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笏邢
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1 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (1): 薯蓣皂苷元联合 TRAIL 对非小细胞肺癌 A549 细胞的协同作用及其中效原理评价何焱 1, 王继双 1, 张鹏 1, 张文静 1 1,, 黄启来 2*, 华子春 1, 2* (1. 澳门科技大学中医药学院 / 澳门药物与健康应用研究所 / 中药质量研究国家重点实验室, 澳门 ; 2. 南京大学医药生物技术国家重点实验室, 江苏南京 ) 摘要 : 利用中效原理评价薯蓣皂苷元与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TNF-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL) 联合应用于非小细胞肺癌 A549 细胞的相互作用, 并探讨可能的作用机制 MTT 法观察两药对 A549 和人肾上皮 293T 细胞的增殖抑制作用运用中效原理 (Chou-Talalay 合用指数法 ) 判定两药的相互作用 Hoechst 荧光染色流式细胞术检测两药联合对细胞凋亡的影响 Western blotting 检测凋亡相关蛋白表达的变化薯蓣皂苷元和 TRAIL 均能剂量依赖性地抑制 A549 细胞增殖运用中效原理计算合用指数, 当 f a = 0.1, CI > 1; 当 f a > 0.1, CI < 1 对于 A549 细胞, 薯蓣皂苷元与 TRAIL 合用, IC 50 由 μmol L 1 降低到 μmol L 1 (P < 0.05); 而对于 293T 细胞, 合用前后 IC 50 分别为和 μmol L 1 (P > 0.05) 荧光显微镜观察及流式细胞术检测结果表明, 两药合用使细胞凋亡比例增加联合用药组中 Caspase-8 Caspase-9 Bid Caspase-3 激活和 PARP 切割明显增加 ; Bcl-2 表达减少, 而 Bax 表达增加 ; MAPK 途径中 p38 JNK 和 ERK 明显激活结果显示, 薯蓣皂苷元和 TRAIL 具有协同诱导 A549 细胞凋亡的作用, 机制与线粒体途径死亡受体途径和 MAPK 信号途径均相关关键词 : 非小细胞肺癌 ; 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 ; 薯蓣皂苷元 ; 中效原理 ; 协同效应中图分类号 : R965 文献标识码 : A 文章编号 : (2013) Synergistic apoptotic effect of the combination of diosgenin and TRAIL on non-small-cell lung cancer cell line A549 evaluated with the Chou-Talalay method HE Yan 1, WANG Ji-shuang 1, ZHANG Peng 1, ZHANG Wen-jing 1, HUANG Qi-lai 1, 2* 1, 2*, HUA Zi-chun (1. Faculty of Traditional Chinese Medicine and Macau Institute for Applied Research in Medicine and Health, the State Key Laboratory for Quality Research in Chinese Medicine, Macau University of Science and Technology, Macau , China; 2. The State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, Nanjing University, Nanjing , China) Abstract: This study is to investigate the apoptotic induction effect of the combination of diosgenin and TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) on non-small-cell lung cancer cell line A549 by using the Chou- Talalay method, and observe the mechanism of the combination. The apoptotic effect of diosgenin or TRAIL alone and their combination on A549 and normal cell line 293T proliferation was measured by MTT assay. Chou-Talalay method was used to evaluate the combination effect. Apoptosis was examined by Hoechst staining and flow cytometry assay. Western blotting detects the expression of apoptosis-associated proteins. Diosgenin or TRAIL alone can inhibit proliferation of A549 in a concentration-dependent manner. According to the Chou-Talalay method, when f a = 0.1, CI > 1, when f a > 0.1, CI < 1. Combined with TRAIL, the IC 50 of 收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : 澳门科技发展基金资助项目 (071/2009/A3, 091/2009/A). * 通讯作者 Tel / Fax: , zchua@nju.edu.cn

2 46 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (1): diosgenin decreases from to μmol L 1 (P < 0.05) on A549 cells. But for 293T cells, IC 50 of diosgenin does not change significantly. As with Hoechst staining and flow cytometry assay, the apoptosis ratios also increased in the combination group. At protein expression level, combination-treated group displays increased Caspase-8, Caspase-9, Bid, Caspase-3 activation and PARP cleavage, significantly decreased Bcl-2 and increased Bax expression, and MAPK pathways were activated. The combination of diosgenin and TRAIL has synergistic effect on A549 cells. Key words: non-small-cell lung cancer; TNF-related apoptosis-inducing ligand; diosgenin; Chou-Talalay method; synergistic effect 肺癌是世界上死亡率最高的恶性肿瘤之一, 其中 80% 以上是非小细胞肺癌 (NSCLC) [1] 化学疗法作为其主要治疗手段, 在治疗过程中发挥着重要的作用虽然目前化疗药物为数不少, 但大多有效率低临床使用的化疗药物主要通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥抗癌效果, 但同时其非选择性杀伤正常细胞也给患者带来了诸多毒副作用, 严重影响了化疗的耐受性和依从性因此临床上迫切需要高效低毒的非小细胞肺癌治疗方法肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TNF-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL) 即凋亡素 2 配体 (apoptosis-2 ligand, Apo-2L) 是肿瘤坏死因子 TNF 超家族成员之一, 通过与死亡受体结合而启动凋亡信号, 后期也有线粒体通路的参与, 最终诱导细胞凋亡 [2] TRAIL 对肿瘤细胞呈高选择性的杀伤效应, 可快速诱导肿瘤细胞凋亡, 而对正常组织并不敏感并且在中国的 III 期临床试验已于近期完成, 在临床的广泛应用展现出诱人的前景, 但目前在治疗过程中遇到的抵抗问题又限制了其进一步的广泛应用因此, 筛选和发现对 TRAIL 诱导的细胞凋亡具有协同作用的药物将对 TRAIL 未来的临床应用具有重要意义薯蓣皂苷元 (diosgenin) 是一种来源广泛的甾体皂苷元 ( 图 1), 在穿龙薯蓣葫芦巴闭鞘姜等植物中含量较高研究发现, 薯蓣皂苷元具有抗癌抗炎抗菌降血脂抗血小板聚集等多种药理学作用 [3] 目前尚无文献报道薯蓣皂苷元与 TRAIL 合用在 A549 细胞中的效应因此, 本研究考察薯蓣皂苷元与 TRAIL 联合应用于 A549 细胞, 探索作用效果及 Figure 1 Chemical structure of diosgenin (Dio, M W ) 相关机制, 为非小细胞肺癌的治疗提供新策略材料与方法细胞株及试剂人非小细胞肺癌 A549 细胞株和人肾上皮 293T 细胞株 (ATCC 公司, 美国 ) F-12K 培养基, 高糖 DMEM 培养基, 胎牛血清 FBS, 100 青霉素 / 链霉素混合液及 0.05% EDTA- 胰酶 (Invitrogen, 美国 ); 四甲基偶氮唑盐 [3-(4, 5- dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide, MTT, Ameresco, 美国 ]; 二甲基亚砜 (dimethyl sulfoxide, DMSO, Ameresco, 美国 ) 薯蓣皂苷元标准品 ( 广东省药物研究所 ); 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TRAIL, 南京大学医药生物技术国家重点实验室 ) [4] ; Hoechst 荧光染料 ( 碧云天生物技术研究所, 南京 ) p-p38 MAP kinase p38 JNK PARP Bcl-2 Bax 及 Caspase-3 兔多克隆抗体 (Cell Signaling Technology, 美国 ) ; p-erk p-jnk ERK Caspase-8 Caspase-9 Bid 及 α-tublin 鼠单克隆抗体 (Santa Cruz, 美国 ); donkey-anti-rabbit IRDye800CW, goat-anti-mouse IRDye800CW 远红外二抗 (Licor Biosciences, 美国 ) 十二烷基硫酸钠 (sodium dodecyl sulfate, SDS) 丙烯酰胺 (acrylamide) 甲叉双丙烯酰胺 (N, N-methyhene bisarylamide) 过硫酸铵 (ammonium persulfate, AP) 甘氨酸 (glycine, Gly) 三羟基甲基氨基甲烷 [tris(hydroxymethyl)metyl aminomethane, Tris] 及 N, N, N ', N '- 四甲基乙二胺 (N, N, N ', N '- tetramethylethylenediamine, TEMED) 均购于 Ameresco 公司 ( 美国 ); 考马斯亮蓝 (Coomassie brilliant blue G-250) 和溴酚蓝 (bromophenol blue) 为国药集团化学试剂有限公司 ( 中国 ) 产品细胞培养取人非小细胞肺癌 A549 细胞, 于 37 5% CO 2 饱和湿度温箱中培养, 用含 10% FBS 青霉素 (100 u ml 1 ) 和链霉素 (100 mg ml 1 ) 的 F-12K 培养基取人肾上皮 293T 细胞, 于 37 5% CO 2 饱和湿度温箱中培养, 用含 10% FBS 青霉素

3 何焱等 : 薯蓣皂苷元联合 TRAIL 对非小细胞肺癌 A549 细胞的协同作用及其中效原理评价 47 (100 u ml 1 ) 和链霉素 (100 mg ml 1 ) 的高糖 DMEM 培养基 MTT 法测定药物对细胞增殖作用的影响取对数生长期的 A549 细胞, 胰酶消化后制成单细胞悬液, 调整细胞数为 /ml (293T 细胞的细胞数为 /ml), 按照 100 μl/ 孔接种于 96 孔板实验分为空白组对照组及梯度浓度的给药组 ( 薯蓣皂苷元组 TRAIL 组及薯蓣皂苷元联合 TRAIL 组 ), 每组设 4 个复孔药物与细胞孵育 24 h 后, 加入 MTT 溶液 (5 mg ml 1 ) 10 μl, 继续孵育 4 h, 孵育结束弃去培养基每孔加入 DMSO 100 μl, 振荡器振荡 10 min 溶解甲结晶, 微孔板分光光度计设置检测波长 570 nm 和参比波长 650 nm, 读取不同处理组的吸光度值 (A) 按公式计算细胞的抑制率, 抑制率 (%) = 1 ( 处理组平均吸光度值空白组平均吸光度值 ) / ( 对照组平均吸光度值空白组平均吸光度值 ) 100% 药物联合应用评价采用中效原理 (Chou- Talalay 合用指数法 ) 对所得数据进行分析 [5] 药物作用效应即肿瘤抑制率 (f a ) 与之前提到的抑制率的计算方法一致合用指数法的中效方程式为 : f a /f u = (D/Dm) m, 两边取对数 : lg (f a /f u ) = mlgd mlgdm, 设 Y = lg (f a /f u ), X = lgd, b = m, a = mlgdm, 得线性方程式 : Y = a + bx ( 其中 f u = 1 f a, D 为药物浓度, m 为中效曲线斜率, Dm 为中效浓度 ) 两药合用在不同效应的合用指数 (CI) 的计算公式为 : CI = (D 1 /D X1 ) + (D 2 /D X2 ) + α (D 1 D 2 /D X1 D X2 ), 其中 D X1 D X2 为两药单用产生 X 效应时各自所需浓度, D X (1, 2) 为两药合用产生 X 效应时所需浓度, 均可由中效方程式求得 ; D 1 D 2 为两药合用产生 X 效应时各自所需浓度, 可由公式 D 1 + D 2 = D X (1, 2) 求出两种作用机制不同的药物合用时 α = 0, 作用机制相同的药物合用时 α = 1 薯蓣皂苷元和 [2, TRAIL 作用机制不同 3], 故 α = 0 若 CI < 1, 认为两药有协同作用, CI = 1 为相加作用, CI > 1 为拮抗作用 [5] 荧光显微镜观察细胞凋亡取对数生长期的 A549 细胞, 胰酶消化后制成单细胞悬液, 调整细胞数为 /ml, 以 500 μl/ 孔接种于 24 孔板细胞贴壁后给予药物处理阴性对照组加入完全培养基 ; 薯蓣皂苷元组的给药浓度为 10 和 20 μmol L 1 ; TRAIL 组为 μmol L 1 ; 联合给药组为 10 及 20 μmol L 1 薯蓣皂苷元分别与 μmol L 1 TRAIL 合用药物孵育 24 h 后, 弃去上清液, 用 PBS 洗涤 2 次按照比例稀释 Hoechst 荧光染料, 与细胞孵育 4 避光 30 min, 荧光显微镜 (Olympus IX-71, 40) 下观察细胞核形态改变流式细胞仪测定细胞凋亡取对数生长期的 A549 细胞, 胰酶消化后制成单细胞悬液, 调整细胞数为 /ml, 以 500 μl/ 孔接种于 24 孔板细胞贴壁后给予药物处理阴性对照组加入完全培养基 ; 