30 暨南大学学报 ( 自然科学与医学版 ) 第 37 卷 Hsp65 Esat6proteindetectedbyWestern bolthad75000kda.thehgm CSFmRNA expresionof HepG 2celstransfectedwithpIGM,pIHsp65GMan

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巫瞬儿温
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1 第 37 卷第 1 期暨南大学学报 ( 自然科学与医学版 ) Vol.37 No 年 2 月 JournalofJinanUniversity(NaturalScience&MedicineEdition) Feb 结核分枝杆菌 Hsp65 Esat6 与 hgm CSF 联合 DNA 疫苗的构建与体外研究王森林, 张梦媛, 王学坤, 周曙光, 江振友 ( 暨南大学医学院微生物学与免疫学教研室, 广东广州 ) [ 摘要 ] 目的 : 应用分子生物学技术, 构建 pihsp65 Esat6GM 共表达质粒, 并在真核细胞中表达. 方法 : 以 peghsp65esat 6 为模板经聚合酶链反应 (PCR) 扩增出 Hsp65 Esat6 基因, 同时从质粒 porf hgm CSF 中扩增出基因佐剂 hgm CSF, 分别克隆到真核表达载体 pires 的多克隆位点 A(MCSA) 和 B(MCSB) 中, 构建 pihsp65 Esat6GM 共表达质粒, 并转染 HepG 2 细胞中表达和检测. 结果 : 酶切鉴定提示插入的基因片段大小分别为 1 93kb 和 0 47 kb, 测序分析表明克隆的 Hsp65 Esat6 和人粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子 (hgm CSF) 序列与 GenBank 上公布序列完全一致 ;Western bolt 检测到 Hsp65 Esat6 融合蛋白相对分子质量 (M r ) 为 75000kDa;RT PCR 方法检测出 pigm,pihsp65gm 和 pihsp65 Esat6GM 转染组细胞均有 hgm CSFmRNA 表达, 三组细胞中 hgm CSF 基因 mrna 的表达量差异无统计学意义 (P>0 05).ELISA 方法检测到 pihsp65 Esat6GM 转染组细胞培养上清中 hgm CSF 的表达, 且与空载体对照组比较差异有统计学意义 (P<0 01). 结论 : 成功构建和表达了 pihsp65 Esat6GM 质粒, 为研制优于卡介苗 (BCG) 的新型抗结核病的 DNA 疫苗奠定了基础. [ 关键词 ] 热休克蛋白 65kd- 早期分泌性抗原靶 6kd; 人粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子 ; 双顺反子 ; 基因佐剂 [ 中图分类号 ] R [ 文献标志码 ] A [ 文章编号 ] (2016) doi: /j.jdxb ConstructionandprimarystudyofDNAvaccinecontainingHsp65 Esat6of mycobacterium tuberculosisandhgm CSFinvitro WANGSenlin, ZHANGMengyuan, WANGXuekun, ZHOUShuguang, JIANGZhenyou (DepartmentofMicrobiologyandImmunology,MedicalColege,JinanUniversity,Guangzhou510632,China) [Abstract] Aim:Toconstructandexprestheco expresionplasmidpihsp65 Esat6GM bymolecular biologicalmethods.methods:recombinedplasmidpeghsp65esat 6astemplatetoamplifyHsp65 Es at6geneandusedplasmidporf hgm CSFastemplatetoamplifygeneadjuvanthGM