第 27 卷第 3 期 2017 年 5 月 江苏大学学报 ( 医学版 ) JournalofJiangsuUniversity(MedicineEdition) Vol.27 No.3 May2017 RSK2 基因对肝癌 SMMC 7721 细胞增殖与凋亡的影响 FarmanAli 1,2, 何大伟 3, 何敖林 3, 李莎莎 3, 周明慧 3 2, 王炳芳 (1. 江苏大学医学院, 江苏镇江 212013;2. 江苏大学附属昆山医院消化内科, 江苏昆山 215300;3. 江苏大学附属昆山医院临床实验研究中心, 江苏昆山 215300) [ 摘要 ] 目的 : 探讨 P90 核糖体 S6 激酶 2(ribosomalS6kinase2,RSK2) 基因对肝癌细胞 SMMC 7721 的增殖与凋亡的影响 方法 : 将肝癌细胞随机分为 5 组, 即对照组 pcdna3.1(+) 空质粒组 pcdna3.1(+)/rsk2 组 sirna 阴性对照组 sirna RSK2 组 对照组不转染, 其余 4 组分别转染 pcdna3.1(+) 空质粒 pcdna3.1(+)/rsk2 sirna 阴性对照 sirna RSK2 转染 48h 后, 荧光定量 PCR(RT PCR) 免疫印迹法检测 RSK2mRNA 和蛋白表达 ; CCK8 实验检测各组细胞增殖能力 ; 流式细胞术检测各组细胞凋亡和周期 结果 :RT PCR 和免疫印迹结果显示, pcdna3.1(+)/rsk2 组 RSK2mRNA 和蛋白表达量明显高于其他 4 组 (P<0.01);siRNA RSK2 组表达量明显低于其他 4 组 (P<0.01) CCK8 检测结果表明,RSK2 基因过表达促进 SMMC 7721 细胞增殖 (P<0.01) 流式细胞术结果显示,RSK2 基因沉默阻断细胞周期在 G1 期 (P<0.01), 细胞总增殖能力下降 (P<0.01);siRNA RSK2 组细胞凋亡率明显高于其他 4 组 ( 均 P<0.01), 而 pcdna3.1(+)/rsk2 组细胞凋亡率与对照组比较无明显差别 (P> 0.05) 结论:RSK2 过表达可促进 SMMC 7721 细胞增殖, 但对凋亡无影响 ;RSK2 沉默抑制细胞增殖能力, 促进细胞凋亡 [ 关键词 ] RSK2; 肝癌细胞 ; 细胞增殖 ; 细胞凋亡 [ 中图分类号 ] R735.7 [ 文献标志码 ] A [ 文章编号 ] 1671-7783(2017)03-0219-04 DOI:10.13312/j.isn.1671 7783.y170125 [ 引用格式 ]FarmanAli, 何大伟, 何敖林, 等.RSK2 基因对肝癌 SMMC 7721 细胞增殖与凋亡的影响 [J]. 江苏大学学报 ( 医学版 ),2017,27(3):219-222,228. InfluenceofRSK2geneonthecelproliferationandapoptosisof humanhepatocelularcarcinomacellinesmmc 7721 FarmanAli 1,2,HEDa wei 3,HEAo lin 3,LISha sha 3,ZHOUMing hui 3,WANGBing fang 2 (1.SchoolofMedicine,JiangsuUniversity,ZhenjiangJiangsu212013;2.DepartmentofGastroenterology,KunshanHospitalAfiliatedto JiangsuUniversity,KunshanJiangsu215300;3.ClinicalResearch&LabCenter,KunshanHospitalAfiliatedtoJiangsuUniversity,Kun shanjiangsu215300,china) [Abstract] Objective:ToinvestigatetheefectofP90ribosomalS6kinase2(RSK2)geneonthepro liferationandapoptosisofhumanhepatocelularcarcinomacellinesmmc 7721.Methods:SMMC 7721 celsweredividedinto5groups,includingcontrolgroup,pcdna3.1(+)vectorgroup,pcdna3.1 (+)/RSK2group,siRNA