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1 江苏农业学报 (Jiangsu J.of Agr.Sci.)ꎬ2017ꎬ33(6):1327 ~ 1332 h ttp: / / y x b.com 1327 张泽英 ꎬ 张辉 ꎬ 赵昕 ꎬ 等. shrna 沉默 C5aR 对 LPS 诱导的大鼠肾小管上皮细胞损伤的影响 [ J]. 江苏农业学报 ꎬ2017ꎬ33 (6) : doi: / j.issn shrna 沉默 C5aR 对 LPS 诱导的大鼠肾小管上皮细胞损伤的影响 张泽英 1ꎬ2 ꎬ 张辉 1 ꎬ 赵昕 1 ꎬ 黄爱妮 1 2 ꎬ 蒋思婧 (1. 武昌工学院食品与环境工程学院 ꎬ 湖北武汉 ꎻ 2. 湖北大学生命科学学院 ꎬ 湖北武汉 ) 摘要 : 为观察短发夹状 RNA(Short hairpin RNA ꎬ shrna) 阻断大鼠 C5a 受体 ( C5a receptorꎬ C5aR) 基因表达 对抑制脂多糖 (Lipopolysaccharideꎬ LPS) 诱导的大鼠肾小管上皮细胞 ( NRK 52E 细胞 ) 损伤的影响 ꎬ 将构建好的针 对大鼠 C5aR 基因的 shrna 表达质粒转染 NRK 52E 细胞系 ꎬ 经 G418 筛选后 ꎬ 形成稳定的表达 C5aR shrna 的细胞 系 ꎮ 设置空白对照组 (NC 组 ) 正常对照组 ( LPS 组 ) 阴性对照组 ( LPS+shRNAc 组 ) 和处理组 ( LPS+C5aR shrna 组 )ꎮ 采用荧光定量反转录 PCR(RT PCR) 检测细胞中白介素 6(Interleukin 6ꎬ IL 6) 肿瘤坏死因子 α( Tumor nec rosis factor alphaꎬ TNF α)mrna 的表达 ꎬ 酶联免疫吸附方法 ( Enzyme linked immunosorbent assayꎬ ELISA) 检测细胞 上清液中 TNF α IL 6 和髓过氧化物酶 (MPO) 活性 ꎬ 流式细胞仪检测各组细胞凋亡率 ꎮ 结果显示 ꎬ 与正常对照组和 阴性对照组相比 ꎬ 试验组中 C5aR shrna 能有效抑制炎症因子 TNF α IL 6 的释放 ꎬ 降低细胞凋亡率和细胞中 MPO 活性 (P<0 05)ꎮ 可见 ꎬC5aR shrna 能显著抑制由 LPS 诱导的 TNF α IL 6 等炎症因子的释放 ꎬ 改善大鼠肾脏功能 ꎬ 对 LPS 诱导的肾脓毒症损伤有明显保护作用 ꎮ 关键词 : C5a 受体 ꎻ 脂多糖 ꎻ 基因沉默 ꎻ 脓毒症 中图分类号 : S852.2 文献标识码 : A 文章编号 : (2017) Effect of silencing C5a receptor expression with shrna on rat kidney epi thelial cells with acute injury induced by lipopolysaccharide ZHANG Ze ying 1ꎬ2 ꎬ ZHANG Hui 1 ꎬ ZHAO Xin 1 ꎬ HUANG Ai ni 1 ꎬ JIANG Si jing 2 (1.College of Food and Environmental Engineeringꎬ Wuchang Institute of Technologyꎬ Wuhan ꎬ Chinaꎻ 2.School of Life Sciencesꎬ Hubei Universi tyꎬ Wuhan ꎬ China) Abstract: To investigate the effect of silencing C5a receptor ( C5aR) expression with