthe localizationoffusionproteinswereexaminedbygpffluorescencelabeling.results:themutantswere succesfulyconstructedandexpresedineukaryoticcels.prl 3( CAAX)relocatesfrom plasma membrane/earlyendosometothecytoplasmand/ornucleus,whichprovidesastructuralinsightofprl 3 protein.conclusion:constructionofeukaryoticexpresionrecombinantplasmidsofprl 3geneC104S pointmutationandcaaxdeletionmutantsprovideausefultoolforthestudyofprl 3 sroleincancer. KEYWORDS Proteintyrosinephosphatase;Neoplasms;Pointmutation;Genedeletion 肝再生磷酸酶 3(phosphataseofregenerating liver3,prl 3) 是一种小分子酪氨酸蛋白磷酸酶, 相对分子质量约为 , 与 PRL 1 PRL 2 同属于蛋白酪氨酸磷酸酶 (proteintyrosinephosphatases, PTPs) 超家族近来研究显示,PRL 3 在多种肿瘤中过表达, 与肿瘤转移过程密切相关, 但分子机制尚不清楚 [1] 对 PRL 3 蛋白的结构分析表明,PRL 3 第 104 位氨基酸半胱氨酸 (Cys104) 是一个保守的催化残基, 将其突变后能使 PRL 3 蛋白磷酸酶失活 [2-3] 同时,PRL 3 通过 C 端 CAAX 基团异戊二烯化锚定于细胞的内膜系统和早期内体结构, 当其异戊二烯化修饰受阻时,PRL 3 蛋白进入细胞核 [4-6], 但此定位改变现象与 PRL 3 蛋白功能之间的联系尚未见基金项目 : 国家自然科基金 ( ) 和国家重点基础研究发展计划项目基金 (2009CB521805) 资助 SupportedbytheNationalNatural SciencesFoundationofChina( )andtheMajorStateBasicResearchDevelopmentProgramofChina(2009CB521805) Corespondingauthor se mail,scc@bjcancer.org