negativecontrolgroupandsirna RSK2group.Controlgroupwastransfected withnothing,theotherfourgroupsweretransfectedwithpcdna3.1(+)emptyplasmid,pcdna3.1 (+)/RSK2,siRNA negativecontrolandsirna RSK2,respectively.At48hposttransfection,the RT PCRandwesternblotingwererespectivelyusedtodetecttheexpresionofmRNA andproteinof RSK2.CCK8asaywasusedtomeasuretheproliferationability.Andflowcytometrywasusedtodetect apoptosisandcelcycle.results:theresultsofrt PCRandWesternblotingshowedthatthemRNA andproteinofrsk2ofpcdna3.1(+)/rsk2groupweresignificantlyhigherthanthoseoftheotherfour groups(p<0.01).incontrast,themrnaandproteinofrsk2ofsirna RSK2groupwereremarkably lowerthanthoseoftheotherfourgroups(p<0.01).theresultsofcck8asayindicatedthatoverex [ 作者简介 ]FarmanAli(1988 ), 男, 硕士研究生 ; 王炳芳 ( 通讯作者 ), 主任医师, 硕士生导师,E mail:shbingfang@163.com
220 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 27 卷 presionofrsk2genepromotedtheproliferationofsmmc 7721cels(P<0.01).Flowcytometryre sultsshowedthatrsk2genesilencingblockedthecelcycleing1phase(p<0.01),anddecreasedcel proliferationability(p<0.01).theapoptosisrateofsirna RSK2groupwassignificantlyhigherthan thatoftheotherfourgroups(p<0.01),buttheapoptosisrateofpcdna3.1(+)/rsk2groupwasnot evidentlydiferentfromthatofthecontrolgroup(p>0.05).conclusion:over expresionofrsk2gene promotedtheproliferationofsmmc 7721cels,withoutanyefectoncelapoptosis.TheRSK2genesi lencingcouldinhibitthecelproliferationandpromotetheapoptosis. [Keywords] RSK2;hepatocelularcarcinoma;celproliferation;apoptosis P90 核糖体 S6 激酶 2(ribosomalS6kinase2, RSK2) 基因位于人染色体 Xp22.2, 属于 Ras MAPK 信号通路下游的 RSK 家族成员, 最初由 Erison 等从非洲爪蟾卵中分离提取出 ; 该家族包含 4 个成员, 即 RSK1 RSK2 RSK3 RSK4 [1-2] 近来, 研究发现 RSK 与肿瘤的发生发展以及治疗关系密切 其中, RSK2 在不同的肿瘤中扮演不同的角色, 如在乳腺癌 骨肉瘤中参与细胞增殖, 而在头颈部鳞癌参与肿瘤转移 侵袭 [3-5] 但是,RSK2 与肝癌的关系尚不清楚, 因此, 本研究主要探究 RSK2 基因表达变化对肝癌 SMMC 7721 细胞增殖与凋亡的影响 1 材料与方法 1.1 材料人肝癌 SMMC 7721 细胞株由本实验室保存, pcdna3.1(+)/rsk2 重组质粒由本实验室构建, sirna