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1 流式细胞仪 FC500 原理及应用 贝克曼库尔特市场部姜桂青

2 Beckman Coulter 流式简介

3 目录 1 流式细胞术 2 分析型 FCM 原理 3 电压补偿调节 4 FCM 应用

4 1 流式细胞术 (Flow Cytometry,FCM) 是对 悬液中的单细胞或其他生物粒子, 通过检测标 记的荧光信号, 实现高速 逐一的细胞定量 分析和分选的技术 Flow Cytometry 特点 : 1. 测量速度快 ; Microscope 光源激光自然光 灯光 氙 ( 汞 ) 灯 对象细胞 生物粒子细胞 生物粒子 承载工具鞘液及流动室载 ( 盖 ) 玻片 检测信号光学信号形态及染色 放大方式 2. 可进行多参数测量 PMT, 放大电路 ; 目镜 X 物镜 3. 是一门综合性的高科技方法 ; 统计计算机,>5000 人工,200 结果多参数, 综合分析简单, 单参数

5 流式的检测对象 细胞 细菌 病毒颗粒 染色体 或者其他单个的生物颗粒 可溶性细胞因子等

6 如何让目标细胞特异性带上荧光 抗原抗体结合 荧光素特异性结合细胞器 & 生物大分子 生物大分子之间的结合, 如 PS 与 ANNEXIN V 的结合 通过代谢不同对细胞进行识别

7 流式细胞仪的检测范围 细胞结构 = 细胞大小 = 细胞粒度 = 细胞表面面积 =DNA 含量与细胞周期 =RNA 含量 细胞功能 = 细胞表面 / 胞浆 / 核的特异性抗原 = 细胞活性 = 细胞内细胞因子 = 酶活性 = 激素结合位点 = 细胞受体 = 蛋白质含量

8 2 细胞标记荧光 通过信号处理系统转换为数字信号 得到直方图, 散点图等图形, 并得到百分数, 荧光强度等统计结果 激光照射到单个细胞上, 产生光学信号 通过滤光片分光,PMT 转换为电脉冲信号

9 2 流路 流动室 鞘液 SHEATH 样本流 SAMPLE 单细胞悬液 5*10 5 ~1*10 6 个 /ml 光路 光源 滤片 电路 光电倍增管 PMT HV A/D 转换 u 统计 : 计算机

10 2 流 路 u 单细胞悬液 u 大多数仪器是在 µm 大小的孔径中, 将细胞悬液注射进入鞘液中 u 这一过程, 成为流体动力学聚焦 Injector Tip Sheath fluid Fluorescence signals Focused laser beam

11 2 光路 检测对象的识别 散射光信号 前向散射光 (FS) 侧向散射光 (SS) 检测细胞大小 检测细胞颗粒度 荧光信号 自发荧光 转染检测细胞分类 / 表达 荧光标记

12 前向散射光 Laser FS Sensor 前向散射光 (FS) 信 号的代表细胞的大小

13 侧向散射光 Laser SS Sensor 侧向散射光 (SS) 信 号的代表细胞的颗粒 度

14 外周全血细胞散射光双参数点图 ( 红细胞溶解后 ) FS SC 可以根据细胞的大小和颗粒度这两个基本特征, 对细胞进行初步的分群和分类

15 荧光信号 u 每种荧光染料均有特定的激发波长, 并激发后会有发射波长, 流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长. u 利用各种不同波长的光学滤片来收集 ( 检测 ) 这些光学信号

16 荧光信号标记 荧光素偶联抗体 CD19-PE 通过不同试剂对细胞进行特异性检测

17 常用荧光染料的特性 荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长 (nm) 用途 颜色 FITC 免疫荧光 绿色 PE(RD1) 免疫荧光 橙色 ECD 免疫荧光 橙红 PeCy 免疫荧光 红 PI DNA 染色 橙红 PECy 免疫荧光 深红 PerCP APC

18 光路 - 滤片特性 u 长通滤片 (Long Pass filter,lp) 允许长于设定波长的光通过 u 短通滤片 (Short Pass filter,sp) 允许短于设定波长的光通 过 u 带通滤片 (Band Pass filter,bp) 允许一定带宽的波长通过 u 带阻滤片 (Band Block filter,bk)- 选择性地滤除某一波长区段 的光线 u 二向色性滤片 (Dichroic filter) 当以一定角度放置滤片时, 该滤片可以通过一定波长以上或以下的光, 同时 也可以阻断并折射该波长以下或以上的光 可以为 LP 或 SP

19 2 SS FL1 FITC 500LP 525BP 675BP 620BP FL3 ECD FL4 PC5 575BP 755BP FL2 PE FL5 PC7

20 2 电路 光电倍增管 Photomultiplier tube (PMT) 1 光学信号电信号 2 增加 PMT 的电压及增益, 可将脉冲信号进行放大 线性放大 (Lin): 输出信号与输入信号成线性关系 对数放大 (Log): 输出信号与输入信号成对数关系

21 ADC (analog-to-digital converter) 模拟数字转换器, 将电子信号转换为荧光强度数值 把连续分布的信号分成不连续的数据通道 (channel), 一个通道代表某一特定光强度的范围

22 3 电压补偿调节 电压调节 : 利用同型对照设置背景 同型对照的选择原则 样本管 : 纯化的 CDw25+PE 标记的抗 MouseIgG1+ 样本同型对照管 : 纯化的同型对照 +PE 标记的抗 MouseIgG1+ 样本 目的 : 用于消除由于抗体非特异性与细胞结合而产生的背景染色

23 电压的调节 设定阴性和阳性信号强度的临界点

24 电压的调节 电压适当 电压太低 电压太高

25 补偿的调节 A B 如何实现多色荧光检测?

