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雹阙
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Vol.9 No.3 2016 年 2 月 February 2016 酿酒酵母 GPD2 基因沉默表达载体的构建王斌 1, 苏秋琼 1, 冯佳乐 1, 叶晓丹 1, 薛婷 1, 陈由强 (1. 福建师范大学生命科学学院, 福州 350117; 2.

1 Vol.9 No 年 2 月 February 2016 酿酒酵母 GPD2 基因沉默表达载体的构建王斌 1, 苏秋琼 1, 冯佳乐 1, 叶晓丹 1, 薛婷 1, 陈由强 (1. 福建师范大学生命科学学院, 福州 ; 2. 福建师范大学福建省发育与神经生物学重点实验室, 福州 ) 1, 2* 摘要 : 根据 5 -UTR 的二级结构能够阻碍基因转录的原理, 以 PCR 方法为基础获得酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)gpd2 基因 5 -UTR 的反义 RNA 片段 SGPD2 基因沉默片段通过限制性内切酶的酶切和 T4 连接酶的连接, 将 SGPD2 基因片段与本实验室保存酿酒酵母表达载体 pupst 构建 GPD2 基因的沉默表达载体 pupt-sgpd2, 为下一步构建能够提高乙醇产量的酿酒酵母 GPD2 沉默菌株的研究奠定基础关键词 : 分子生物学 ; 反义 RNA;3- 磷酸甘油脱氢酶 ;GPD2 基因 ; 酿酒酵母中图分类号 :Q939.5 文献标识码 :A 文章编号 : (2016) Constructing GPD2 gene silencing expression vector for Saccharomyces cerevisiae WANG Bin 1, SU Qiuqiong 1, FENG Jiale 1, YE Xiaodan 1, XUE Ting 1, CHEN Youqiang 1, 2 (1. College of Life and Science, Fujian Normal University, Fuzhou , China; 2. Key Laboratory of Developmental and Neural Biology, Fujian Normal University, Fuzhou , China) Abstract: According to the principle of the 5 -UTR of secondary structure hindering gene transcription, we constructed antisense RNA gene silencing fragment SGPD2 for Saccharomyces cerevisiae GPD2 gene 5'-UTR based on the method of PCR.Expression vector pupst of S. cerevisiae was preserved in our laboratory. We built GPD2 gene silence express carrier pupt-sgpd2, with SGPD2 gene fragments and S. cerevisiae expression vector pupst by restriction enzymes enzyme digestion and T4 ligase connection. The construction of pupt-sgpd2 gene silence express vector provided the foundation for the ethanol production of S. cerevisiae GPD2 silence strains research. Key words: molecular biology; antisense RNA; 3-phosphate glycerol dehydrogenase; GPD2 gene; Saccharomyces cerevisiae 0 引言当今社会能源危机日益加剧, 能源问题已逐渐成为威胁世界和平与发展的首要问题可再生能源的开发和利用, 正日益受到世界各国的极力关注燃料乙醇是在产业规模方面发展最快的一种生物质能 (biomass energy), 具有辛烷值高抗爆性好可再生和污染小等特点 [1] 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 是乙醇发酵的主要菌株 [2], 利用基因工程的方法对酿酒酵母进行改造, 获得乙醇产量高的菌株对乙醇的工业生产具有重大的现实意义在酿酒酵母的发酵过程中, 与甘油代谢途径相关的 3- 磷酸甘油脱氢酶主要是由 GPD1 和 GPD2 基因编码 [3], 因此通过沉默 GPD2 基因的表达可以抑制酿酒酵母代谢过程中甘油的合成, 从而提高酿酒酵母合成乙醇的能力研究利用 5 -UTR 二级结构能够阻碍基因转录基金项目 : 现代农业产业技术体系建设专项资金 (CARS-20) 作者简介 : 王斌 (1989 ), 男, 硕士研究生, 主要研究方向 : 应用微生物与发酵技术通信联系人 : 陈由强, 教授, 主要研究方向 : 植物生理学与分子生物学. yqchen@fjnu.edu.cn