CSFgene(granu locyte macrophagecolony stimulatingfactor)bypcrwereused,andthenrecombinedthemwiththetwo multiplecloningsites(mcsaandmcsb)ofpiresvectortoconstructaco expresionplasmidpihsp65 Esat6GM.TheplasmidwasfinalytransfectedintoHepG 2celstodetecttheexpresionofHsp65 Esat6 andhgm CSFproteinsbyWestern boltandelisarespectively.results:restrictionenzymedigestion demonstratedthattheinsertedgenefragmentshad1 93kband0 47kb,DNAsequencingrevealedthat theclonedhsp65 Esat6andhGM CSFsequenceswereconsistentwiththeGenBankreported.The [ 收稿日期 ] [ 基金项目 ] 国家十二五科技重大专项 (2014ZX ;2012ZX ) [ 作者简介 ] 王森林 (1989-), 男, 研究方向 : 感染免疫通信作者 : 江振友, 男, 教授,Tel: ,E mail:tjzhy@jnu.edu.cn

2 30 暨南大学学报 ( 自然科学与医学版 ) 第 37 卷 Hsp65 Esat6proteindetectedbyWestern bolthad75000kda.thehgm CSFmRNA expresionof HepG 2celstransfectedwithpIGM,pIHsp65GMandpIHsp65 Esat6GMweredetectedbyRT PCR,the diferencesamongthreegroupsweren tstatisticalysignificant(p>0 05).hGM CSFexpresionfrom pihsp65 Esat6GM transfectedcelswasdetectedbyelisa,thediferencebetweenthepihsp65 Es at6gmgroupandthepiresblankvectorgroupwasstatisticalysignificant(p<0 01).Conclusion:The succesfulconstructionandexpresionofaco expresionvectorcontaininghsp65 Esat6geneandgene adjuvanthgm CSFarefulfiledwhichlaysafoundationforthefurtherresearchonanovelDNAvaccine thatisbeterthanbcgvaccineinthepreventionoftuberculosis. [Keywords] Hsp65 Esat6; hgm CSF; bicistronic; geneadjuvant 结核病 (tuberculosis,tb) 是由结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis,mtb) 感染引起的传染性疾病, 每年全球大约有一百五十万人死于结核病, 并且每年有接近九百万的新增病例 [1]. 卡介苗 (ba cilecalmete guerin,bcg) 是目前被广泛用于预防结核病的减毒活疫苗, 但其免疫效果仍不够满意 ; 而 DNA 疫苗制备简便免疫效果好, 已经成为结核病的热门侯选疫苗之一 [2]. 结核杆菌热休克蛋白 65kDa 基因 (heatshockprotein6kda,hsp65) 是研究最早的结核抗原之一, 可以在动物体内对结核分枝杆菌的感染产生强烈的保护性免疫反应 [3].Hsp65 具有载体分子效应和分子伴侣特性, 在 DC 中以 MHC I 类分子的途径呈递, 并可活化 DC 使之成为初始 CTL 的有效刺激剂 [4].Esat 6 是 MTB 培养早期分泌的相对分子质量为 6kDa 的早期分泌性抗原靶 (6kDaearlysecretoryantigenictarget,Esat 6), 可有效提高巨噬细胞对胞内结核杆菌的生长抑制作用和杀伤能力 [5]. 