shrna on rat kidney epithelial cells with acute injury induced by lipopolysaccharide ( LPS) ꎬ eukaryotic expression vector of small hairpin RNA targeting rat C5aR gene was constructed and transfected into rat renal tubular epithelial cell line NRK 52Eꎬ after G418 selectionꎬ stable cell line expressing C5aR shrna was got. The experiment was designed as follows: blank control group ( NC group) ꎬ normal control group ( LPS group) ꎬ negative control group ( LPS+shRNAc group) ꎬ experimental group ( LPS+ C5aR shrna group). After incubation with C5aR shrnaꎬ the expression of interleukin 6( IL 6) and tumor necrosis factor alpha ( TNF α ) mrna were detected by fluorescence 收稿日期 : quantitative reverse transcription PCRꎬ the content of 基金项目 : 国家自然科学基金项目 ( ) 作者简介 : 张泽英 (1980 )ꎬ 女 ꎬ 四川泸州人 ꎬ 博士 ꎬ 副教授 ꎬ 研究方向 TNF αꎬ IL 6 and myeloperoxidase( MPO) in the superna 为食品科学与免疫学 ꎮ (E mail)qianyezzy@ 163.com tant of cells were tested by enzyme linked immunosorbent 通讯作者 : 蒋思婧 ꎬ(E mail)jiangsijing@ hubei.edu.cn assay(elisa)ꎬ and the apoptosis ratio of each group was

2 1328 江苏农业学报 2017 年第 33 卷第 6 期 detected by flow cytometry. The results showed that C5aR shrna in the experimental group could effectively inhibit the re lease of inflammatory factors TNF α and IL 6ꎬ reduce the apoptosis rate and MPO content in cells (P<0 05) compared with that in the normal control group and negative control group. In conclusionꎬ specific short hairpin RNA targeting C5aR can significantly inhibit the release of inflammatory factors such as TNF α and IL 6 induced by LPSꎬ improve the renal function in rats and has obvious protective effect on