应用文献 Liquid Chromatography / Mass Spectrometry 作者 : Avinash Dalmia PerkinElmer Inc. Shelton, CT UPLC MS/MS 测定牛奶中多种抗生素药物残留量简介抗生素曾被广泛用于兽药生产中, 用于预防和治

Size: px

Start display at page:

Download "应用文献 Liquid Chromatography / Mass Spectrometry 作者 : Avinash Dalmia PerkinElmer Inc. Shelton, CT UPLC MS/MS 测定牛奶中多种抗生素药物残留量简介抗生素曾被广泛用于兽药生产中, 用于预防和治"

帝咸
4 years ago
Views:

1 应用文献 Liquid Chromatography / Mass Spectrometry 作者 : Avinash Dalmia PerkinElmer Inc. Shelton, CT UPLC MS/MS 测定牛奶中多种抗生素药物残留量简介抗生素曾被广泛用于兽药生产中, 用于预防和治疗疾病及促生长剂等抗生素的滥用最终导致牛奶肉类等动物源性食品中抗生素残留量严重超标, 对人们健康带来风险抗生素的残留会导致毒副反应, 例如过敏反应皮疹和恶心另外, 长期摄入抗生素残留的食品, 会导致抗药性细菌的传播因此, 世界各国都实施了动物抗生素使用法规例如, 欧盟和加拿大制定了食品中药物最高残留量 (MRL), 美国将其称为耐受水平法规规定牛奶中抗生素残留种类包括磺胺类 β- 内酰胺类氟喹诺酮类大环内酯和四环素本文中牛奶里各类抗生素的限量如表 1 所示