同时,Esat 6 具有丰富 T 细胞表位, 能诱导机体产生强烈的体液和细胞免疫应答 [6-7]. 粒细胞 - 吞噬细胞集落刺激因子 (granulocytemac rophagecolony stimulatingfactor,gm CSF) 作为良好的基因佐剂 (geneadjuvant), 可以利用其上调机体免疫水平的作用增强 DNA 疫苗的效能 [8-9]. 本组构建含结核杆菌 Hsp65 Esat6 和基因佐剂 hgm CSF 的双顺反子真核质粒, 为进一步了解该 DNA 疫苗的免疫效果奠定基础. 1 材料和方法 1.1 材料大肠杆菌 DH5α 载体 pires 重组质粒 pegh sp65 Esat6 和质粒 porf hgm CSF( 暨南大学医学院微生物学与免疫学教研室 );ExTaqDNA 聚合酶, T 4 DNA 连接酶, 限制性内切酶 NheI,mulI,XbaI 和 NotI,DL 1kbmarker,DL 300bpmarker, 质粒提取试剂盒,DNA 凝胶回收纯化试剂盒 ( 大连宝生物公司 ); 两对聚合酶链反应 (PCR) 引物目的基因的序列测定由上海生工生物工程公司完成 ; 转染试剂 Lipofectamine 2000 和配套液 Opti MEM(Invitrogen 公司 ); 鼠抗人 Hsp65,Esat6 蛋白单克隆抗体和人 hgm CSF 蛋白 ELISA 检测试剂盒 ( 深圳市晶美生物科技公司 ). 1.2 方法 (1) 目的基因 Hsp65 Esat6 和 hgm CSF 的 PCR 扩增以本实验室已构建的重组质粒 peghsp65 Esat6 为模板, 设计扩增 Hsp65 Esat6 引物序列如下 : 上游 P1:5 CGGCTAGCATGACAGAGCAGCAGT GGAA 3, 含 NheI 酶切位点和起始密码子, 下游为 : 5 GCACGCGTACCTATGCGAACATCCCAG 3, 含 muli 酶切位点和终止密码子. 反应体系为 50μL, 其中上下游引物各 1μL,dNTP3μL, 模板 DNA4 μl,10 ExTaqBufer5μL,Mgcl 2 3μL,ExTaq0 4 μl,ddh 2 O33mL. 反应条件为 :95 预变性 5min, 95 30s,57 30s,72 60s, 共 30 个循环,72 再延伸 10min. 扩增产物取 5μL 进行 10g/L 琼脂糖凝胶电泳, 确定扩增产物大小正确无误. 参照 GenBank 上人 GM CSF 基因 CDS 序列 (NCBI 登陆号 :M11220) 分别设计引物如下 : 上游引物 P3:5 CATCTAGAAAGGAGGGCCACCATGTG 3, 含 Xba I 位点和起始密码子 ATG; 下游引物 P4:5 ATGC GGCCGCTGTCGAGCTAGCGAATTC 3, 含 NotI 位点和终止密码子 TGA. 以载体 porf hgm CSF 为模板, 用引物 P3,P4 进行 PCR 扩增出 hgm CSF 基因. 反应条件为 :95 预变性 5min,95 30s,56 30 s,72 60s, 共 30 个循环,72 再延伸 10min. (2)pIHsp65 Esat6 真核载体的构建与鉴定将 Hsp65 Esat6 的 PCR 产物经过回收纯化后与载体

第１期王森林等结核分枝杆菌与ｈＧＭＣＳＦ联合ＤＮＡ疫苗的构建与体外研究ＩＲＥＳ同时用Ｎｈｅｉ和ｍｕｌｉ双酶切酶切后进行１０ｇＬ琼脂糖凝胶电泳并经过凝胶回收纯化试剂盒回收酶切产物将两者酶切纯化的产物按照３１的３１测序工作由上海生物工程公司完成３ＩＧＭ真核表达质粒的构建与鉴定同构建Ｉ载体方法一样将４ｈ