renal sepsis injury induced by LPS. Key words: C5a receptorꎻ lipopolysaccharideꎻ gene silenceꎻ sepsis 脓毒症是目前世界上感染致死的最主要原因 ꎬ 据全球脓毒症联盟 ( Global Sepsis AllianceꎬGSA) 在 2012 年首个世界脓毒症日公布的数据 ꎬ 在 2012 年 前的 10 年时间里 ꎬ 脓毒症发病率在发达国家以每年 8% 至 13% 的速度剧增 ꎬ 而在发展中国家 ꎬ 营养不良 贫穷 疫苗缺乏等原因导致脓毒症死亡率居高不 下 [1] ꎮ 脂多糖 ( LPS)ꎬ 临床上又称内毒素 ꎬ 是 G - 菌 生长或死亡时裂解释放出来的主要成分 ꎮ 由 G - 菌 引发的脓毒症占 50% ~ 60%ꎬ 而 LPS 与其发病机制 密切相关 [2] ꎮ LPS 能激活补体系统 ꎬ 进而启动机体 内的炎症反应 ꎬ 导致各种炎性因子的释放 ꎬ 包括 IL 1 TNF а IL 2 IL 6 和 IL 8 等 ꎮ 补体片断 5a( Com plement fragmentꎬ C5a) 是最重要的补体活化产物之 一 ꎬ 它与相应的 C5a 受体 (C5aR) 结合被激活后 ꎬ 参 与脓毒症等多种疾病的病理过程 ꎮ 如何阻断 C5a 信号的下传 ꎬ 从而减轻炎症反应一直是免疫学研究 的热点问题 [3] ꎮ 本研究通过构建针对大鼠 C5aR 基 因的特异性发卡结构 RNA(shRNA) 表达质粒 ꎬ 并转 染大鼠肾小管上皮细胞 NRK 52E 细胞系 ꎬ 研究 C5aR 基因干扰对 LPS 诱导的大鼠肾脓毒症的抑制 作用 ꎬ 为进一步研究减轻急性肾脓毒症导致的肾功 能衰竭等病理过程奠定基础 ꎮ 1 材料与方法 1.1 材料 细胞 NRK 52E 细胞 ꎬ 购自美国 ATCC 公 司 ꎮ 主要试剂抗大鼠 C5aR 多克隆抗体 ꎬ 美国 SantaCruz 公司产品 ꎻGAPDH 抗体 ꎬ 杭州贤至生物有 限公司产品 ꎻRQI 无 Rnase 活性的 DNA 酶 ꎬPromega 公司产品 ꎻ 脂质体 2000 Rat TNF α Rat IL 6 ELISA Kitꎬ 美国 Invitrogen 公司产品 ꎻLPSꎬ 美国 Sigma 公司 产品 ꎻ 反转录酶 ꎬ 日本 TaKaRa 公司产品 ꎻ Realtime PCR Master Mixꎬ 日本 Toyobo 公司产品 ꎻECL 底物发 光试剂盒 ꎬ 美国 Pierce Biotechnology 公司产品 ꎻAn nexinv FITC / PI 细胞凋亡双染试剂盒 ꎬ 以及 MPO BUN Creatine 检测试剂盒 ꎬ 碧云天生物公司产品 ꎮ 主要仪器设备荧光倒置显微镜 ꎬ 德国 O lympus 公司产品 ꎻRT PCR 仪 ꎬ 美国 Invitrogen 公司产品 ꎻMRX 酶标仪 ꎬDYNEX Technologies 公司产品 ꎻ BIO RAD 转膜仪 ꎬ 广东浩瀚仪器有限公司产品 ꎻ PVDF 膜 ꎬ 美国 Millipore 公司产品 ꎻCO 2 细胞培养箱 ꎬ 美国 Thermo Scientific 公司产品 ꎻ 凝胶成像系统 ꎬ 英国 SYNGENE 公司产品 ꎻ 聚丙烯酰胺凝胶电泳仪 ꎬ 北京六一仪器厂产品 ꎮ 1.2 方法 试验分组空白对照组 ( NC 组 ): 未经 LPS 处理 ꎬ 未转染任何表达质粒的 NRK 52E 细胞 ꎻ 正常对照组 ( LPS 组 ): 未转染任何表达质粒 ꎬ 但经 LPS 处理 24 h 的 NRK 52E 细胞 ꎻ 阴性对照组 (LPS+shR NAc 组 ): 转染阴性质粒 shrnac 后经 LPS 处理 24 h 的 NRK 52E 细胞 ꎻ 处理组 ( LPS+C5aR shrna 组 ): 转染 C5aR shrna 表达质粒后经 LPS 处理 24 h 的 NRK 52E 细胞 ꎮ 脂质体转染将肾上皮细胞接种至 24 孔板 ( 每孔约 个细胞 )ꎬ 用含 10% 小牛血清的 DMEM 培养基于 37 5% CO 2 的培养箱中培养 ꎬ 使转染时细胞的融合度为 40% ~ 50%ꎬ 在无血清的 DMEM 培养基中加入 C5aR shrna 表达质粒 ꎬ 室温孵育 5 minꎬ 在另一无血清的 DMEM 培养基中加入脂质体 2 000ꎬ 室温孵育 5 minꎮ 将上述两者混合 ꎬ 室温孵育 20 minꎬ 将上述混合液轻轻加入各细胞孔中 ꎬ 混匀 ꎬ 放入培养箱中在 37 5% CO 2 培养箱中培养 ꎬ 转染 6 h 后 ꎬ 加入含 25% 小牛血清的 DMEMꎬ 使培养基中小牛血清终浓度为 10%ꎬ 继续培养 ꎬ 转染 48 h 后 ꎬ 将大肠杆菌 LPS 加入培养基 ꎬ 刺激 24 hꎮ 荧光定量 RT PCR 检测细胞中炎症因子 TNF α IL 6 mrna 的表达收集细胞后 ꎬ 提取 RNAꎮ 用荧光定量 RT PCR 法检测细胞中炎症因子 TNF α IL 6 mrna 的表达 ꎬ 每组样本重复 3 次 ꎬ 以

3 张泽英等:shRNA 沉默 C5aR 对 LPS 诱导的大鼠肾小管上皮细胞损伤的影响 1329 相对 Ct 值( 即 2 Ct ) 表示目的基因的相对表达量ꎬ ( 图 1 图 2) 显示:正常 NRK 52E 细胞中 C5aR mr 上 下 游 引 物 分 别 为 5 CCACCACGCTCTTCTGTC C5aR mrna 和 C5aR 蛋白的表达量明显增加 ( P< 以正常对照组细胞为对照ꎮ TNF α 表达量检测的 TACTG 3 和 5 CTTGGTGGTTTGCTACGACG 3 ꎻIL 6 NA 和 C5aR 蛋白 的 表 达 量 相 对 较 低ꎬ LPS 刺 激 后 0 05) ꎻ转染 C5aR shrna 表达质粒后 C5aR mrna 表达量检测的上 下游引物分别为 5 TGGAGTTC 和 C5aR 蛋白的表达与未转染和转染阴性对照质粒 TCTGT 3 ꎻGAPDH 表达量检测的上 下游引物分别 制 LPS 刺激引起的 C5aR mrna 和 C5aR 蛋白表达 CGTTTCTACCTGG 3 和 5 GGTCCTTAGCCACTCCT 为 5 CTGAGAGGGAAATCGTGCGT 3 和 5 CCA CAGGATTCCATACCCAAGA 3 ꎮ 1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 收集细胞ꎬ用 4 预冷 PBS 重悬细胞ꎬ2 000 r / min离心 5 ~ 10 minꎬ 洗涤细胞ꎬ加入 Binding Buffer 悬浮细胞ꎬ加入 An 的细胞相比明显下降ꎬ说明 C5aR shrna 可明显抑 上调ꎻ阴性对照组 C5aR mrna 和 C5aR 蛋白与空白 对照组无明显差异( P>0 05) ꎬ说明转染过程本身对 细胞中 C5aR mrna 和 C5aR 蛋白表达量无明显影 响ꎮ nexin V FITC 轻轻混匀后ꎬ室温避光孵育 15 minꎬ加 入 PI 轻轻混匀后ꎬ室温避光孵育 5 minꎬ上机检测ꎮ 1.2.5 ELISA 法检测细胞培养上清液中 TNF α IL 6 含量和髓过氧化物酶( MPO) 活性 收集各组细胞 上清液ꎬ1 000 r / min离心 10 minꎬ取上清ꎮ 按照试剂 盒操作说明ꎬ每孔各加入稀释成不同浓度的标准品 或待测样品溶液ꎬ充分混匀后于 37 保温 120 minꎬ 洗涤后每孔中加入一抗工作液ꎬ充分混匀后于 37 NC:空白对照组ꎻ LPS:正常对照组ꎻ LPS shrnac:阴性对照组ꎻ 应板置于 37 保温 30 minꎬ 洗涤后每孔加入底物 图 1 C5aR shrna 干扰对 C5aR mrna 表达的影响 保温 60 minꎮ 洗涤后每孔加酶标抗体工作液ꎮ 将反 工作液ꎬ于 37 避光保温 15 minꎬ每孔加入终止液ꎬ 混匀ꎬ并在 30 min 内用酶标检测仪测 OD 450 值ꎮ LPS C5aR shrna:处理组ꎮ 表示与 NC 组相比差异显著( P< 0 05) ꎮ Fig.1 Effects of C5aR shrna interference on the expression of C5aR mrna 1.2.6 细胞通透性改变的检测 按照文献[4] 的方 法ꎬ用 HRP 作为示踪剂检测肾上皮细胞通透性改 变ꎮ 将大鼠肾小管上皮细胞接种在 Transwell cham ber 模型中ꎬ细胞接种密度为每孔 2 10 5 个ꎮ 细胞融 合成单层后ꎬ按试验分组处理细胞后ꎬ在上室加入 HRP 至终浓度 0 6 mg / Lꎬ37 5 CO 2 孵育 1 hꎮ 在每个双层小室的顶室和底室分别取样品 100 μlꎬ 置于 96 孔板中ꎬ并向每孔中加入联苯二胺ꎬ显色后 加入终止液ꎬ酶标仪检测 HRP 吸光度 OD 450 的变化ꎮ 1.2.7 统计分析 所有计量数值均用平均数±标准 差表示ꎬ应用 SPSS16.0 统计软件进行方差分析ꎮ 2 结果与分析 各处理见图 1 注ꎮ 图 2 C5aR shrna 干扰对 C5aR 蛋白表达的影响 Fig.2 Effects of C5aR shrna interference on the expression of C5aR protein 2.1 C5aR 基因沉默对 C5aR mrna 和 C5aR 蛋白 2.2 C5aR 基因沉默对 TNF α IL 6 mrna 表达的 表达的影响 影响 收集各试验组 NRK 52E 细胞ꎬ提取 RNA 和总 蛋白质ꎬ采用荧光定量 PCR 法检测 mrna 水平的表 达ꎬ采用 Western blot 检测 C5aR 蛋白的表达ꎮ 结果 由图 3 可见ꎬ 正常 NRK 52E 细胞 TNF α IL 6 mrna 的表达量相对较低ꎬLPS 刺激后其表达量明 显增加( P<0 05) ꎬTNF α 增加了约 20 0 倍ꎬIL 6 增

4 1330 江苏农业学报 2017 年第 33 卷第 6 期 加了约 倍 ꎮ 重组质粒 C5aR shrna 转染入 NRK 52E 细胞后 ꎬTNF α IL 6 mrna 的表达明显下 调 (P<0 05)ꎬ 可见 C5aR 基因沉默可明显抑制 LPS 刺激后 TNF α IL 6 mrna 表达的上调 ꎮ 阴性对照 组 TNF α IL 6 mrna 与空白对照组无明显差异 (P>0 05)ꎮ 各处理见图 1 注 ꎮ 表示与 NC 组相比差异显著 (P<0 05)ꎮ 图 3 C5aR shrna 干扰对 TNF α IL 6 mrna 表达的影响 Fig.3 Effects of C5aR shrna interference on the expression of tumor necrosis factor alpha( TNF α) and interleukin 6( IL 6) mrna 2.3 C5aR 基因沉默对大鼠肾上皮细胞上清液中炎症因子含量的影响用 ELISA 法检测 LPS 刺激 12 h 后各处理细胞培养上清中炎症因子 TNF α IL 6 含量 ꎮ 结果 ( 图 4) 显示 ꎬ 与正常细胞组及对照转染组相比 ꎬ 重组质粒 PLVX C5aR shrna 转染入 NRK 52E 细胞后 ꎬ 上清液中炎症因子 TNF α IL6 含量均显著下降 ( P<0 05) ꎮ 炎症发生过程中 