2 李伟军, 等 PRL 3 基因 C104S 位点突变体和 CAAX 缺失体的构建及表达 517 报道在我们的前期工作中, 本研究室已构建了 pcdna3 myc PRL 3(p PRL 3) pegfp PRL 3(pE PRL 3) 等质粒, 并对 PRL 3 的有关功能进行了研究, 结果显示,integrinα1 是 PRL 3 的相互作用蛋白之一, 且 PRL 3 蛋白可以降低 integrinβ1 的酪氨酸磷酸化水平 [7] 为了进一步研究 PRL 3 蛋白的功能及其在肿瘤发生发展过程中的作用, 本研究构建了 PRL 3 基因 C104S 位点突变体和 CAAX 缺失体真核重组质粒并在细胞中进行表达, 为 PRL 3 蛋白功能的后续研究奠定基础 1 材料与方法 1.1 材料 EasyMutagenesisSystem 点突变试剂盒为 Trans genebiotech 公司产品,DNA 凝胶回收试剂盒为 QIAGEN 公司产品, 细胞转染试剂 Lipofectamine TM 2000 为 Invitrogen 公司产品, 限制性内切酶 T4DNA 连接酶为 NEB 公司产品,PCR 反应体系 DNA 分子量标准购于天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司,GAPDH 抗体 (BC009081) 为 ProteintechGroup 公司产品 pcdna3 myc(p) 质粒由本研究室构建, 在 pcdna3 质粒的多克隆位点前插入一段表达 myc 标签的序列, 所表达蛋白为 myc 融合蛋白 pegfp(pe) 质粒带 myc 标签的 p PRL 3 质粒带 GFP 标签的 pe PRL 3 质粒及 BL21 感受态细菌均由本室保存 1.2 引物的设计与合成根据突变的位点将第 104 个氨基酸半胱氨酸 C 突变为丝氨酸 S, 设计突变引物为 : 上游 5 caggcc cgccacagagtgcacagc 3, 下游 5 gctgtgcactctgtg gcgggcctg 3 构建 C 端 CAAX 缺失体时, 根据 PRL 3 基因序列 (GenBankAccesionNumber:NM_ ), 同时分别在上游和下游引物的 5 端引入 BamHⅠ 和 EcoRⅠ 酶切位点, 缺失体引物为 : 上游 5 cgcggatccatggcccgcatgaaccgg 3, 下游 5 ccg gaatctcaccgggtctgtgcgtgtgtgggtc 3 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成 1.3 pcdna3 myc PRL 3(C104S) 重组质粒 p PRL 3 m 的构建根据点突变试剂盒的说明书和试剂, 以 p PRL 3 质粒为模板, 加入合成的突变引物,PCR 循环参数为 : 先 94 5min; 然后 94 30s,65 30s, 72 12min, 共 25 个循环后, 最后于 72 延伸 10 min PCR 结束后加 1μLDpnⅠ 酶于 PCR 产物中, 混匀,37 孵育 1h 加 5μLDpnⅠ 消化产物于 50 μldmtcompetentcel 进行转化后, 挑克隆测序 1.4 pcdna3 myc PRL 3( CAAX) 重组质粒 p PRL 3 的构建以 p PRL 3 质粒为模板, 加入合成的缺失体引物,PCR 循环参数为 : 先 94 5min; 然后 94 45s,58 45s,72 45s,29 个循环后, 最后于 72 延伸 10min PCR 产物和 pgex 4T1 质粒同时用 BamHⅠ 和 EcoRⅠ 双酶切, 片段和载体经 DNA 凝胶回收后进行连接转化酶切和测序鉴定, 获得正确的 pgex 4T1 PRL 3( CAAX) 质粒将 pgex 4T1 PRL 3( CAAX) 质粒和 p PRL 3 质粒用 BamH Ⅰ 和 XhoⅠ 双酶切, 回收 PRL 3( CAAX) 片段和 pcdna3 myc 载体, 连接转化后进行酶切和测序鉴定 1.5 pegfp PRL 3(C104S) 重组质粒 (pe PRL 3 m) 和 pegfp PRL 3( CAAX) 重组质粒 (pe PRL 3 ) 的构建将 p PRL 3 m 和 p PRL 3 质粒用 BamHⅠ 和 EcoRⅠ 双酶切,pE 质粒用 BglⅡ 和 EcoRⅠ 双酶切, 分别回收片段和载体, 连接转化后进行酶切和测序鉴定 1.6 细胞转染根据转染试剂说明书, 于转染前 1 天将结肠癌细胞 LoVo 接种到 6 孔板中, 个细胞 / 孔, 使细胞达到 90% ~95% 汇合转染时提前 1h 用 Opti MEM 培养基 600μL 换去完全培养基分别将 4μg 质粒和 10μLLipofectamine TM 2000 试剂加至 200μLOpti MEM 培养基中, 室温放置 5min 后将两者混合, 再室温孵育 20min, 将 400μL 的 DNA Lipo fectamine TM 2000 混合物加入到 6 孔板中,6h 后更换为完全培养基,24h 后在激光共聚焦扫描显微镜下观察荧光蛋白的表达定位或 48h 后收集细胞进行相关蛋白的检测 1.7 Westernblot 收取真核重组质粒转染 48h 后的 LoVo 细胞, 加入细胞裂解液 [50mmol/LpH 7.4Hepes,150 mmol/lnacl,1mmol/ledta,50mmol/lnaf,1 mmol/lna 2 VO 4,1%( 体积分数 )TritonX 100,10% ( 体积分数 )Glycerol,proteaseinhibitors] 后冰上放置 30min, g 离心 20min, 取细胞裂解液的上清液加入等体积的 2 SDS PAGE 上样缓冲液, 沸水煮 5min, 使用 12% ( 体积分数 ) 的 SDS PAGE 进行电泳分离, 转移到硝酸纤维素膜 (NC 膜 ) 上后, 用 5%( 体积分数 ) 脱脂奶粉室温封闭 1h, 分别加入 GAPDH 抗体或 myc 抗体 4 反应过夜, PBST[0.1%( 体积分数 )Tween20] 溶液洗膜后, 加

北５１８京大报医版ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＰＥＫＩＮＧＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＨＥＡＬＴＨＳＣＩＥＮＣＥＳＶ４１Ｎ５Ｏ２９羊抗小鼠ＩＧＨＲＰ室温反应４５ｍＰＢＳＴ１Ｗｂ用ＧＡＰＤＨ抗体检测ＧＡＰＤＨ蛋白含量Ｔｗ２洗膜后ＥＣＬ检测相应蛋白的表达作为上样蛋白量的参照用ｍ抗体在相对分子质１８荧光蛋白在细胞中的表达和定位