2 2 本文建立了牛奶中抗生素多残留的 LC/MS/MS 测定方法抗生素种类包括环丙沙星环丙沙星氧氟沙星青霉素 G 氯唑西林替米考星泰乐菌素红霉素磺胺二甲嘧啶磺胺甲恶唑磺胺二甲氧嘧啶四环素和金霉素以及两种同位素内标为环丙沙星 -d8 和氟尼辛 -d3 采用改良的 QuEChERS 方法对牛奶中抗生素进行提取本方法具有良好的线性, 高灵敏度回收率稳定重现性高和特异性强的特点, 满足世界各国监管机构规定的牛奶中抗生素类残留限量的要求表 1- 牛奶中的不同类抗生素清单及耐受限值化合物抗生素种类耐受水平磺胺二甲嘧啶磺胺甲恶唑磺胺地索辛 f 替米考星泰乐菌素红霉素青霉素 G 磺胺类磺胺类磺胺类大环内酯类大环内酯类大环内酯类 β- 内酰胺 β- 内酰胺氟喹诺酮氟喹诺酮氟喹诺酮四环素四环素 10 ng/ml b 10 ng/ml b 10 ng/ml b 100 ng/ml c 50 ng/ml 50 ng/ml 5 ng/ml 10 ng/ml 5 ng/ml d 5 ng/ml d 5 ng/ml d 300 ng/ml e 300 ng/ml e a US FDA/CFSAN 中规定的牛奶中耐受或安全残留限值 1 b 所列为安全残留量而不是耐受量 c 牛奶中没有规定耐受量 ; 本方法将其规定为 100ng/mL( 肌肉内耐受量 ) d 未规定耐受或安全水平, 本方法设定为 5ng/mL e 耐受量包括各个抗生素的残留量以及总残留量, 本方法设定各为 100ng/mL f 禁止对奶牛使用除标示外的磺胺类药物 ( 磺胺地索辛除外 )1 实验方法仪器设备 Perkinelmer Altus UPLC 液相系统, 含 Altus A-30 溶剂管理模块样品管理器和柱温箱质谱仪 : Perkinelmer QSight 210 三重四极杆质谱仪 Simplicity 3Q 软件平台控制所有仪器采集和处理数据方法参数液相色谱方法以及质谱离子源参数见表 2 溶剂标准物及样品前处理所用的溶剂试剂和稀释液纯度均为 LC/MS 级抗生素标准物购自 Sigma-Aldrich 公司, 并于 4 冰箱中保存除了 β- 内酰胺类使用水作为溶剂外, 其余抗生素均使用甲醇配制溶液 β- 内酰胺类标准溶液需保存于塑料瓶中, 其余抗生素类标准溶液可保存在塑料或玻璃瓶中从 C18 净化剂购于 Supelco 公司所有母液和工作标准溶液均冷藏保存, 并使用 2mL 的棕色进样小瓶, 以防止化合物降解同位素内标的使用 : 环丙沙星 -d8 用于氟喹诺酮, 磺胺类和四环素类, 氟尼辛 -d3 用于大环内酯和 β- 内酰胺类表 2-LC 方法和 MS 源参数 LC 条件 PerkinElmer Brownlee SPP C 色谱柱 : μm mm( 产品编号 :N ) 溶剂 A: 水 ( 含 5mM 甲酸铵,0.1% 甲酸 ) 溶剂 B:95% 乙腈 /5% 甲醇 ( 含 0.1% 甲酸 ) 时间 ( 分钟 ) %A %B 曲线流动相 : 分析时间 : 12 分钟, 100% B 冲洗色谱柱,3 分钟 ; 重新平衡色谱柱时间 :4.2 分钟流速 : 0.4 ml/min 压力 : 4200 psi/285 bar ( 最大压力 ) 柱温 : 进样体积 : 30 ºC 10 µl 样品管理器温度 : 7 ºC MS 条件电离模式 : 电喷雾, 正离子模式干燥气体 ( 氮气 ) 设置 : 75 HSID 温度 : 320 电喷射电压 : 5500V 离子源温度 : 425 雾化气体 ( 氮气 ) 设置 : 175 检测模式 : MRM 扫描模式采用当地市场购得有机牛奶作为空白样品, 并对不同脂肪含量的 5 种牛奶样品进行抗生素残留检测采用简单改良过 QuEChERS 前处理方法 2,3 具体步骤如下 :(1) 往 5mL 空白有机牛奶 ( 已添加标准, 浓度为 15ng/mL) 中加入 20mL 有机溶剂 ( 甲醇或乙腈 ); (2) 涡旋混匀 1min, 置于 7800rpm 下离心 10min; (3) 移取上清液, 加入 1.2mg 的 C18 净化剂, 用于除去脂肪 ;(4) 涡旋 5min,7800rpm 下离心 5 分钟 ;(5) 提取 12.5mL 上清液, 于 40 用氮气吹至 1.5-2mL; (6) 用 15% 甲醇水溶液定容至 2.5mL, 涡旋混匀 ; (7) 过 0.22µm PVDF 微孔滤膜本实验采用基质匹配标准曲线进行定量分析, 待上述步骤 7 完成后在进行基质配标及添加内标, 基质标准曲线范围在 0.1ng/ ml-1000ng/ml, 每个浓度点重复进样 5 次, 进行精密度实验