2 2016 年 2 月中国科技论文在线精品论文 214 的原理 [4~6], 以 PCR 方法为基础获得 GPD2 基因 5 -UTR 的反义 RNA 片段 SGPD2, 然后与本实验室构建的酵母表达载体 pupst 通过基因工程的方法构建 GPD2 基因的沉默表达载体 pupt-sgpd2, 为构建酿酒酵母 GPD2 沉默菌株做准备 1 材料与方法 1.1 材料菌种与质粒工业酿酒酵母 Y01 和大肠杆菌 DH5α 由农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室保存 pug6 质粒载体由福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心惠赠 pupst 质粒载体经农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室由 pug6 质粒改造获得并保存质粒 pupst 携带两端带有 LoxP 位点的 kanmx 基因, 对遗传霉素 G418 具有抗性作用 pmd19-t Simple Vector 购于 TaKaRa 公司质粒 pupst 和 pmd19-t 均携带 Amp 抗性基因, 对氨苄青霉素有抗性作用酶与试剂限制性内切酶 Kpn I Sph I,Ex Taq 酶,T4 DNA 连接酶购于 TaKaRa 公司质粒小提试剂盒购于天根生物科技有限公司, 凝胶纯化试剂盒购于 Promega 公司, 氨苄青霉素购于索莱宝科技有限公司 PCR 扩增引物由生工生物工程股份有限公司合成,DNA 测序由铂尚生物技术有限公司完成 YPD 培养基 : 酵母提取物 10 g/l, 葡萄糖 20 g/l, 蛋白胨 20 g/l,ph 值自然, Pa,121 灭菌 20 min. 配置固体 YPD 培养基, 额外添加琼脂粉 20 g/l 即可 LB 培养基 : 酵母提取物 5 g/l, 蛋白胨 10 g/l, 氯化钠 10 g/l,ph 值自然, Pa,121 灭菌 20 min. 配置固体 LB 培养基, 额外添加琼脂粉 20 g/l 即可 1.2 方法引物设计通过 GenBank 数据库获得酿酒酵母 3- 磷酸脱氢酶 GPD2 基因及其上下游序列, 根据 5 -UTR 序列从转录起始位点开始到翻译起始位点结束, 转录起始位点上游 25~ 35 bp 存在人 TATA 盒 CCAAT 框等启动子结构, 通过 Tblastx 即可确定 GPD2 基因的 5 -UTR 的序列根据 BONOLI 等 [7] 5 -UTR 反义 RNA 设计原则, 设计 GPD2 基因 5 -UTR 反义 RNA 沉默组件 SGPD2, 然后根据沉默组件 SGPD2 的理表 1 SGPD2 扩增引物 Tab.1 Amplification primer for SGPD2 论序列利用 Primer Premier 5.0 软件进行引物设名称引物序列 5 3 酶切位点计并添加酶切位点和保护碱基, 如表 1 所示 S1 CGGGGTACCTGATAAGGAAGGGGAGCGAAGG Kpn I 沉默组件扩增 S2 ACATGCATGCTGGGTTGCTGAGGGGAAGAGTG Sph I 以酿酒酵母 Y01 的基因组 DNA 为模板, 用 Ex Taq 高保真酶以 S1 S2 为上下游扩增引物, 以 10 μl 反应体系加入 PCR 各反应试剂, 然后按照下列程序进行 PCR 扩增反应 : 预变性,95 (5 min); 变性,95 (30 s) 退火,60 (30 s) 30 个循环 ; 延伸,72 (30 s)

3 Vol.9 No. 3 February 2016 王斌等 : 酿酒酵母 GPD2 基因沉默表达载体的构建 215 延长,72 (10 min). 扩增反应结束后, 取 3 μl 于 1% 琼脂糖凝胶进行电泳检测沉默组件克隆与测序以 50 μl 体系进行 PCR 扩增反应, 用凝胶纯化试剂盒进行回收纯化获得沉默组件 SGPD2, 然后按照 pmd19-t 载体连接试剂盒的说明将 SGPD2 基因片段与 pmd19-t simple vector 于 16 过夜连接进行 TA 克隆热激法转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞 [8], 涂布于加有氨苄青霉素的 LB 平板,37 恒温培养至长出单克隆挑取阳性克隆子进行菌落 PCR 验证, 选择正确转化的阳性克隆子接种于 LB 液体培养基中摇菌提取质粒 pmd19-sgpd2, 送往铂尚生物技术有限公司对沉默组件 SGPD2 进行测序验证质粒 pupst 提取与验证取超低温保存的带有质粒 pupst 的大肠杆菌 DH5α, 活化并扩大培养, 用天根生物科技有限公司的质粒小提试剂盒提取质粒 pupst, 然后用限制性内切酶 Kpn I 和 Sph I 对质粒 pupst 进行单酶切和双酶切验证, 获取所要的质粒 pupst 沉默表达载体 pupt-sgpd2 的构建分别用限制性内切酶 Kpn I 和 Sph I 对质粒 pupst 和质粒 pmd19-sgpd2 进行双酶切, 然后凝胶纯化回收 SGPD2 和 pupt 两个基因片段用 T4 连接酶将 SGPD2 片段和 pupt 片段过夜连接, 完成沉默表达载体 pupt-sgpd2 的构建沉默表达载体 pupt-sgpd2 的构建示意图如图 1 所示将质粒载体 pupt-sgpd2 Fig. 1 图 1 沉默表达载体 pupt-sgpd2 的构建示意图 Construction of the silencing expression vector pupt-sgpd2