察荧光蛋白的表达和定位情况２结果１ｍ重组质粒的鉴定用ＢｍＨⅠ和ＥＲⅠ 双酶切ｍ质粒的片段图１点突变质粒测序结果释放约５ｂ证实成功构建了ｍ质粒图２ＡＤＮＡｗ３ＴＧＣＢＤＮＡＣ１４Ｓｍ３ＴＣＴ图２３突变体Ｃ１４Ｓ位点测序图Ｆ２ＤＮＡｍ３Ｃ１４Ｓｍ３２ｍ３４ｍｘｍ５ｂｍ图１ｍＢｍＨⅠ和

3 北５１８京大报医版ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＰＥＫＩＮＧＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＨＥＡＬＴＨＳＣＩＥＮＣＥＳＶ４１Ｎ５Ｏ２９羊抗小鼠ＩＧＨＲＰ室温反应４５ｍＰＢＳＴ１Ｗｂ用ＧＡＰＤＨ抗体检测ＧＡＰＤＨ蛋白含量Ｔｗ２洗膜后ＥＣＬ检测相应蛋白的表达作为上样蛋白量的参照用ｍ抗体在相对分子质１８荧光蛋白在细胞中的表达和定位３量为２２１大小处检测到ｍ和ＬＶ细胞消化后以４１５个细胞孔接种到真核质粒的蛋白表达图５６孔板孔内加有盖玻片第２天分别转染Ｅｍ４ｈ后取出３质粒２６孔板ＰＢＳ洗两遍去除细胞培养液加入２体积分数多聚甲醛室温固定２ｍＰＢＳ洗两遍加入Ｈｈ室温放置５ｍ进行核染色ＰＢＳ洗两遍取出盖玻片后封片在激光共聚焦扫描显微镜下观察荧光蛋白的表达和定位情况２结果１ｍ重组质粒的鉴定用ＢｍＨⅠ和ＥＲⅠ 双酶切ｍ质粒的片段图１点突变质粒测序结果释放约５ｂ证实成功构建了ｍ质粒图２ＡＤＮＡｗ３ＴＧＣＢＤＮＡＣ１４Ｓｍ３ＴＣＴ图２３突变体Ｃ１４Ｓ位点测序图Ｆ２ＤＮＡｍ３Ｃ１４Ｓｍ３２ｍ３４ｍｘｍ５ｂｍ图１ｍＢｍＨⅠ和ＥＲⅠ酶切鉴定Ｆ１３ｍｍｗｂＢｍｈⅠ ＥＲⅠ ２重组质粒的鉴定用ＢｍｈⅠ和ＥＲⅠ 双酶切质粒的片段图１缺失体质粒测序结果释放约５ｂ证实成功构建了图３３ｍ重组质粒和重组质粒的鉴定Ｅ载体上有一个ＡＬⅠ位点距多克隆位点因１７ｂ片段上有一个ＡＬⅠ 位点距插入位点上ｂ用ＡＬⅠ单酶切Ｅ质粒被酶切成线游约３性而３ｍ均释放约２ｂ的片段图４４ｍ质粒在真核细胞中的表达检测分别用ｍ和质粒转染结肠癌细胞ＬＶ４８ｈ后收取细胞进行ＡＤＮＡｗ３ＴＧＣＴＧＣＧＴＴＡＴＧＢＤＮＡＣＡＡＸＣＡＡＸＴＡＧ３ＴＧＡ图３３ＣＡＡＸ缺失体测序图Ｆ３ＤＮＡｍ３ＣＡＡＸｍ