3 第１期王森林等结核分枝杆菌与ｈＧＭＣＳＦ联合ＤＮＡ疫苗的构建与体外研究ＩＲＥＳ同时用Ｎｈｅｉ和ｍｕｌｉ双酶切酶切后进行１０ｇＬ琼脂糖凝胶电泳并经过凝胶回收纯化试剂盒回收酶切产物将两者酶切纯化的产物按照３１的３１测序工作由上海生物工程公司完成３ＩＧＭ真核表达质粒的构建与鉴定同构建Ｉ载体方法一样将４ｈ转化用低摩尔比混合用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接２ｈｇｍＣＳＦ的ＰＣＲ产物经过回收纯化后与载体ＩＨＣｌｃｏｌｉｄｈ５α感受态细菌然后涂布温Ｃ２制备的ＥＩ和ＮｏＩ双酶切酶切产物ｓ同时用Ｘｂ于含氨苄青霉素５０μｇｍｌ的ＬＢ固体培养基中次经凝胶回收纯化后将两者酶切纯化的产物按照３日随机挑取１０个单菌落分别接种于３ｍＬ含氨苄１的摩尔比混合用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接２４ｈ然后青霉素的ＬＢ培养液中３７下１５０ｒｍｉｎ振荡培养转化感受态细菌Ｅｃｏｌｉｄｈ５α 涂布于含氨苄青霉素过夜先取少量菌液煮沸作为模板进行菌落ＰＣＲ检５０μｇｍｌ的ＬＢ固体培养基中次日随机挑取１０测是否有的存在将菌落ＰＣＲ筛选呈个单菌落分别接种于３ｍＬ含氨苄青霉素的ＬＢ培阳性的菌落用质粒提取试剂盒抽提质粒ＤＮＡ将提０ｒｍｉｎ振荡培养过夜将菌落养液中３７下１５取的质粒ＤＮＡ用ＮｈｅＩ和ｍｕｌｉ双酶切进行电泳ＰＣＲ筛选呈阳性的菌落用质粒提取试剂盒抽提质１ｋｂｍｒｋｅｒ为分子量参照将筛选出的检测以ＤＬＩ和ＮｏＩ双酶粒ＤＮＡ将提取的质粒ＤＮＡ用Ｘｂ阳性克隆产物的菌液进行测序鉴定测序采用Ｓｎ切进行电泳检测以ＤＬ１ｋｂｍｒｋｅｒ为分子量参ｇｅｒ双脱氧链终止法对插入序列的两端进行测定照将筛选出的阳性克隆产物的菌液进行测序鉴定图１ＩＧＭ质粒构建示意图Ｆｉｇ１ＣｏｎｓｒｕｃｉｏｎｏｆｌｓｍｉｄＩＧＭ

32 暨南大学学报 ( 自然科学与医学版 ) 第 37 卷 (4) 细胞转染转染前 1d 将 HepG 2 细胞传代接种在 6 孔板内, 细胞生长至 80% ~90% 时 ; 以 Op ti MEM 各 250μL 分别稀释 5μgpIHsp65 Esat6GM 质粒和 10μLLipofectamine 2000 转染 1 孔, 培养 6 h, 更换培养基.

4 32 暨南大学学报 ( 自然科学与医学版 ) 第 37 卷 (4) 细胞转染转染前 1d 将 HepG 2 细胞传代接种在 6 孔板内, 细胞生长至 80% ~90% 时 ; 以 Op ti MEM 各 250μL 分别稀释 5μgpIHsp65 Esat6GM 质粒和 10μLLipofectamine 2000 转染 1 孔, 培养 6 h, 更换培养基. (5)Hsp65 Esat6 蛋白在 HepG 2 细胞中的表达分别收集转染 48h 的 pihsp65 Esat6GM 转染组空质粒 pires 转染组以及未转染组, 用细胞裂解液处理, 离心后取上清, 采用 BCA(bicinchoninicacid) 法行蛋白定量, 采用 150g/L 十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE), 通过电转移法将蛋白转移至硝酸纤维素滤膜上, 用封闭液封闭后, 分别与 50g/L 脱脂奶粉稀释的鼠抗人 Hsp65 和的鼠抗人 Esat6 单克隆抗体结合 (4 振荡 1 5h), 再与的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体结合 ( 水平振荡摇床 1h), 经显色后照相. (6)RT PCR 检测 hgm CSF 表达 1 首先采用 TRIzol 一步法抽提各组 HepG 2 的 RNA, 溶于适量的去核酸酶水中, 应用 UV 1601 紫外分光光度仪测定细胞总 RNA 的产量和纯度,A260/280 比值 =1 6 ~2 0.2 逆转录过程总 RNA 溶液 5μg,Oligo1 μl,depc 水加至 11μL, 混匀,70 5min, 放置冰上至少 1min; 加入 10mmol/LdNTP2μL,5 RT bufer4μl,depc 水 1 5μL,RNA 酶抑制剂 0 5 μl, 轻柔混匀, 短暂离心,37 2min; 加入逆转录酶 1μL, 轻柔混匀,25 10min,37 60min, 70 10min, 标本进行荧光定量 PCR 或 -20 保存备用.3PCR 分别扩增 hgm CSF 和内参照 β ac tin, 反应体系均为 :5μL10 PCR Bufer;1μL dntp(10mmol/l); 引物各 1μL;1μLTaq 酶 ;36 μlddh 2 O;5μLCdna. 