26 补偿的调节 FITC 单染

27 补偿的调节 PE 单染

28 补偿的调节 补偿不足 补偿正确 补偿稍过 补偿过度 电压正确, 补偿未调 电压不正确, 补偿不可能好 电压偏小, 补偿未调

29 补偿的调节 多色补偿 多色补偿调节就是在双色补偿调节的基础上, 进行多色的两两补偿调节, 原理相同, 只是增加工作量 自动化补偿 随着软件功能的增强, 现在可以实现在线自动化的多色补偿调节 也可以进行实验后的离线调节

30 流式细胞仪测定的结果 百分比 目标细胞占选定细胞群或所有细胞的比例绝对浓度 目标细胞在样本中的浓度 (cells/ul) 荧光强度 单个目标细胞上表达某一个蛋白的多少变异系数 所有目标细胞表达某一个蛋白的离散程度

31 4 淋巴细胞亚群分析 细胞凋亡检测 细胞周期检测

32 T 细胞亚群 Innate Immune Response (no antigen specificity, no memory) Adaptive Immune Response (specificity to antigens after presentation, memory ) NK T CD3+ B CD19+ CD3- CD56+ T4 CD3+CD4 + T8 CD3+CD8+ memb PC Treg TH1 TH2 TH17 CD27+IgM+ (-) CD38++ CD138+ FoxP3+ CD25++CD127 +/- IFNγ IL-2 TNFα IL-4 IL-6 IL-10 IL17

33 一 淋巴细胞亚群特异 CD 分子 T 细胞 :CD3+ T4 细胞 :CD3+CD4+ T8 细胞 :CD3+CD8+ B 细胞 :CD3-CD19+ NK 细胞 :CD3-CD56+

34 淋巴亚群分析

35 u 注意事项 : 1 样本要新鲜, 尽量在 24h 内检测 ( 加抗凝血剂 ) 2 裂解要完全, 负责大量红细胞血小板会残留 3 洗涤去碎片 4 CD45 设门更准确

36 二 细胞凋亡检测 正常细胞 (Normal Cell): 膜内 ---- 磷脂酰丝氨酸 (PS) 膜外 ---- 磷脂酰胆碱 鞘磷脂 凋亡细胞 (Apoptotic Cell): 膜内 ---- 磷脂酰丝氨酸 (PS) 膜外 ---- 磷脂酰胆碱 鞘磷脂 PS 碘化丙啶 (Propidium Iodide, PI) 是一种核酸染料, 它不能透过完整的细胞膜, 但对凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红

37 检测方法 : 坏死细胞 晚凋细胞 收集细胞并重悬于 Binding Buffer( 结合液 ) 中 活细胞 早期凋亡细胞 加荧光标记的 Annexin V 和 PI 室温 避光孵育 5 分钟 流式细胞仪检测结果

38 u 注意事项 : 1 贴壁细胞要用不含 EDTA 的胰酶消化 (EDTA 能螯合 Ca+, 影响 Annexin-V 与 PS 的结合 ) 2 胰酶消化时间不宜过长, 否则容易假阳性

39 三 细胞周期 G0-G1 期 : 有丝分裂到 DNA 复制前的一段时期, 又称合成前期, 此期主要合成 RNA 和核糖体 (2C) S 期 : 即 DNA 合成期, 在此期, 除了合成 DNA 外, 同时还要合成组蛋白 (2C-4C) G2-M 期 : 为 DNA 合成后期, 是有丝分裂的准备期 在这一时期,DNA 合成终止, 大量合成 RNA 及蛋白质, 包括微管蛋白和促成熟因子等 利用特殊的荧光染料 (PI EB AO 等 ) 与细胞内 DNA 碱基结合, 被荧光染料染色的细胞在激光照射下发射出荧光, 荧光强度与 DNA 含量成正比 流式细胞仪通过测定细胞的荧光强度推算出细胞的 DNA 含量

40 举例 : 药物对细胞周期的影响 经七叶皂苷诱导后, 细胞被阻滞在 G1 期 表现在 G1 期细胞明显增多,S 期明显减少

41 举例 : 药物对细胞周期的影响 经紫杉醇诱导后, 细胞被阻滞在 G2 期 表现在 G2 期细胞明显增多,S 期或 G1 期明显减少

42 u 注意事项 : 1 用 300 目的滤膜过滤, 去除细胞团块, 防止假阳性 2 细胞通透剂种类很多, 但用于碘化丙啶 (PI) 染色进行细胞周期和倍体分析的细胞通透剂, 通常为 70% 冷乙醇 3 加入 RNA 酶 ( 由于 PI 也可染 RNA, 故要去除 RNA)

43 细胞凋亡时, 核酸内切酶激活, 导致 DNA 断裂, 当细胞用乙醇处理后细胞膜上出现漏洞 小片段 DNA 从细胞内释放出来, 可在二倍体 C0/ G1, 峰前出现 亚二倍体 峰, 即细胞凋亡峰 (APO 峰 )

44 姜桂青

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