ꎬ 一般都伴随着中性粒细胞的浸润 ꎮ 髓过氧化物酶 ( MPO) 是中性粒细胞嗜天青颗粒产生的一种重要的过氧化物酶 ꎬ 其含量的增高可以反映中性粒细胞在某一组织中的增高 ꎬ 间接反映炎症的存在 [5] ꎮ 图 5 显示 ꎬNRK 52E 细胞在受到 LPS 刺激后 ꎬ 细胞 MPO 活性显著升高 (P<0 05)ꎬ 而 C5aR 基因沉默对 LPS 诱导 NRK 52E 细胞 MPO 活性有显著的抑制作用 (P<0 05)ꎮ 各处理见图 1 注 ꎮ 表示与 NC 组相比差异显著 (P<0 05)ꎮ 图 4 C5aR shrna 干扰对大鼠肾上皮细胞上清液中炎症因子含量的影响 Fig.4 Effects of C5aR shrna interference on inflammatory factors content in supernatant of rat renal tubular epi thelial cells 2.4 C5aR 基因沉默对大鼠肾上皮细胞中 MPO 活性的影响中性粒细胞是炎性反应可溶性介质的来源 ꎬ 在 各处理见图 1 注 ꎮ 表示与 NC 组相比差异显著 (P<0 05)ꎮ 图 5 C5aR shrna 干扰对大鼠肾上皮细胞中 MPO 活性的影响 Fig.5 Effects of C5aR shrna interference on myeloperoxidase ( MPO) activity in rat renal tubular epithelial cells 2.5 C5aR 基因沉默对大鼠肾上皮细胞通透性的影响由图 6 可见 ꎬLPS 刺激 NRK 52E 细胞后 ꎬ 其通透性增加 (P<0 05)ꎬ 与未转染和转染阴性对照质粒的 NRK 52E 细胞相比 ꎬ 转染 C5aR shrna 表达质粒后 ꎬ 细胞通透性显著下降 (P<0 05)ꎮ

5 张泽英等:shRNA 沉默 C5aR 对 LPS 诱导的大鼠肾小管上皮细胞损伤的影响 1331 2.6 C5aR 基因沉默对的 RNK 52E 细胞凋亡率的 影响 采用 AnnexinⅤ FITC / PI 双标记流式细胞术检 测 RNK 52E 细胞凋亡率ꎬ得到二维散点图( 图 7) ꎬ 二维散点图中横坐标为 FITC 的荧光相对强度ꎬ纵坐 标为 PI 的荧光相对强度ꎬ采用对数形式ꎮ 由图 7 图 8 检测结果可知ꎬ经 LPS 处理后ꎬ转 各处理见图 1 注ꎮ 表示与 NC 组相比差异显著( P<0 05) ꎮ 图 6 C5aR shrna 干扰对大鼠肾上皮细胞通透性的影响 Fig.6 Effects of C5aR shrna interference on permeability of rat renal tubular epithelial cells 染 C5aR shrna 的 RNK 52E 细胞凋亡率为11.13 ± 1.45 ꎬ而未转染的 RNK 52E 细胞和转染阴性质粒 的 RNK 52E 细胞凋亡率分别为 42.95 ± 1.26 和 42.54 ±0.98 ꎬ与未转染的 RNK 52E 细胞和转染 阴性质粒的 RNK 52E 细胞相比ꎬ转染 C5aR shrna 的 RNK 52E 细胞凋亡率显著下降( P<0 05) ꎮ 各处理见图 1 注ꎮ 图 7 各处理细胞流式细胞图 Fig.7 Flow cytometry of cells of each experimental group 3 讨 论 正相关ꎮ 在严重创伤 烧伤 休克 重症感染等应激 脏中ꎬC5aR 主要在肾脏系膜细胞 近曲小管上皮细 MCP 1 等ꎬ在急性损伤的发生 发展起着不可忽视 的作用 [6] ꎮ TNF α IL 6 IL 6 等被认为是脓毒症病 肾脏是代谢产物及毒素排泄的主要途径ꎮ 