其中 β actin 引物序列为 : 上游 : 5 AACCCTAAGGCCAACAGTGAAAAG 3, 下游 :5 TCATGAGGTAGTCTGTGAGGT 3, 产物长度为 231bp, 反应条件 :94 预变性 5min,94 变性 45s,56 退火 30s,72 延伸 30s, 共 30 个循环. 4 结果判定标准参控品 1~5 管, 含量依次为 10 5 ~10 9 拷贝数 /ml, 测定阈值循环数 (Thresholdcycle, Ct), 以 Ct 值为横坐标,hGM CSFcDNA 含量为纵坐标, 电脑自动绘制标准曲线, 并根据此自动计算出各标本的 hgm CSF 含量.hGM CSFmRNA 表达量数据采用 cdna 含量 /β actin 含量的形式给出. (7) 酶联免疫吸附 (ELISA) 法检测 hgm CSF 蛋白表达水平分别收集 pires 和质粒 pihsp65 Es at6gm 转染 24h 和 48h 的 HepG 2 细胞的细胞培养的上清液, 采用 ELISA 双抗体夹心法检测 hgm CSF 蛋白的表达量, 按照试剂盒说明进行操作. 用酶标仪在吸光度 A450nm 下测定样品和试剂盒提供的标准品的 A 值. 根据标准品所测 A 值绘制的蛋白浓度与 A 值相关标准曲线计算各样品中 hgm CSF 蛋白的含量 ( 以空白孔调零 ). 1.3 统计学方法实验数据以 x±s 珋表示, 采用 SPSS13 0 软件包进行分析, 组间比较采用两样本 t 检验,P<0 05 具有统计学意义. 2 结果 2.1 Hsp65 Esat6 和 hgm CSF 基因 PCR 扩增产物电泳分析琼脂糖凝胶电泳显示,PCR 产物分别为 1 93 kb 和 0 47kb 的特异性片段, 与预期 Hsp65 Esat6 Esat6 和 hgm CSF 基因大小相符 ( 图 1). M:DNAmarker(DL1000);1:Hsp65 Esat6 Esat6PCR product;2: hgm CSFPCRproduct. 图 2 结核分枝杆菌 Hsp65 Esat6 及 hgm CSF 基因 PCR 产物结果 Fig.2 MycobacteriumtuberculosisHsp65 Esat6andhGM CSF genepcrproducts 2.2 重组质粒限制性内切酶消化鉴定质粒 pihsp65 Esat6 经 NheI 和 muli 双酶切后, 电泳可见大小约 6 1kb 与 1 93kb 两片段, 与载体 pires 经 NheI 和 muli 双酶切产物和 Hsp65 Es at6 基因 PCR 产物的 2 条特异性条带对比, 大小相符 ( 图 2). 重组质粒 pihsp65 Esat6GM 经 XbaI 和 NotI 双酶切后, 电泳可见大小约为 8 04kb 与 0 47 kb 两片段, 与质粒 pihsp65 Esat6 经 XbaI 和 NotI 双酶切产物和 hgm CSF 基因 PCR 产物的 2 条特异性条带对比, 大小相符 ( 图 2).

第 1 期王森林, 等 : 结核分枝杆菌 Hsp65 Esat6 与 hgm CSF 联合 DNA 疫苗的构建与体外研究 33 1-2:pIHsp65 Esat6GM transfected;m:proteinmarker. 图 5 Hsp65 Esat6 融合蛋白的 Western bolt 分析 Fig.

Esat6digestwithXbaIandNot I.;6:hGM CSFPCRproduct;7:DNAmarker(DL 300) 图 3 pihsp65 Esat6 和 pihsp65 Esat6GM 双酶切鉴定 Fig.3 IdentificationofpIHsp65 Esat6andpIHsp65 Esat6GM 2.

对质粒 pihsp65 Es at6gm 上的多克隆位点 B(multiplecloningsitesB, MCSB) 内的 DNA 序列进行序列分析鉴定, 结果与 hgm CSF 的基因序列完全相同. 2.

未转染组细胞中基本没有 hgm CSF 基因 mrna 的表达 ; 而转染重组质粒 pigm pihsp65gm 和 pihsp65 Esat6GM hgm CSF 基因 mrna 的表达量分别为 0 85±0 11 0 79±0 13 和 0 77±0 09.