RSK2 sirna 阴性对照 ( 上海吉凯基因化学技术有限公司 ),RSK2 单克隆抗体 GAPDH 抗体 ( 美国 Abcam 公司 ), 反转录试剂盒 RT PCR 试剂盒 ( 美国 Thermo 公司 ),HRP 标记的二抗 化学发光试剂盒 CCK8 试剂盒 BCA 蛋白浓度测定试剂盒 RI PA 裂解液 ( 上海碧云天生物技术有限公司 ),DMEM 高糖培养基 Opti MEM 胰蛋白酶 胎牛血清 双抗 PBS( 美国 Gibco 公司 ) 1.2 方法 1.2.1 细胞培养 分组与转染人肝癌 MMC 7721 细胞用含 10% 胎牛血清的 DMEM 高糖培养基, 置于 37 5%CO 2 平衡湿度培养箱中培养 当细胞密度达 70% ~80% 时消化传代 将细胞分为 5 组, 对照组 pcdna3.1(+) 空质粒组 pcdna3.1(+)/rsk2 组 sirna 阴性对照组 sirna RSK2 组, 对照组不转染, 其余 4 组分别转染 pcdna3.1(+) 空质粒 pcd NA3.1(+)/RSK2 sirna 阴性对照 sirna RSK2; 分别接种于 6 孔板 (5 10 4 个 / 孔,3 个复孔 ) 和 96 孔板 (4000 个 / 孔,6 个复孔 ), 至细胞密度达到 50% ~60% 时, 进行相应转染 ; 将质粒或 sirna 转染试剂分别用 Opti MEM 稀释, 按固定比例混合, 常温避光孵育 30min; 加入到相应的培养板中, 培养 6 h; 更换 DMEM 高糖培养基, 继续培养 48h, 行后续实验 1.2.2 荧光定量 PCR(RT PCR) 检测 RSK2mRNA 表达收集 1.2.1 6 孔板中细胞, 按 Trizol 试剂盒说明书提取细胞总 RNA, 微量核酸分析仪测定 RNA 浓度和纯度 ;DEPC 水将 RNA 浓度稀释成 1μg/μL, 取 2 μl 行反转录合成 cdna; 然后按试剂盒行 RT PCR, 反应条件 :95 30s,57 45s,72 30s, 40 个循环 以 GAPDH 作为内参 用 2 -ΔΔCt 法计算 RSK2 基因的相对表达量, 引物序列见表 1 表 1 引物序列及扩增产物长度 基因 引物序列 (5-3 ) 产物长度 (bp) RSK2 上游 CCGGTTACACTCCATTTGCA 245 下游 ACAAGAGCAGCAGTCAGTCT GAPDH 上游 ACCACCATGGAGAAGGCTGG 528 下游 CTCAGTGTAGCCCAGGATGC 1.2.3 免疫印迹法检测 RSK2 蛋白表达收集 6 孔板内的细胞, 提取细胞总蛋白 ; 经 BCA 试剂盒定量, 取 20 μg 蛋白进行 12%SDS PAGE; 电转移至 PVDF 膜 ;5% 脱脂奶粉常温封闭 2h;RSK2 一抗 (1 1000)4 封闭过夜 ;TBST 充分洗涤 3 次, 每次 10min;HRP 标记的二抗 (1 1000) 常温孵育 2 h;tbst 充分洗涤 3 次, 每次 10min; 化学发光显色, 最后用化学发光仪进行显影, 以 GAPDH 作为内参 1.2.4 CCK8 检测细胞活力取 1.2.1 中接种于 96 孔板的 5 组细胞, 设置空白对照组, 每组 6 个复孔 ; 转染结束前 2h, 每孔加入 10μLCCK8 试剂, 孵育 1~3h; 然后用全自动酶标仪测 450nm 波长时各孔 D 值, 实验重复 3 次 1.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡取 1.2.1 转
第 3 期 FarmanAli, 等.RSK2 基因对肝癌 SMMC 7721 细胞增殖与凋亡的影响 221 染结束后的人肝癌 MMC 7721 细胞, 预冷 PBS 离心洗涤 2 次 ; 重悬于 400μL 凋亡试剂盒缓冲液中, 调整浓度为 (0.25~1.0) 10 7 /ml; 加入 5μLAnnex inv FITC, 室温避光孵育 5min; 加入 10μLPI,4 避光孵育 5min, 流式细胞仪检测 1.2.6 流式细胞仪检测细胞周期细胞分组同 1.2.1, 各组细胞转染结束后, 收集细胞, 预冷 PBS 洗涤 2 次 ;70% 乙醇固定过夜 ; 离心后重悬于凋亡试剂盒缓冲液中 ; 加入 20μLRNA 酶于 37 恒温培养箱孵育 30min; 加入 400μL 碘化丙啶,4 避光孵育 30min; 流式细胞仪检测, 