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椰驿仇
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1 52 28, Vol. 29, o. 8 食品科学分析检测李雅丽 1, 郝晓蕾 1, 冀宝庆 1, 胥传来 1, *, 沈崇钰 2, 丁涛 2 (1. 江南大学食品学院, 江苏无锡 ;2. 江苏省出入境检验检疫局, 江苏南京 21) : 本研究建立了同时检测动物性食品中恩诺沙星环丙沙星诺氟沙星氧氟沙星氟甲喹恶喹酸双氟沙星沙拉沙星司帕沙星丹诺沙星氟罗沙星马波沙星伊诺沙星奥比沙星培氟沙星萘啶酸吡哌酸洛美沙星和西诺沙星 19 种喹诺酮类药物的 HPLC-ESI-MS/MS 检测方法动物组织样品用乙腈提取, 采用甲酸水溶液 - 甲醇体系作为流动相, 梯度洗脱, 质谱检测器检测方法的线性范围为.3~5μg/kg, 相关系数 (r) 大于.9956, 检出限为.3μg/kg,19 种喹诺酮类药物在鸡肉和鱼肉的平均回收率分别为 75.3%~96.3% 79.7%~94.2%, 日内和日间变异系数均小于 1% : 喹诺酮类药物 ; 动物性食品 ;HPLC-ESI-MS/MS; 多残留检测 Simultaneous and High Sensitivity Determination of ineteen Kinds of Quinolone Multiresidues in Animal ood by HPLC-ESI-MS/MS LI Ya-li 1,HA Xiao-lei 1,JI Bao-qing 1,XU Chuan-lai 1, *,SHE Chong-yu 2,DIG Tao 2 (1.School of ood Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi , China; 2.Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, anjing 21, China) Abstract:A multi-residue method was developed for the confirmation and quantitation of nineteen kinds of quinolones in animal food by HPLC-ESI-MS/MS. The samples were extracted with acetonitrile. The analytes were separated using.1% fomic acidmethanol system as the mobile phase with a linear gradient elution program, and determined by tandem mass detector. Results showed that their linear ranges are.3μg/kg to 5 μg/kg with correlation coefficients (r) more than.9956, and the limits of detection are.3 μg/kg. The mean recoveries for each analyte in chicken and fish range from 75.3%~96.3% and 79.7%~94.2% with relative standard deviations below 1%. The method is convenient, fast, safe, sensitive and accurate, and can be used to simultaneously analyze residual quinolones in actual samples. Key words:quinolones;animal food;hplc-esi-ms/ms;multi-residue 中图分类号 :TS27.53 文献标识码 :A 文章编号 :2-663(28) 喹诺酮是一类合成抗生素类药物, 在化学上与萘啶酮酸相关, 其作用机理是直接作用于细菌的核抑制细菌的 DA 旋转酶, 使酶不能在 DA 双链上引入切 [1-2] 口, 破坏细菌的代谢和繁殖, 迅速杀灭细菌最初这类药物用于治疗尿道感染, 现在已发展到治疗系统感染疾病, 并且在动物饲养中作为预防和治疗药物普遍使用近年来, 这些药物在动物组织中的残留已被引起广泛关注联合国粮农组织世界卫生组织食品添加剂专家联合委员会欧盟都已制定了多种喹诺酮类药物 [3-4] 在动物组织中的最高残留限量喹诺酮类药物各种残留分析方法, 主要包括高效液相法 (HPLC) 以及与此相关的 HPLC-UV HPLC-D HPLC-DVD LC-MS/MS LC-ESI-MS/MS [5-6], 另外还 [7] [8] [9] 有荧光光谱法毛细管电泳法和酶联免疫法等 [1] Lesley J 等用 HPLC-MS 法检测鱼类和海产品中的喹诺酮类和氟喹诺酮类药物的残留, 所有被分析物均获得很 [11] 好的回收率, 检测极限达到 1~3mg/kg Gery V 等用 LC- E SI-M S/M S 法检测猪肾中的 11 种喹诺酮类药物收稿日期 : 基金项目 : 十一五国家科技支撑计划重点项目 (26BAK2A9) 作者简介 : 李雅丽 (1982-), 女, 硕士研究生, 研究方向为食品卫生与安全 lyl616@gmail.com * 通讯作者 : 胥传来 (1965-), 男, 教授, 博士, 研究方向为食品卫生与安全 xcl@jiangnan.edu.cn