5 第 1 期王森林, 等 : 结核分枝杆菌 Hsp65 Esat6 与 hgm CSF 联合 DNA 疫苗的构建与体外研究 :pIHsp65 Esat6GM transfected;m:proteinmarker. 图 5 Hsp65 Esat6 融合蛋白的 Western bolt 分析 Fig.5 AnalysisofHsp65 Esat6proteinbyWestern bolt 1:DNAmarker(DL 1000);2:pIHsp65 Esat6digestwithNheIand MulI;3:pIRESdigestwithNheIandMulI;4:pIHsp65 Esat6GMdi gestwithxbaiandnoti;5:pihsp65 Esat6digestwithXbaIandNot I.;6:hGM CSFPCRproduct;7:DNAmarker(DL 300) 图 3 pihsp65 Esat6 和 pihsp65 Esat6GM 双酶切鉴定 Fig.3 IdentificationofpIHsp65 Esat6andpIHsp65 Esat6GM 2.3 序列分析鉴定对质粒 pihsp65 Esat6 上的多克隆位点 A(mul tiplecloningsitesa,mcsa) 内的 DNA 序列进行序列分析鉴定, 结果与结核分支杆菌 H37Rv 株的 Hsp65 和 Esat 6 基因序列完全相同. 对质粒 pihsp65 Es at6gm 上的多克隆位点 B(multiplecloningsitesB, MCSB) 内的 DNA 序列进行序列分析鉴定, 结果与 hgm CSF 的基因序列完全相同. 2.4 Hsp65 Esat6 蛋白在 HepG 2 细胞中的表达 SDS PAGE 和 Western bolt 鉴定结果显示, 表达蛋白的 M r 为约 75000, 与预期结果相符 ( 图 4, 图 5). 2.5 hgm CSFmRNART PCR 检测 RT PCR 结果显示, 扩增片段大小分别为约 474 bp, 与预期结果相符 ( 图 6). 未转染组细胞中基本没有 hgm CSF 基因 mrna 的表达 ; 而转染重组质粒 pigm pihsp65gm 和 pihsp65 Esat6GM hgm CSF 基因 mrna 的表达量分别为 0 85± ±0 13 和 0 77±0 09. 结果经方差分析, 三种质粒转染 HepG 2 细胞 hgm CSF 基因 mrna 的表达量差异无统计学意义 (P>0 05), 表明 pires 载体上游多克隆位点插入的 Hsp65 Esat6 基因在转录表达时并没有影响下游多克隆位点 hgm CSF 基因的 mrna 表达. M:DNAmarker(DL 100);1:HepG 2celtransfectedwithpIGM;2: HepG 2celtransfectedwithpIHsp65GM;3:HepG 2celtransfected withpihsp65 Esat6GM;4:HepG 2celwithouttransfection. 图 6 hgm CSFRT PCR 分析 Fig.6 AnalysisofhGM CSFmRNAbyRT PCR 1-2:non transfected;3-4:pirestransfected;5:pihsp65 Esat6GM transfected;m:proteinmarker. 图 4 Hsp65 Esat6 融合蛋白的 SDS PAGE 分析 Fig.4 AnalysisofHsp65 Esat6proteinbySDS PAGE 2.6 ELISA 检测结果分析结果显示,ELISA 方法能够检测到 pihsp65gm 和 pihsp65 Esat6GM 转染组细胞培养上清中 hgm CSF 的表达, 与空载体对照组比较差异均有统计学意

6 34 暨南大学学报 ( 自然科学与医学版 ) 第 37 卷义 (P<0 01). 且 pihsp65gm 和 pihsp65 Esat6GM 转染组细胞培养上清中 hgm CSF 的表达量与 pigm 转染组比较, 差异无统计学意义 (P>0 05), 表明在 pires 载体上游多克隆位点插入克隆表达的 Hsp65 Esat6 融合蛋白的翻译过程并没有影响下游多克隆位点 hgm CSF 蛋白的表达量, 结果与 hgm CSFmRNA 表达情况一致, 见表 1. 表 1 pihsp65gm,pihsp65 Esat6GM 转染细胞上清中 hgm CSF 含量检测结果 Table1 DetectionofhGM CSF levelsin pihsp65gm, pihsp65 Esat6GM transfectedcelssupernatant ( x±s)/(ρg ml 珋 -1 ) 分组 24h 48h 空载对照组 pires 1.37± ±0.12 实验组 pigm ±5.46 1) ±4.91 1) pihsp65gm ±4.73 1)2) ±4.27 1)2) pihsp65esat6gm ±4.16 1)2) ±3.93 1)2) 1) 与 pires 组对照 (P<0 01);2) 与 pigm 组对照 (P>0 05) 3 讨论由于耐药株的增加, 多种药物联合治疗法已经受到严重挑战, 再加上治疗周期长和治疗费用高, 迫切需要采取预防措施来遏制疾病的传播. 