每组 3 个复孔 1.3 统计学分析数据以均数 ± 标准差 ( x±s) 珋表示, 采用 SPSS 17.0 和 GraphPadPrism5.0 软件进行统计学分析, 组间差异采用单因素方差分析, 进一步采用双尾 t 检验比较两组均数差异,P<0.05 表示差异具有统计学意义, 每组实验均独立重复 3 次 2 结果 2.1 SMMC 7721 转染效果评价转染 48h 后,RT PCR 和免疫印迹检测结果显示, 与对照组比较,pcDNA3.1(+) 空质粒组 sirna 阴性对照组 RSK2mRNA 表达差异无统计学意义 ( 均 P>0.05);pcDNA3.1(+)/RSK2 组 RSK2 mrna 和蛋白表达量明显高于其他 4 组 ( 均 P<0. 01);siRNA RSK2 组中 RSK2mRNA 和蛋白表达量明显低于其他 4 组 ( 均 P<0.01) 见图 1 2.2 转染 RSK2 对细胞活性的影响转染结束后,5 组细胞活性比较差异具有统计学意义 (F=55.62,P<0.01) 其中,pcDNA3.1 (+)/RSK2 组细胞活性明显高于其他 4 组 (P 均 < 0.01), 而 sirna RSK2 组细胞活性明显低于其他 4 组 (P 均 <0.01), 如图 2 所示, 说明过表达 RSK2 可以促进细胞增殖, 沉默 RSK2 对细胞活性具有一定的抑制作用 2.3 RSK2 基因促进 SMMC 7721 细胞周期细胞周期分析结果显示, 转染 48h 后,pcD NA3.1(+)/RSK2 组细胞 G0/G1 期比例明显低于其他 4 组 ( 均 P<0.01),G2/M 比例明显高于其他 4 组 ( 均 P<0.01); 同时,RSK2 sirna 组细胞 G0/G1 期比例明显高于其他 4 组 ( 均 P<0.01),G2/M 比例明显低于其他 4 组 ( 均 P<0.01), 说明 RSK2 基因沉默后细胞增殖能力下降 ( 图 3) 1: 对照组 ;2:pcDNA3.1(+) 空质粒组 ;3:pcDNA3.1(+)/ RSK2 组 ;4:siRNA 阴性对照组 ;5:siRNA RSK2 组 ;a:p< 0.01, 与 pcdna3.1(+)/rsk2 组比较 ;b:p<0.01, 与 sirna RSK2 组比较图 1 转染 RSK2 后细胞 RSK2mRNA 和蛋白的表达 1: 对照组 ;2:pcDNA3.1(+) 空质粒组 ;3:pcDNA3.1(+)/ RSK2 组 ;4:siRNA 阴性对照组 ;5:siRNA RSK2 组 ;a:p< 0.01, 与 pcdna3.1(+)/rsk2 组比较 ;b:p<0.01, 与 sirna RSK2 组比较图 2 转染 RSK2 促进细胞的活性 2.4 转染 RSK2 对细胞凋亡影响 5 组细胞凋亡率比较差异具有统计学意义 (F= 62.64,P<0.01),pcDNA3.1(+)/RSK2 组细胞凋亡率与对照组 pcdna3.1(+) 空质粒组 sirna 阴性对照组比较, 无明显差异 ( 均 P>0.05), 而 sir NA RSK2 组凋亡率明显高于其他 4 组 (P<0.01) 见图 4 3 讨论 RSK2 蛋白作为一种高度保守的丝氨酸 / 苏氨酸激酶, 主要表达于人骨骼肌 心肌和胰腺 [6] 有文献报道,RSK 通过 MAPK 信号通路调节肿瘤细胞
江苏大学学报 医学版 第 卷 Ｐ １ 与 ｐ ｃ １ Ｋ组比较 ｂ Ｐ １ 与 Ｋ组比较 图 ３ 细胞周期的流式细胞检测结果 １ 对照组 ｐｃ １ 空质粒组 ３ ｐｃ １ Ｋ组 ４ 阴性对照组 ５ Ｋ组 Ｐ １ 与 Ｋ 组比较 图 ４ 转染 Ｋ后细胞凋亡率变化 的增殖 后来研究发现 Ｋ蛋白家族不仅仅在 亡 还需要 Ｔｕ Ｈｏ ｃ ｈ ｔ等方法进一步验证 此 ＭＡＰＫ信号通路中发挥作用 Ｋ一旦被激活就会 外 本研究只从细胞增殖与凋亡方面进行检测与分 磷酸化细胞内多种蛋白和转录因子 从而调控细胞增 析 存在一定的局限性 有文献报道 特异性沉默肺 ８ 其 腺癌细胞的 Ｋ可诱导细胞凋亡 抑制细胞侵袭 中 Ｋ定位于细胞质 经促细胞分裂原 血清等刺 ｗ 小 转移 １１ 因此 后续研究中还需应用 Ｔｒ 激后 首先易位至细胞膜 被激活后一部分进入细胞 室法检测细胞侵袭情况是否改变 本研究只选择 核 一部分继续停留在胞质中 根据细胞微环境的不 Ｓ １一种肝癌细胞株 还需要在其他细胞株 殖 细胞周期以及自噬等多种细胞生命活动 同 分别磷酸化不同的底物 