2 分析检测食品科学 28, Vol. 29, o 本实验旨在建立同时测定动物肌肉组织中 19 种 Qs 药物 ( 恩诺沙星环丙沙星诺氟沙星氧氟沙星氟甲喹恶喹酸双氟沙星沙拉沙星司帕沙星丹诺沙星氟罗沙星马波沙星伊诺沙星奥比沙星培氟沙星萘啶酸吡哌酸洛美沙星和西诺沙星 ) 多残留的 HPLC-ESI-MS/MS 检测方法组织样品使用有机相提取本方法前处理过程快速简便, 检测结果可靠灵敏, 适用于动物性食品中喹诺酮类药物残留的分析检测 1 材料与方法 1.1 试剂与仪器恩诺沙星环丙沙星诺氟沙星等 19 种喹诺酮类药物西格玛奥德里奇公司 ; 其他化学试剂均为分析纯 Accela 高效液相色谱 ( 包括 autosampler 和 accela pum p) TSQ Quantum Access 质谱仪美国菲尼根公司 ;BP211D 型电子分析天平德国赛多利斯公司 ; 可调微量加样器系列 Thermo Labsystems 公司 ;KQ- 25D E 型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司 ; 氮吹仪 rganomation Associates 公司 ;WH-861 旋涡混合器江苏省华利达试验设备公司 ;RJ-LD-IIB 低速台式离心机无锡市瑞江分析仪器有限公司 1.2 标准溶液的配制分别称取适量恩诺沙星环丙沙星诺氟沙星氧氟沙星氟甲喹恶喹酸双氟沙星沙拉沙星司帕沙星丹诺沙星氟罗沙星马波沙星伊诺沙星奥比沙星培氟沙星萘啶酸吡哌酸洛美沙星和西诺沙星 19 种标准品 1mg, 溶解于甲醇中, 定容至 1ml, 即为 1mg/ml 的标准贮备液 ; 分别量取适量 19 种标准贮备液, 配制 19 种喹诺酮类药物的混合标准工作液 1μg/ml; 将混合标准工作液配置成和 5ng/ml 的标准溶液, 进行 HPLC-ESI- M S/M S 测定以各组分的色谱峰面积对浓度作线性回归, 得定量标准曲线 1.3 样品处理称取均质的 2. ±.2g 空白鸡鱼肌肉组织置于 5ml 离心管中, 添加适量的标准溶液, 旋涡混匀, 避光静置 15min 后, 加入 1ml 乙腈进行提取, 涡动 15min,35r/min 离心 5min, 过滤 ; 残留组织用 1ml 乙腈重复提取一次, 合并上清液, 用氮气吹干, 然后加入 1.ml 3% 甲醇溶液溶解吹干物,.45μm 滤膜过滤 1.4 色谱条件色谱柱 :C 18 反相色谱柱 (15 2.1mm,3μm); 流动相 :.1% 甲酸水溶液 - 甲醇, 梯度洗脱条件如表 1 所示 ; 流速 :.2ml/min; 进样量 :25μl; 柱温 :2 1.5 质谱条件表 1 HPLC ESI MS/MS 系统流动相梯度洗脱条件 Table 1 HPLC ESI MS/MS system mobile phase gradient program 指标条件 ~1 1~4 4~8 8~ ~11 甲酸 (%) 甲醇 (%) 1 1~9 9 9~1 1 离子源 : 电喷雾离子源 ; 扫描方式 : 正离子扫描 ; 检测方式 : 多级反应检测 ; 电喷雾毛细管电压 : 4.2kV; 毛细管温度 :35 ; 辅助气体流速 :5L/h; 鞘气体流速 :2L/h; 倍增器电压 :92V; 二级碰撞气 : 氦气其他条件见表 2 表 2 HPLC-CESI-CMS/MS 法测定电喷雾离子源 Table 2 ESI settings for HPLC-ESI-MS/MS 药物分子结构式母离子 (m/z) 子离子 (m/z) 碰撞电压 (ev) 恩诺沙星 H 36 H3C H 环丙沙星 332 H H 诺氟沙星 32 H CH3 CH3 氧氟沙星 362 H CH3 H 氟甲喹恶喹酸 H CH 双氟沙星 4 沙拉沙星 H 386 H2 CH 司帕沙星 393 H CH3 C2H5 CH