4 2016 年 2 月中国科技论文在线精品论文 216 用热激法转化大肠杆菌 DH5α, 涂布含氨苄青霉素的 LB 平板挑阳性单克隆进行菌落 PCR 鉴定提取质粒 pupt-sgpd2, 进一步做质粒 PCR 和酶切鉴定 2 结果与分析 2.1 沉默组件 SGPD2 扩增根据酿酒酵母 GPD2 基因 5 -UTR 序列设计引物 S1 S2, 以酿酒酵母 Y01 基因组 DNA 为模板,PCR 扩增获得基因沉默组件 SGPD2. 琼脂糖凝胶进行电泳检测结果如图 2 所示, 电泳条带表明目的片段大小符合预设计的 SGPD2 基因片段的大小 329 bp. 2.2 沉默组件 SGPD2 测序将 SGPD2 基因片段与 pmd19-t simple vector 于 16 过夜连接, 挑取 TA 克隆的阳性克隆子摇菌, 用质粒小提试剂盒提取质粒 pmd19-sgpd2, 送铂尚生物技术有限公司测序测序结果如图 3 所示, 下划线部分为 SGPD2 基因片段测序结果, 与 GenBank 中 GPD2 基因的 5 -UTR 序列比对完全相符, 说明完成了沉默组件 SGPD2 的克隆注 :M 为 DL2 000 DNA Marker;1 2 为 SGPD2 基因片段,329 bp 图 2 SGPD2 基因片段扩增电泳 Fig. 2 Electrophoresis of amplification of gene SGPD2 图 3 SGPD2 基因片段测序结果 Fig. 3 Sequencing results of gene SGPD2 2.3 质粒 pupst 酶切验证使用质粒小提试剂盒提取质粒 pupst 后, 用限制性内切酶 Kpn I 和 Sph I 对质粒 pupst 进行单酶切和双酶切验证分别进行琼脂糖凝胶电泳检测, 质粒 pupst 单酶切电泳结果如图 4 所示, 质粒 pupst 双酶切电泳结果如图 5 所示, 结果说明得到所需要的质粒 pupst. 2.4 沉默表达载体 pupt-sgpd2 鉴定用 T4 连接酶将 SGPD2 和 pupt 两个基因片段连接, 完成沉默表达载体 pupt-sgpd2 的构建用引物 S1 和 S2 进行 PCR 扩增, 并用限制性内切酶 Kpn I 和 Sph I 对质粒 pupt-sgpd2 进行单酶切和双酶切鉴定分别进行琼脂糖凝胶电泳检测, 质粒 pupt-sgpd2 电泳结果如图 6 所示,PCR 扩增电泳结果如图 7 所示, 质粒 pupt-sgpd2 单酶切和双酶切电泳结果如图 8 所示, 结果说明成功得到沉默表达载体 pupt-sgpd2.

000 DNA Marker 1 2 为 Sph I 单酶切 3 4 为 Kpn I 单酶切 Sph I Kpn I 双酶切 pupt-sgpd2 5 373 bp 图4 质粒 pupst 单酶切电泳 Fig.

5 Electrophoresis of plasmid pupst digested by double enzyme 图6 Fig.

2 为 Sph I Kpn I 双酶切扩增产物 329 bp 3 4 为 Sph I 单酶切 5 6 为 Kpn I 单酶切图7 Fig.