因而发挥不同的作用 ９ 中进行证实 Ｋ家族每一个蛋白都有不同的功 现已证实 Ｋ蛋白表达水平在恶性肿瘤组织中较 能 还 需 要 更 加 严 密 的 细 胞 信 号 转 导 研 究 证 实 正常组织偏高 １ 尤其在肺腺癌中表达最高 Ｋ Ｋ家族与肝癌的相关性 可能参与肿瘤的形成 涉及肿瘤细胞的增殖 迁移 侵 袭等 而且在不同的肿瘤细胞中发挥的作用不同 本研究利用 Ｋ在肝癌细胞中的表达特点 综上所述 Ｋ基因过表达可促进肝癌细胞 Ｓ １的增殖 对细胞凋亡无影响 特异性沉 默 Ｋ则抑制 Ｓ １细胞增殖 促进细胞凋 分别通过构建 Ｋ基因高表达质粒和 Ｋ Ｒ 亡 本研究只是初步证明 Ｋ与肝癌细胞的关系 ＮＡ特异性沉默 Ｋ基因 双向证明 Ｋ基因与 其确切机制还需进一步的实验研究 肝癌细胞增殖与凋亡的关系 Ｋ低表达可抑制 细胞增殖 促进细胞 凋 亡 与 Ｋ为 促 癌 基 因 相 参考文献 符 Ｋ高表达后 虽然促进细胞增殖 但细胞凋 １ Ａ ｊ ｕ ｍ Ｒ Ｂ Ｊ Ｔｈ Ｋｆ ｍ ｙｏ ｆｋ ｍ ｒ 亡无明显变化 分析认为 肝癌细胞 Ｋ的基础 ｇ ｇｒ ｏ ｃ ｕ ｒ ｇ ｇ Ｊ Ｎ ｔｒ ｖｍｏ Ｃ 表达量高 但还未达到抑制凋亡的效果 另一方面 Ｂ ｏ ８ ９ １ ４ ５ ８ 本实验只应用了流式细胞术一种方法检测细胞凋 下转第 ８页
228 江苏大学学报 ( 医学版 ) 第 27 卷 tionofcancer:posibilitiesandchalenges[j].nano medicine,2016,12(2):287-307. [4] LammersT,KieslingF,HenninkWE,etal.Drugtar getingtotumors:principles,pitfalsand(pre )clinical progres[j].jcontrolrelease,2012,161(2):175-187. [5] KouchakzadehH,ShojaosadatiSA,TahmasebiF,etal. Optimizationofananti HER2monoclonalantibodytar geteddeliverysystemusingpegylatedhumanserumal buminnanoparticles[j].intjpharm,2013,447(1/ 2):62-69. [6] ShanXH,WangP,XiongF,etal.MRIofhigh glucose metabolismtumors:astudyincelsandmicewith2 DG modifiedsuperparamagneticironoxidenanoparticles [J].MolImagingBiol,2016,18(1):24-33. [7] ThomasdeMontprévileV,QuilhotP,ChalabreyseL, etal.glut 1intensityandpaternofexpresioninthy micepithelialtumorsarepredictiveofwho subtypes [J].PatholResPract,2015,211(12):996-1002. [8] AdekolaK,RosenST,Shanmugam M,etal.Glucose transportersincancermetabolism[j].curopinon col,2012,24(6):650-654. [9] WilhelmC,BiloteyC,RogerJ,etal.Intracelularup takeofanionicsuperparamagneticnanoparticlesasa functionoftheirsurface coating[j]. Biomaterials, 2003,24(6):1001-1011. [10] 冯敏, 潘仕荣, 张静夏, 等. 两性霉素 B/ 聚乙二醇聚谷氨酸苄酯纳米粒的体外细胞摄取研究 [J]. 中国药科大学学报,2005,36(4):321-325. [11] 刘定斌, 谢 燕, 邵华武, 等. 利用表面上的小分子控制细胞黏附 [J]. 化学进展,2007,19(12):1965-1970. [12] KaushikNK,KaushikN,YooKC,etal.Lowdosesof PEG coatedgoldnanoparticlessensitizesolidtumorsto coldplasmabyblockingthepi3k/akt drivensignaling axistosupprescelulartransformation byinhibiting growthandemt[j].biomaterials,2016,87:118-130. [13] 浦鸣, 计剑, 李晓林, 等. 