3 54 28, Vol. 29, o. 8 食品科学分析检测续表 2 药物分子结构式母离子 (m/z) 子离子 (m/z) 碰撞电压 (ev) CH 丹诺沙星氟罗沙星 H2 CH CH 马波沙星伊诺沙星 CH H 奥比沙星 CH H 培氟沙星 CH 萘啶酸 CH 吡哌酸 CH H 洛美沙星 CH 西诺沙星 H CH 注 : 加有下划线的为定量离子 2 结果与分析 2.1 M S/M S 检测方式的选择本研究的 19 种药物中, 结构差异较大, 荧光检测波长也不相同, 因而这 19 种 Qs 不能采用荧光检测器 [12] 同时测定紫外检测器可以同时测定这 19 种 Qs, 但检测灵敏度较荧光检测器低, 且受基质干扰大, 对净化要求很高本研究采用四级杆串联质谱, 电喷雾电离 (ESI) 正离子多反应监测(MRM) 模式检测, 显著降低了基质的干扰, 检测灵敏度比荧光检测提高 5~ 1 倍 2.2 样品处理条件的优化提取溶剂的选择主要取决于被测物质的性质, 并考虑被测样品的性质主要根据基质不同而采用有机溶剂和酸 / 碱化溶剂提取由于 Qs 具有酸碱两性的特点, [13] 其提取方法也很多 Macarena R 等用磷酸盐缓冲液处理样品 HPLC-D 检测鲑鱼和牛肉中的五种 Qs Karbiwnyk C M [14] 等用乙酸乙酯处理样品 LC-D/MS 检测三种 Qs Toussaint B [15] 等用乙腈处理样品 LC-MS/MS 检测 11 种 Qs 综合考虑, 采用乙腈处理样品, 有利于色谱柱和质谱检测器的保护, 且上清液进样溶剂效应小 2.3 流动相溶液的选择由于采用 MS 分析, 不能使用难于气化的磷酸盐缓冲液流动相体系柠檬酸缓冲溶液及离子对试剂常常被用来作为检测喹诺酮类药物的流动相, 但其与乙腈甲醇混合时易产生结晶而引起色谱管路堵塞, 且灵敏度较低 [16] 赵思俊等采用甲酸作为流动相 HPLC-D 检测 7 种 [17] Qs 杜黎明等采用乙睛 - 甲醇 - 三酸缓冲液检测 6 种 Qs 综合考虑以上文献报道, 本实验通过对流动相的优化采用.1% 甲酸水溶液甲醇为流动相梯度洗脱, 获得较好的实验结果 2.4 标准曲线线性范围和检出限采用空白样品提取液来配制所使用的一系列基质标准工作溶液, 绘制标准曲线进行定量, 来消除因基质而带来的离子抑制对定量测定的影响在确定的最佳条件下, 进行测定以各组分的峰面积 (Y) 对浓度 (X) 绘制标准曲线, 线性关系标相关系数见表 3 结果表明,19 种 Qs 在低浓度范围.3~5μg/kg 线性良好, 可以满表 3 线性分析相关系数和检出限 Table 3 ESI settings for HPLC-ESI-MS/MS 药物线性范围相关检出限线性方程 (μg/kg) 系数 (μg/kg) 环丙沙星.3~5 Y= X R 2 = 诺氟沙星.3~5 Y=2.1497X R 2 = 氧氟沙星.3~5 Y= X R 2 = 氟甲喹.3~5 Y= X R 2 = 恶喹酸.3~5 Y=9.768X R 2 = 双氟沙星.3~5 Y= X R 2 = 沙拉沙星.3~5 Y= X R 2 = 司帕沙星.3~5 Y=1.9496X R 2 = 丹诺沙星.3~5 Y= X R 2 = 氟罗沙星.3~5 Y=1.539X R 2 = 马波沙星.3~5 Y= X R 2 = 伊诺沙星.3~5 Y= X R 2 = 奥比沙星.3~5 Y= X R 2 = 培氟沙星.3~5 Y=.41346X R 2 = 萘啶酸.3~5 Y=3.6175X R 2 = 吡哌酸.3~5 Y= X R 2 = 洛美沙星.3~5 Y=2.67X R 2 = 西诺沙星.3~5 Y= X R 2 = 恩诺沙星.3~5 Y=1.7554X R 2 =

4 分析检测食品科学 28, Vol. 29, o 图加标回收组织色谱图 ig.1 Chromatogram of spiked tissue with.3-9 amount 足定量分析的需要 2.5 回收率和精密度回收率实验在鸡肉和鱼肉中加入已知量的标准溶液后进行回收率实验, 按样品的处理方法进行操作并进样分析, 平行测定 6 次, 根据工作曲线采用外标法定量计算回收率, 平均回收率分别为 75.3%~96.3% 79.7%~ 94.2%, 日内和日间变异系数均小于 1% 2.6 H PL C -M S/M S 方法定量评价和实际样品分析对取自无锡市场的 1 份鱼类肉样品进行了检测, 其中在两份鱼肉中检测到喹诺酮类药物的残留, 检测结果见表 4 由此证明此方法是简单方便准确的检测喹诺酮类药物的行之有效的方法表 4 实际检测样品中喹诺酮类药物的残留 Table 4 Quinolone residues in market muscle samples 样品环丙沙星 + 恩诺沙星 (μg/kg) 诺氟沙星 (μg/kg) D 2 D 12.7 注 :D 为未检出参考文献 : [1] BLDEAU J M. luoroquinolones: mechanism of action, classification, and development of resistance[j]. Survey of phthalmology, 24, 49 (2): S73-S78. [2] WITER R W, KELLY J X, SMILKSTEI M J. Antimalarial quinolones: synthesis, potency, and mechanistic studies[j]. Experimental Parasitology], 28, 118(4): [3] DA DA announces final decision about veterinary medicine[eb/l].

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g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min

g ml 10% ph 色谱条件 kinetex C μm 100 A 4. 6 mm 150 mm 25 5 μl A B 10 mmol /L ml /min 25 4 2013 8 监测技术 5 1 2 1 ( 1. 江苏省疾病预防控制中心, 江苏南京 210009; 2. 南京医科大学第二附属医院, 江苏南京 210029) 5 Phenomenex kinetex C 18 2. 6 μm 4. 6 mm 150 mm 10 mmol /L ph 2. 5 + 60 40 DAD 280 nm 5 20. 0 mg /L ~ 100 mg /L 0.