3 质谱参数优化本实验研究的目标化合物均采用正离子模式的电喷雾模式检测采用蠕动泵和液相色谱仪相结合, 以三通连接的方式来优化质谱参数 : 如气体流量离子源温度以及离子源的位置蠕动泵以 10µL/min 的流速将 0.5μg/mL 磺胺甲嘧啶注入质谱, 液相色谱仪以 0.5mL/min 的流速, 溶液为乙腈水溶液 (V/V, 10/90, 含 0.1% 甲酸,5mM 甲酸铵 ) 注入质谱中每个化合物均采用浓度为 0.5μg/mL 来优化碰撞能量 Q1 和 Q3 的分辨率为 0.7amu 各个化合的质谱参数详见表 3, 每个化合物均采集 3 对 MRM 离子对, 以降低假阳性或假阴性结果结果与讨论按照上述确定的实验方法进行测试, 各各个抗生素的校准曲线相关系数及 LOQ 见表 4 各个抗生素的 LOQ 比法规中耐受水平还要低至倍实验结果表明, 本方法完全满足牛奶中抗生素的检测要求图 1 为牛奶基质加标样品 ( 浓度为 5ng/mL) 中磺胺甲嘧啶的提取离子色谱图, 从图 1 可以看出, 具有较高的信噪比采用空白牛奶基质作为稀释液, 配制一系列浓度的标准曲线工作液 (9 个浓度点 ), 基质配标曲线范围为 ng/mL 图 2 为磺胺二甲嘧啶校准曲线示例, 线性范围大于 4 个数量级所有抗生素化合物的校准曲线线性相关系数 R 2 均大于 , 具有良好的线性关系表 5 为目标化合物在不同浓度下连续进样的重现性数据表 6 展示了牛奶样品加标回收的实验结果大环内酯类磺胺类和 β- 内酰胺类抗生素回收率在 % 之间, 重现性 RSD 值小于 20%(n=5) 氟喹诺酮的绝对回收率为 60-70%, 但四环素的绝对回收率相对比较低, 回收率为 30% 同位素内标的回收率: 环丙沙星 -d8 和氟尼辛 -d3 分别约 70% 和 90% 氟喹诺酮和氘代氟喹诺酮化合物在提取过程中会出现类似损失, 故使用同位素内标来校正氟喹诺酮来化合物的回收率采用环丙沙星 -d8 作为氟喹诺酮和四环素类的内标物, 对提取过程的回收率进行校正使用内标校正后氟喹诺酮的回收率范围为 %, 而四环素约为 30% 在今后的实验中可采用氘代四环素作为四环素内标会得到更好的实验结果表 6 还展示了不同溶剂的沉淀蛋白效果对回收率和基质效应的影响除了红霉素外, 其余目标化合物在乙腈和甲醇中的回收率相近, 而红霉素采用乙腈和甲醇提取的回收率分别约为 27% 和 98% 本文采用溶剂配制标准溶液与牛奶基质配制标准溶液的响应值之间进行比较, 以获得牛奶基质效应情况结果表明 : 无论甲醇还是乙腈提取样品, 磺胺类大环内酯类和 β- 内酰胺类化合物未见明显的基质效应氟喹诺酮和四环素均有基质增益的效应, 相对而言, 两者在甲醇提取的基质增益更为显著利用上述确定的实验条件, 分析了 5 个不同脂肪含量元素 (1% 到 5%) 的牛奶样品实验结果表明,5 个牛奶样品均未检出抗生素两种内标化合物在不同脂肪含量的样品中, 其回收率 RSD 值均小于 15%, 这表明 : 化合物回收率与牛奶中的脂肪含量关系不大本实验对每个化合物均监测了 3 对 MRM 离子对, 其中 2 对 MRM 离子对分析物保留时间 /min 驻留时间 /ms 母离子定量离子 CE/eV 定量离子 1 CE/eV 定量离子 2 CE/eV 磺胺二甲嘧啶磺胺甲恶唑磺胺地索辛替米考星泰乐菌素红霉素青霉素 G 氯唑西林氧氟沙星环丙沙星沙拉沙星四环素金霉素环丙沙星 -d 氟尼辛 -d

4 用于化合物的定性确证相对仅有一对离子丰度比, 拥有两对 MRM 的离子对丰度比的实验, 具有更高的选择性和特异性定性离子的峰面积与定量离子峰面积比值, 作为离子丰度比表 7 展示了目标化合物在牛奶基质中的平均离子丰度比不同浓度水平下的相对离子比在平均离子丰度比 ±11% 之间, 低于食品中化学残留物分析 5 SANCO 文件规定 ±30% 的允许误差范围往牛奶空白样品提取液中添加标准品, 磺胺类氟喹诺酮类和 β- 内酰胺类的加标浓度为 10ng/mL, 大环内酯类和四环素类化合物的加标浓度为 50ng/mL, 对系统进行长达 6 天的稳定性实验图 3 展示了牛奶基质中 10ng/mL 磺胺二甲嘧啶与内标物响应值进行归一化的数据在连续 6 天进样, 磺胺二甲嘧啶响应值未见明显下降实验表明, 该三重四极杆质谱仪系统具有优异稳定性在 6 天的长期稳定性测试显示 13 种抗生素中有 10 种抗生素的信号强度无减弱另外 3 种抗生素随着时间推移而降解, 导致信号强度降低 30% 表 4- 牛奶基质中各类抗生素线性范围相关系数以及 LOQ A Quantifier Transition BQualifier 1 Transition C Qualifier 2 Transition 化合物 LOQ 校准曲线浓度范围相关系数 R 2 磺胺二甲嘧啶新诺明磺胺地索辛替米考星泰乐菌素红霉素青霉素 G 0.1 ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml ng/ml 图 1- 牛奶基质中磺胺二甲嘧啶的提取离子色谱图 ( 浓度为 5ng/ ml),a 为定量离子对,B 和 C 为定性离子对 Response Ratio R² = Sulfamethazine Concentration/ppb 图 2- 牛奶基质中磺胺二甲嘧啶校准曲线示例, 浓度范围为 ng/ ml,n=5 4