在肾 胞 血管平滑肌细胞 内皮细胞 远曲小管和输尿管 膀胱的移行上皮细胞中表达ꎬ其在肾损伤中的作用 一直是研究的热点ꎮ C5aR 可介导肾小球和肾小管 细胞的损伤ꎬ诱导细胞释放 TNF α IL 6 和 IL 8 等 多种细胞因子ꎬ其表达量与肾脏损伤的严重程度呈 状态下ꎬ来自于感染部位的 LPS 大量进入体内ꎬ并 引起炎 症 介 质 的 大 量 合 成 释 放ꎬ 如 TNF α IL 6 情发展的重要介质ꎮ 为了研究在肾脏脓毒症中 LPS 是否激活了补 体系统ꎬ促使 C5a 与 C5aR 结合ꎬ诱导炎症因子 TNF α IL 6 和 IL 8 等的合成和释放ꎬ加速炎症反应ꎬ我

6 1332 江苏农业学报 2017 年第 33 卷第 6 期 各试验组见图 1 注 ꎮ 表示与 NC 组相比差异显著 (P<0 05)ꎮ 图 8 C5aR shrna 干扰对大鼠肾上皮细胞凋亡率的影响 Fig.8 Effects of C5aR shrna interference on apoptosis rate of rat renal tubular epithelial cells 们设计了针对大鼠补体受体 C5aR 作为抑制肾脏损伤的靶位点 ꎬ 进一步探讨 C5aR 对肾脏脓毒症的影响 ꎬ 研究短发夹状 RNA( shrna) 基因沉默 C5aR 抑制 LPS 诱导的肾脏脓毒症的作用机制 ꎮ 在试验中观察到 ꎬLPS 能引起大鼠肾小管上皮细胞的损伤 ꎬ 经 LPS 刺激 24 h 后 ꎬ 在未转染的 RNK 52E 细胞 转染阴性质粒 PLVX shrnac 的 RNK 52E 细胞和转染 PLVX C5aR shrna 的 RNK 52E 细胞均出现 C5aR mrna 及蛋白质的表达 ꎬ 而与未转染的 RNK 52E 细胞和转染阴性质粒的 RNK 52E 细胞相比 ꎬ 转染 PLVX C5aR shrna 的 RNK 52E 细胞中 C5aR mrna 和蛋白质表达量显著降低 ꎬ 细胞活性升高 ꎬ 细 胞凋亡率下降 ꎬ 炎症因子的表达显著下调 ꎮ 研究结果表明 ꎬLPS 诱导的细胞损伤与 C5aR 的表达上调有关 ꎬC5aR 基因沉默可以明显抑制肾脏上皮细胞的凋亡和炎症因子的释放 ꎬ 对其损伤起到一定的抑制作用 ꎮ 进一步探讨了补体系统在肾脓毒症损伤中的作用机制 ꎬ 采用基因沉默的方式干扰 C5aR 的表达可以减轻肾脏损伤 ꎬ 这为肾脏脓毒症的预防和治疗提供了新的研究思路 ꎮ 参考文献 : [1] REINHART Kꎬ KISSOON N Tꎬ DANIELS Rꎬ et al. What we learned from the first World Sepsis Day [J]. Critical Careꎬ 2012ꎬ 27 (6): [2] 于冬梅 ꎬ 张铁铮 ꎬ 周锦. 右美托咪定对内毒素血症大鼠急性肾损伤的保护作用 [ J]. 实用药物与临床 ꎬ 2014ꎬ 17 ( 12): [3] 王会会 ꎬ 陈国江 ꎬ 黎燕 ꎬ 等. 补体 C5a C5a 受体及其拮抗剂的研究进展 [J]. 国际药学研究杂志 ꎬ 2010ꎬ 37(3): [4] 闫承慧 ꎬ 于海波 ꎬ 张效林 ꎬ 等. 人脐静脉内皮细胞单层通透性改变的效应因子 [J]. 中国组织工程研究与临床康复 ꎬ 2011ꎬ 15 (46): [5] 代国杰 ꎬ 朱建津 ꎬ 高琳琳 ꎬ 等. 褪黑素对脂多糖刺激小鼠体内炎症反应 [J]. 食品与生物技术学报 ꎬ 2010ꎬ 29(1): [6] 崔文瑶. 丙泊酚对内毒素血症大鼠肾损伤的保护作用及其机制的分析 [D]. 辽宁 : 中国医科大学 ꎬ ( 责任编辑 : 张震林 )

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