反应性梳状聚乙二醇改性聚酯薄膜表面及其内皮细胞相容性的研究 [J]. 高等学校化学学报,2006,27(5):951-955. [14] YangSH,LinJ,LuF,etal.Contrast enhancedsus ceptibilityweightedimagingwithultrasmalsuperpara magneticironoxideimprovesthedetectionoftumorvas cularityinahepatocelularcarcinomanudemousemodel [J].JMagnResonImaging,2016,44(2):288-295. [ 收稿日期 ] 2017-02-07 [ 编辑 ] 何承志 ( 上接第 222 页 ) [2] RomeoY,ZhangX,RouxPP.Regulationandfunction ofthersk familyofproteinkinases[j].biochem J, 2012,441(2):553-569. [3] QiuQ,JiangJ,LinL,etal.DownregulationofRSK2 influencesthebiologicalactivitiesofhumanosteosarcoma celsthroughinactivatingakt/mtorsignalingpathways [J].IntJOncol,2016,48(6):2508-2520. [4] ZhaoH,MartinTA,DaviesEL,etal.TheClinicalIm plicationsofrsk1 3inHumanBreastCancer[J].Anti cancerres,2016,36(3):1267-1274. [5] 岳萌, 刘雪娇, 丁妍, 等.Bufalin 通过细胞外信号调节激酶 /P90 核糖体 S6 激酶 2 通路对人食管癌细胞裸鼠移植瘤增殖及凋亡的影响 [J]. 中华肿瘤杂志, 2016,38(5):325-332. [6] ZeniouM,DingT,TrivierE,etal.Expresionanalysis ofrskgenefamilymembers:thersk2gene,mutated incofin Lowrysyndrome,isprominentlyexpresedin brainstructuresesentialforcognitivefunctionandlearn ing[j].hummolgenet,2002,11(23):2929-2940. [7] ChoYY.RSK2anditsbindingpartnersincelprolifera tion,transformationandcancerdevelopment[j].arch PharmRes,2017,40(3):291-303. [8] AnjumR,BlenisJ.TheRSKfamilyofkinases:emer gingrolesincelularsignaling[j].natrevmolcel Biol,2008,9(10):747-758. [9] RichardsSA,DreisbachVC,MurphyLO,etal.Char acterizationofregulatoryeventsasociatedwithmem branetargetingofp90ribosomals6kinase1[j].mol CelBiol,2001,21(21):7470-7480. [10] 陈康杏, 王籽又, 黄燕霞, 等.RSK2 与恶性肿瘤的关系及其抑制剂的研究进展 [J]. 中国病理生理杂志, 2015,31(10):1772-1779. [11] Dehan E, Basermann F, GuardavaccaroD, etal. βtrcp andrsk1/2 mediateddegradationofbimelin hibitsapoptosis[j]. MolCel,2009,33(1):109-116. [ 收稿日期 ] 2017-04-11 [ 编辑 ] 刘星星