李伟军等５１９３基因Ｃ１４Ｓ位点突变体和ＣＡＡＸ缺失体的构建及表达细胞在转染Ｅ质粒后表达的绿色荧光蛋白在细胞内弥散分布转染３质粒后３绿色

分蛋白进入细胞核图６３２ｍ３４ｍｘｍ１８ｂｍ图４Ｅ３ｍＡＬⅠ酶切鉴定Ｆ４Ｅ３ｍｍｗｂａ

Ｅｘｍ３ＬＶＧＡＰＤＨｖ１２３３ｍ４图５ｍ和Ｖ细胞中的表达在ＬＦ５Ｅｘ３ｍｍＬＶＬＧＦＰ３ＬＶ

4 李伟军等５１９３基因Ｃ１４Ｓ位点突变体和ＣＡＡＸ缺失体的构建及表达细胞在转染Ｅ质粒后表达的绿色荧光蛋白在细胞内弥散分布转染３质粒后３绿色荧光融合蛋白主要分布于细胞内膜系统转染ｍ质粒后绿色荧光融合蛋白的分布没有显著影响而转染质粒后绿色荧光融合蛋白的分布发生明显改变大部分蛋白进入细胞核图６３２ｍ３４ｍｘｍ１８ｂｍ图４Ｅ３ｍＡＬⅠ酶切鉴定Ｆ４Ｅ３ｍｍｗｂａＬⅠ ５ｍ在真核细胞中的表达和分布检测分别用Ｅ３ｍ和Ｖ２４ｈ后细胞经固转染结肠癌细胞Ｌ定核染色在激光共聚焦扫描显微镜下观察可见Ｅｘｍ３ＬＶＧＡＰＤＨｖ１２３３ｍ４图５ｍ和Ｖ细胞中的表达在ＬＦ５Ｅｘ３ｍｍＬＶＬＧＦＰ３ＬＶＴｈｂｂｗＧＦＰ３ＧＦＰｍｂＧＦＰｍｍｍｍｂｍｈｍ图６Ｅ３ｍ和Ｖ细胞中的表达和定位在ＬＦ６ＥｘＥ３ｍｍＬＶ