5 表 5- 牛奶基质中不同浓度水平下抗生素类化合物的重现性数据化合物 2.5ng/mLRSD (n=5) 5ng/mLRSD (n=5) 10ng/mLRSD (n=5) 25ng/mLRSD (n=5) 50ng/mLRSD(n=5) 100ng/mLRSD (n=5) 磺胺二甲嘧啶新诺明磺胺地索辛替米考星泰乐菌素红霉素青霉素 G 2.4 % 2.4 % 1.1 % 1.4 % 0.8 % 0.7 % 3.5 % 4.7 % 2.8 % 1.7 % 2.9 % 1.4 % 3.0 % 0.8 % 2.0 % 1.6 % 1.2 % 1.7 % 0.7 % 1.5 % 1.8 % 0.7 % 0.8 % 1.1 % 7.8 % 4.3 % 3.9 % 2.1 % 2.2 % 1.4 % 4.7 % 3.8 % 4.0 % 1.7 % 2.3 % 0.8 % 3.0 % 4.4 % 4.2 % 1.4 % 2.6 % 1.5 % 4.5 % 4.4 % 3.7 % 2.5 % 1.8 % 1.4 % 2.9 % 1.9 % 2.6 % 1.5 % 1.7 % 1.8 % 2.2 % 2.3 % 0.9 % 3.1 % 1.0 % 1.1 % 2.4 % 2.8 % 2.0 % 1.5 % 2.0 % 0.7 % 6.1 % 5.9 % 6.1 % 4.7 % 2.8 % 1.3 % 5.6 % 5.0 % 5.7 % 3.6 % 4.1 % 2.1 % 表 6- 牛奶中抗生素类化合物在不同提取溶剂下的回收率实验数据化合物添加回收浓度水平 (ng/ml) 平均回收率 ( 甲醇 ) 回收率 RSD ( 甲醇 ) 基质效应 ( 甲醇 ) 平均回收率 ( 乙腈 ) 回收率 RSD ( 乙腈 ) 基质效应 ( 乙腈 ) 磺胺二甲嘧啶新诺明磺胺地索辛替米考星泰乐菌素红霉素青霉素 G % 8 % 110 % 101 % 9 % 102 % % 10 % 93 % 105 % 13 % 97 % % 7 % 111 % 104 % 7 % 106 % % 10 % 127 % 82 % 15 % 103 % % 14 % 83 % 92 % 17 % 97 % % 11 % 80 % 27 % 17 % 91 % % 10 % 94 % 84 % 10 % 96 % % 13 % 97 % 96 % 13 % 102 % % 17 % 163 % 97 % 1.7 % 181 % % 16 % 174 % 87 % 1.0 % 163 % % 11 % 162 % 96 % 9 % 142 % % 5 % 152 % 24 % 5 % 120 % % 8 % 177 % 21 % 10 % 130 % 表 7- 牛奶中不同浓度水平下抗生素类化合物物离子丰度比列表化合物磺胺二甲嘧啶新诺明磺胺地索辛替米考星泰乐菌素红霉素青霉素 G 氯唑西林离子比 1 相对离子比 1 之差离子比 2 相对离子比 2 之差 57 % ± 5 % 43 % ± 6 % 99 % ± 5 % 90 % ± 6 % 38 % ± 6 % 29 % ± 5 % 76 % ± 5 % 64 % ± 5 % 44 % ± 6 % 26 % ± 11 % 46 % ± 5 % 24 % ± 6 % 78 % ± 5 % 50 % ± 10 % 43 % ± 5 % 38 % ± 6 % Normalized Response for 10 ppb Sulfamethazine in Milk Extract RSD=4.5 % 氧氟沙星 69 % ± 9 % 62 % ± 7 % 环丙沙星 43 % ± 5 % 2.5 % ± 12 % Run Number 沙拉沙星四环素 13 % ± 7 % 8.1 % ± 7 % 23 % ± 6 % 21 % ± 10 % 图 3- 牛奶中磺胺二甲嘧啶的长期稳定数据示例 ( 浓度为 10ng/mL, 连续进样 6 天 ) 金霉素 68 % ± 6 % 37 % ± 6 % 5