目前使用卡介苗作为预防结核病的唯一疫苗, 但由于卡介苗作用不稳定, 在不同人群中的保护作用变化很大, 不能有效地预防结核病的传播, 甚至可能对机体有害 [10-11]. 因此, 研制更加有效的新型疫苗变得至关重要. 近年来融合 DNA 疫苗的出现, 使得人们能在细胞或机体内连续高效地表达同种或者异种的多个抗原, 最方便的多基因免疫方法就是分别免疫克隆有单个基因的质粒 DNA [12]. 而具有细胞内部核糖体进入位点 (IRES) 的双顺反子表达载体的出现, 使多基因免疫变得更加简单而高效. 有关研究报道, 在用不同的抗原免疫动物时, 使用双顺反子表达载体能降低 DNA 的用量而保持相同的免疫效果 [13]. 与以往结核 DNA 疫苗的研究比较, 本实验具有以下特点 :(1) 选用优势抗原的科学性,Hsp65 可以为抗结核杆菌感染提供稳定和可靠的基础免疫保护力 [14-16] ; 而 Esat 6 又是结核杆菌在反复传代制备 BCG 过程中缺失的抗原, 可能是导致 BCG 免疫效果不稳定的原因之一 [17-18] ; 故选择这两种抗原共同免疫以期获得更强的免疫效果.(2) 实现目的基因与细胞因子基因在同一载体上共同表达. 如果将 DNA 疫苗与编码 GM CSF 的质粒混合注射会对 DNA 疫苗的免疫效果产生干扰作用 ; 若将 GM CSF 与目的基因共同克隆到一个载体中, 由于两个基因具有相同的局部微环境, 往往可以获得较好的免疫效果 [19].(3) 使用载体 pires, 将融合抗原基因和 GM CSF 基因分别克隆到两个多克隆位点, 两者各自表达, 不相互影响两种蛋白表达的空间结构. 因为表达融合产物的 DNA 疫苗可能会破坏抗原的三维结构, 对抗体的生产不利 [20]. 经过实验, 本组成功的将两者同时克隆到同一载体上, 通过免疫组织化学染色法和 ELISA 分别检测到 Hsp65 Esat6 和 hgm CSF 蛋白的表达, 下一步将深入研究该 DNA 疫苗在体内的免疫保护效果以及 hgm CSF 协同 Hsp65 Esat6 抗原产生免疫应答的分子机制. [ 参考文献 ] [1] WHO.GlobalTuberculosisReport2014[R].Geneva: WHO/IUATLD,2014. [2] MUSTAFAAS.Developmentofnewvaccinesanddiag nosticreagentsagainsttuberculosis[j].molecularim munology,2002,39(1-2): [3] BAEKKM,KOSY,LEEM,etal.Comparativeanaly sisofefectsofcytokinegeneadjuvantsondnavaccina tionagainstmycobacterium tuberculosisheatshockpro tein65[j].vaccine,2003,21(25-26): [4] CHOBK,PALLISERD,GUILLENE,etal.APro posedmechanism fortheinductionofcytotoxictlym phocyteproductionbyheatshockfusionproteins[j]. Immunity,2000,12(3): [5] CLARICEA,KRISTAEM,DANIELYG,etal.Mono kineinducedbyinterferongammaandifn responsetoa fusionproteinofmycobacteriumtuberculosisesat 6and CFP 10inBraziliantuberculosispatients[J].Microbes andinfection,2006,8(1): [6] RAIRC,DWIVEDIVP,CHATTERJEES,etal.Early secretoryantigenictarget 6ofMycobacterium tuberculo sis:enigmaticfactorinpathogen hostinteractions[j]. MicrobesandInfection,2012,14(13): [7] YANGJie zuan,xukai jin,zhengjian fang,etal. LimitedTcelreceptorbetavariablerepertoireresponses toesat 6andCFP 10insubjectsinfectedwithMycobac teriumtuberculosis[j].tuberculosis(edinb).2013,93 (5): [8] QIU Jian tai,chang Ting chang,lin Cheng tao,et