5 520 北京大报 ( 医版 ) JOURNALOFPEKINGUNIVERSITY(HEALTHSCIENCES) Vol.41 No.5 Oct 讨论侵袭与转移是恶性肿瘤最显著的生物特征, 是导致癌症患者临床死亡的主要原因近年研究表明,PRL 3 在结直肠癌胃癌卵巢癌乳腺癌肝癌等多种肿瘤组织中过表达, 参与肿瘤发生发展, 促进肿瘤转移且与预后密切相关 [8-15], 但 PRL 3 的作用底物和分子机制仍不清楚有研究报道, 当 PRL 1 的第 104 位半胱氨酸突变为丝氨酸 (C104S) 时, 蛋白磷酸酶失活 [16-17] 通过对酪氨酸蛋白磷酸酶 PRL 3 的蛋白结构进行分析, 发现 PRL 3 第 104 位氨基酸半胱氨酸突变也可导致 PRL 3 失去磷酸酶活性, 与野生型 PRL 3 相比,PRL 3(C104S) 突变体促进细胞增殖和迁移的能力均降低, 并改变了 PRL 3 对下游信号分子的作用水平 [3,18] 因此, 在本研究室先前构建的野生型 PRL 3 质粒的基础上, 本研究构建了 PRL 3(C104S) 突变体质粒, 使 PRL 3 蛋白的磷酸酶作用失活, 与野生型 PRL 3 同时进行研究, 能更明确地说明 PRL 3 蛋白磷酸酶在肿瘤演变过程中发挥的作用蛋白结构分析显示,PRLs 家族的定位依赖于 C 端的 CAAX 位点异戊二烯化修饰, 当该位点修饰受阻时,PRL 3 蛋白从细胞内膜系统进入细胞核, 但关于此定位变化现象尚未见报道, 其与 PRL 3 蛋白功能间的联系也未知因此本研究构建了 pe PRL 3 m 和 pe PRL 3 质粒, 结合 pe PRL 3, 通过绿色荧光融合蛋白的表达观察其定位的变化, 可见 PRL 3 第 104 位半胱氨酸突变后对定位无影响, 当 PRL 3 的 C 端 CAAX 位点缺失后,PRL 3 蛋白由胞浆内膜系统大量入核, 与预测的 PRL 3 蛋白结构一致 PRL 3 这些重组体的构建表达为进一步探索 PRL 3 的分子功能解释 PRL 3 的分子作用机制提供了有力工具参考文献 [1] BeseteDC,QiuD,PalenCJ.PRLPTPs:mediatorsandmar kersofcancerprogresion[j].cancermetastasisrev,2008,27 (2): [2] KozlovG,ChengJ,ZiomekE,etal.Structuralinsightsintomo lecularfunctionofthemetastasis asociatedphosphataseprl 3 [J].JBiolChem,2004,279(12): [3] MaterWF,EstridgeT,ZhangC,etal.RoleofPRL 3,ahuman muscle specifictyrosinephosphatase,inangiotensin Ⅱ signaling [J].BiochemBiophysResCommun,2001,283(15): [4]CatesCA,MichaelRL,StayrookKR,etal.Prenylationofonco genichumanptp(caax)proteintyrosinephosphatases[j]. CancerLet,1996,110(1-2): [5] ZengQi,HongWanjin,TanYH.MousePRL 2andPRL 3,two potentialyprenylatedproteintyrosinephosphataseshomologousto PRL 1[J].Biochem BiophysResCommun,1998,244(2): [6]ZengQi,SiXiaoning,HorstmannH,etal.Prenylation dependent asociationofprotein tyrosinephosphatasesprl 1, 2,and 3 withtheplasmamembraneandtheearlyendosome[j].jbiol Chem,2000,275(28): [7]PengLirong,JinGenglin,WangLi,etal.Identificationofinte grinalpha1asaninteractingproteinofproteintyrosinephospha taseprl 3[J].BiochemBiophysResCommun,2006,342(1): [8] KatoH,SembaS,MiskadUA,etal.HighexpresionofPRL 3 promotescancercelmotilityandlivermetastasisinhumancolorec talcancer:a predictivemolecularmarkerofmetachronousliver andlungmetastases[j].clincancerres,2004,10(21): [9]MiskadUA,SembaS,KatoH,etal.ExpresionofPRL 3phos phataseinhumangastriccarcinomas:closecorelationwithinva sionandmetastasis[j].pathobiology,2004,71(4): [10] RadkeI,GoteM,KerstingC,etal.Expresionandprognostic impactoftheproteintyrosinephosphatasesprl 1,PRL 2,and PRL 3inbreastcancer[J].BrJCancer,2006,95(3): [11] SahaS,BardeliA,BuckhaultsP,etal.Aphosphataseasocia tedwithmetastasisofcolorectalcancer[j].science,2001,294 (5545): [12] PengLirong,NingJinying,MengLin,etal.Theasociationof theexpresionlevelofproteintyrosinephosphataseprl 3protein withlivermetastasisandprognosisofpatientswithcolorectalcan cer[j].jcancerresclinoncol,2004,130(9): [13] WangYing,LiZhaofa,HeJin,etal.Expresionofthehuman phosphatasesofregeneratingliver(prls)incolonicadenocarci nomaanditscorelationwithlymphnodemetastasis[j].intj ColorectalDis,2007,22(10): [14] MiskadUA,SembaS,KatoH,etal.HighPRL 3expresionin humangastriccancerisamarkerofmetastasisandgradesofmalig nancies:aninsituhybridizationstudy[j].virchowsarchiv, 2007,450(3): [15] LiZhengrong,WangZhao,ZhuBaohe,etal.Asociationoftyro sineprl 3phosphataseproteinexpresionwithperitonealmetasta sisofgastriccarcinomaandprognosis[j].surgtoday,2007,37 (8): [16] SunJinping,WangWeiqing,YangHeyi,etal.Structureandbio chemicalpropertiesofprl 1,aphosphataseimplicatedincel growth,diferentiation,andtumorinvasion[j].biochemistry, 2005,44(36): [17] BarfordD,FlintAJ,TonksNK.Crystalstructureofhumanpro teintyrosinephosphatase1b[j].science,1994,263(5152): [18] ZengQi,DongJingming,GuoKe,etal.PRL 3andPRL 1pro motecelmigration,invasion,andmetastasis[j].cancerres, 2003,63(11): ( 收稿 ) ( 本文编辑 : 任英慧 )

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽

李伟军, 等 PRL 3 基因 C104S 位点突变体和 CAAX 缺失体的构建及表达 517 报道 在我们的前期工作中, 本研究室已构建了 pcdna3 myc PRL 3(p PRL 3) pegfp PRL 3(pE PRL 3) 等质粒, 并对 PRL 3 的有关功能进行了研究, 结果显示,

李伟军, 等 PRL 3 基因 C104S 位点突变体和 CAAX 缺失体的构建及表达 517 报道在我们的前期工作中, 本研究室已构建了 pcdna3 myc PRL 3(p PRL 3) pegfp PRL 3(pE PRL 3) 等质粒, 并对 PRL 3 的有关功能进行了研究, 结果显示,