6 结论本文采用改良型 QuEChERS 样品前处理方法建立了牛奶中抗生素类多残留分析方法, 该方法具有快速稳定可靠, 高灵敏度和选择性等特点经简单的样品前处理, 大部分抗生素化合物获得了良好的回收率本方法满足牛奶中痕量的抗生素残留进行定性定量分析要求, 具有良好的精密度和稳定的保留时间长期稳定性测试结果表明 : 该 LC/MS/MS 系统适用于长期复杂基质的样品分析, 也无需停机维护保养参考文献 1. US FDA/CFSAN Tolerance and /or Safe Levels of Animal Drug Residues in Milk; memo dated Sep 27, S. B. Clark, J. M. Storey, S. B. Turnipseed, FDA Laboratory Information Bulletin, Lib # 4443, downloads/scienceresearch/fieldscience/ucm pdf. 3. L. Geis-Asteggiante, S. J. Lehotay, A. R.Lightfield, T. Dutko, C. Ng, L. Bluhm, J. Chrom. A, 2012, 1258, T. Yamaguchi, M. Okihashi, K. Harada, K. Uchida, Y. Konishi, K. Kajimura, K. Hirata, Y. Yamamato, J. Agri. Food Chem., 2015, 63, European Commission Guidance Document on Analytical Quality Control and Validation Procedures for Residues Analysis in food and feed, SANCO12571(2013), documents/docs/qualcontrol_en.pdf 珀金埃尔默企业管理 ( 上海 ) 有限公司地址 : 上海张江高科技园区张衡路 1670 号邮编 : 电话 : 传真 : 要获取全球办事处的完整列表, 请访问版权所有 2016, PerkinElmer, Inc. 保留所有权利 PerkinElmer 是 PerkinElmer, Inc. 的注册商标其它所有商标均为其各自持有者或所有者的财产 _CHN_01 PKI

<4D F736F F D204C432D4D534D53CADED2A9BCECB2E2D5FBCCE5BDE2BEF6B7BDB0B82E646F63>

<4D F736F F D204C432D4D534D53CADED2A9BCECB2E2D5FBCCE5BDE2BEF6B7BDB0B82E646F63> 应用文集超高效液相色谱三重四极杆质谱联用法测定牛奶中的喹诺酮类抗生素残留摘要 : 本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪和三重四极杆质谱仪联用测定动物源性食品中 14 种喹诺酮类抗生素的方法样品经处理后, 用超高效液相色谱 LC-30A 在 7 min 内实现快速分离, 三重四极杆质谱仪 LCMS-8040 进行定量分析使用外标法内绘制 14 种喹诺酮类抗生素的校准曲线, 线性良好, 相关系数为

应用文献 Liquid Chromatography / Mass Spectrometry 作者 : Avinash Dalmia PerkinElmer Inc. Shelton, CT UPLC MS/MS 测定牛奶中多种抗生素药物残留量 简介 抗生素曾被广泛用于兽 药生产中, 用于预防和 治

应用文献 Liquid Chromatography / Mass Spectrometry 作者 : Avinash Dalmia PerkinElmer Inc. Shelton, CT UPLC MS/MS 测定牛奶中多种抗生素药物残留量简介抗生素曾被广泛用于兽药生产中, 用于预防和治