8 Electrophoresis of plasmid pupt-sgpd2 digested by restriction digestion 结论本研究根据基因 5'-UTR 的反义 RNA 序列能够与 mrna 特异性地互补结合

5 Vol.9 No. 3 February 2016 王斌等酿酒酵母 GPD2 基因沉默表达载体的构建 217 注 M 为 DL DNA Marker 1 2 为注 M 为 DL DNA Marker 1 2 为注 M 为 DL DNA Marker 1 2 为 Sph I 单酶切 3 4 为 Kpn I 单酶切 Sph I Kpn I 双酶切 pupt-sgpd bp 图4 质粒 pupst 单酶切电泳 Fig. 4 Electrophoresis of plasmid pupst digested by single enzyme 质粒 pupst 双酶切电泳 Fig. 5 Electrophoresis of plasmid pupst digested by double enzyme 图6 Fig. 6 质粒 pupt-sgpd2 电泳 Electrophoresis of plasmid pupt-sgpd2 注 M 为 DL DNA Marker 1 2 为 PCR 注 M 为 DL DNA Marker 1 2 为 Sph I Kpn I 双酶切扩增产物 329 bp 3 4 为 Sph I 单酶切 5 6 为 Kpn I 单酶切图7 Fig. 7 3 图5 PCR 扩增产物电泳 Electrophoresis of PCR product 图8 质粒 pupt-sgpd2 限制性内切酶酶切产物电泳 Fig. 8 Electrophoresis of plasmid pupt-sgpd2 digested by restriction digestion 结论本研究根据基因 5'-UTR 的反义 RNA 序列能够与 mrna 特异性地互补结合形成双链 RNA 的结果由于核糖体不能翻译双链 RNA 即抑制了该 mrna 的翻译利用基因 5'-UTR 反义 RNA 沉默的原理以 PCR 为基础获得 SGPD2 沉默片段用基因工程的限制性内切酶和连接酶成功构建了酿酒酵母 GPD2 基因沉默表达载体质粒载体 pupst 是经酿酒酵母穿梭载体 pug6 改造得来载体 pupst 与 pug6 一样属于非整合型载体含有多个克隆位点便于外源片段的插入可以用于酿酒酵母体内重组蛋白的表达载体 pupst 保留了 pug6 原有的 kanmx 基因和氨苄青霉素抗性基因并且插入了基因表达的强启动子 PGK 和终止子 CYC1. 将载体 pupst 内原有的 SPT8 基因用限制性内切酶切除然后在启动子和终止子之间插入 SGPD2 沉默片段经酶切和序列分析可以实现本研究已成功构建了酿酒酵母 GPD2 基因的沉默表达载体 pupt-sgpd2 可以进一步进行转化酿酒酵母及基因表达的研究

6 2016 年 2 月中国科技论文在线精品论文 218 [ 参考文献 ] (References) [1] 夏训峰, 张军, 席北斗. 基于生命周期的燃料乙醇评价及政策研究 [M]. 北京 : 中国环境科学出版社,2012. XIA X F, ZHANG J, XI B D.The research based on the evaluation of the life cycle of fuel ethanol and policy research[m]. Beijing: China Environmental Science Press, (in Chinese) [2] 郭晓贤, 宋浩雷, 江贤章, 等. ADH2 等位基因缺失的酿酒酵母杂合子的构建 [J]. 中国医药研究与临床,2006,4(9):7-11. GUO X X, SONG H L, JIANG X Z, et al. Construction of a Saccharomyces cerevisiae heterozygote strain with an ADH2 allele deletion[j]. China s Research and Clinical Medicine, 2006, 4(9): (in Chinese) [3] ALBERTYN J, van TONDER A, PRIOR B A. Purification and characterization of glycerol-3-phosphate dehydrogenase of Saccharomyces cerevisiae[j]. FEBS Letters, 1992, 308(2): [4] RINGNÉR M, KROGH M. Folding free energies of 5 UTRs impact post-transcriptional regulation on a genomic scale in yeast[j]. PLoS Comput. Biol., 2005, 1(7): e72. [5] 林燕环. 反义 RNA 技术干扰酿酒酵母乙醇脱氢酶 II 基因的研究 [D]. 福州 : 福建师范大学,2012. LIN Y H. The study of alcohol dehydrogenase II gene interference in Saccharomyces cerevisiae through antisense RNA technology[d]. Fuzhou: Fujian Normal University, (in Chinese) [6] PICKERING B M, WILLIS A E. The implications of structured 5 untranslated regions on translation and disease[j]. Seminars in Cell & Developmental Biology, 2005, 16(1): [7] BONOLI M, GRAZIOLA M, POGGI V, et al. RNA complementary to the 5 UTR of mrna triggers effective silencing in Saccharomyces cerevisiae[j]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2006, 339(4): [8] 萨姆布鲁克 J, 拉塞尔 D W. 分子克隆实验指南 [M]. 3 版. 北京 : 科学出版社,2002. SAMBROOK J, RUSSELL D W.Molecular cloning experiment guide[m]. 3rd ed. Beijing: Science Press, (in Chinese)

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