7 第 1 期王森林, 等 : 结核分枝杆菌 Hsp65 Esat6 与 hgm CSF 联合 DNA 疫苗的构建与体外研究 35 al.novelcodon optimizedgm CSFgeneasanadjuvant toenhancetheimmunityofadnavaccineagainsthiv 1 Gag[J].Vaccine,2007,25(2): [9] ZHANGX,MAZIARD,PATRICIAN,etal.Intramus cularimmunizationwithamonogenicplasmiddnatuber culosisvaccine:enhancedimmunogenicitybyelectropo rationandco expresionofgm CSFtransgene[J].Vac cine,2007,25(7): [10] BREWER T F. Preventing tuberculosiswith bacilus Calmete Guerinvaccine:ameta analysisofthelitera ture.clinicalinfectiousdiseases.2000,31(3):s64- S67. [11]SHINAR,LEEKS,LEEJS,etal.Mycobacteriumtu berculosishbha proteinreactsstronglywiththeserum immunoglobulinm oftuberculosispatients[j].clinical andvaccineimmunology,2006,13(8): [12]MANOJS,BABIUKALA,HURKASDL.Immuniza tionwithadicistronicplasmidexpresingatruncatedform ofbovineherpesvirus 1glycoproteinDandtheamino ter minalsubunitofglycoproteinbresultsinreducedgb spe cificimmuneresponses[j].virology,2003,313(1): [13]KIRCHHOFFS,KOSTERM,WIRTHM,etal.Identifi cationofmammaliancelclonesexhibitinghighlyregula tedexpresionfrom induciblepromoters[j].trendsin Genetics,1995,11(6): [14] YOSHIDAS,TANAKAT,KITAY,etal.DNAvaccine usinghemagglutinatingvirusofjapan liposomeencapsula tingcombinationencodingmycobacterialheatshockpro tein65andinterleukin 12confersprotectionagainstMy cobacteriumtuberculosisbytcelactivation[j].vac cine,2006,24(8): [15] SECHILA,MARAL,CAPPAIP,etal.Immunization withdnavaccinesencodingdiferentmycobacterialanti genselicitsath1typeimmuneresponseinlambsand protectsagainstmycobacterium avium subspeciesparatu berculosisinfection[j].vaccine,2006,24(3): [16] OKADAM,KITAY,NAKAJIMAT,etal.Evaluationof anovelvaccine(hvj liposome/hsp65 DNA +IL 12 DNA)againsttuberculosisusingthecynomolgusmonkey modeloftb[j].vaccine,2007,25(16): [17] KHERAA,SINGHR,SHAKILAH.,etal.Elicitation ofeficient,protectiveimmuneresponsesbyusingdna vaccinesagainsttuberculosis[j].vaccine,2005,23(48-49): [18] BRODINP,ROSENKRANDSI,ANDERSENP,etal. ESAT 6proteins:protectiveantigensandvirulencefactors [J].TrendsinMicrobiology,2004,12(11): [19] 李忠明. 当代新疫苗 [M]. 北京 : 高等教育出版社, 2001: LIZhong ming.a New GenerationOfVaccine[M]. Beijing:HigherEducationPres,2001: [20]HILDEGUNDCJ.DNAVaccine[M].TranslatedbyLi QH,LiuLD,CheY C,Beijing:ChemistryIndustry Pres,2005: [21]LOZESE,HUYGENK.,DENISO,etal.Immunogenici tyandeficacyofatuberculosisdna vaccineencoding thecomponentsofthesecretedantigen85complex[j]. Vaccine,1997,15(3-4): [22]SHABIRAM,INDUV,SADHNAS.Immunotherapeutic potentialofrecombinantesat 6proteininmousemodel ofexperimentaltuberculosis[j].immunologyleters, 2014,158(1-2): [ 责任编辑 : 陈咏梅 ]

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