薯蓣皂苷元组的给药浓度为 10 μmol L 1 ; TRAIL 组为 μmol L 1 ; 联合给药组为 10 μmol L 1 薯蓣皂苷元与 μmol L 1 TRAIL 合用药物孵育 24 h 后, 收集细胞, 预冷 PBS 洗 2 次 r min 1 4 离心 5 min, 弃上清液, 细胞重悬于 binding buffer 400 μl 加入 AnnexinV-FITC 1 μl, 4 避光反应 20 min 后加入 PI 1 μl, 轻轻混匀后即进行流式细胞仪 (BD FACSAria Ⅲ Flow Cytometer, 美国 ) 测定 Western blotting 蛋白印迹法取对数生长期 A549 细胞, 胰酶消化后调整细胞数为 /ml, 以 1 ml/ 孔接种于 6 孔板待细胞贴壁后, 给予 10 μmol L 1 薯蓣皂苷元或 ( 和 ) μmol L 1 TRAIL 药物作用 24 h 后, 收集细胞, 用预冷的 PBS 洗涤, 蛋白裂解液 (100 mmol L 1 NaCl, 10 mmol L 1 Tris-HCl ph 7.6, 1 mmol L 1 EDTA ph 8.0, 100 mg L 1 PMSF, 1 mg L 1 抑肽酶 ) 4 裂解细胞 30 min, r min 1 4 离心 30 min, 收集上清液, 即为细胞总蛋白用 Bradford 法进行蛋白含量测定蛋白变性后, 以 60 μg 进行 SDS-PAGE 电泳 (12% 或 10% 分离胶, 5% 堆积胶 ) 电泳后将蛋白转移至硝酸纤维素膜, 5% PBST 牛血清白蛋白 (BSA) 封闭, 随后进行相关抗体孵育, 采用近红外双色激光成像系统 Odyssey (Licor Biosciences, 美国 ) 检测蛋白含量统计学分析采用 SPSS17.0 统计学软件进行处理, 实验均独立重复 3 次中效原理计算使用 Excel 软件 IC 50 计算使用 SPSS 软件作 Probit 分析运用 Microcal Origin 8.5 软件作图流式细胞仪测定结果图运用 Flowjo 软件制作利用各个蛋白密度与对照蛋白 α-tublin 密度比对后再归一化所得结果为各蛋白的相对密度结果 1 薯蓣皂苷元和 TRAIL 单用及合用对 A549 细胞增殖的抑制作用 MTT 法检测薯蓣皂苷元 ( 及 80 μmol L 1 ) 与 TRAIL ( 及 μmol L 1 ) 单用或合用对 A549 细胞增殖的影响 ( 表 1), 两种药物均表现出良好的剂量依赖

4 48 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (1): Table 1 Inhibition effects of diosgenin and TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand) on A549 cells. n = 3. ** P < 0.01 vs diosgenin group; P < 0.05, P < vs TRAIL group * P < 0.05, Diosgenin TRAIL Diosgenin + TRAIL C/μmol L 1 f a C/μmol L 1 f a C/μmol L 1 f a * ** ** 性地抑制 A549 细胞增殖的效应 ; 合用时抑制效应明显增强 2 中效原理的药物联合应用评价对结果 1 进行回归分析, 得出各实验组的线性方程式 (Y = a + bx) 和相关系数 (R), 计算两药单用及合用时的中效浓度 Dm ( 表 2) 结果表明, 薯蓣皂苷元的中效浓度为 μmol L 1, TRAIL 的中效浓度为 μmol L 1, 两药合用时的中效浓度为 μmol L 1 根据计算公式得出两药合用指数 CI 当 f a 为及 0.95 时, CI 分别为及 0.81 当 f a = 0.1, CI > 1, 即抑制率为 10% 时, 两药合用效应拮抗 ; 当 f a > 0.1, CI < 1, 即抑制率为大于 10% 时, 两药合用产生协同效应未增强薯蓣皂苷元对 293T 的细胞毒性, 合用前后薯蓣皂苷元的 IC 50 分别为和 μmol L 1, 差异无统计学意义 ( 图 3) Figure 2 Inhibition effects of diosgenin (Dio) and TRAIL on A549 cells determined by MTT assay. n = 3, x ± s. * P < 0.05, ** P < 0.01 vs Dio group Table 2 The linear equation and median effect concentration of diosgenin and TRAIL Group Linear equation R Dm/μmol L 1 Diosgenin Y = X TRAIL Y = X Diosgenin + Y = X ( TRAIL ) 3 薯蓣皂苷元联合 TRAIL 抑制 A549 细胞的增殖选取梯度浓度薯蓣皂苷元 ( 及 80 μmol L 1 ) 与 TRAIL (0.003 μmol L 1 ) 联合使用 MTT 结果显示 : TRAIL (0.003 μmol L 1 ) 对 A549 细胞的增殖抑制率的均值为 7.3% 薯蓣皂苷元对 A549 细胞的 IC 50 为 μmol L 1 薯蓣皂苷元与 TRAIL (0.003 μmol L 1 ) 合用后对 A549 细胞的抑制作用明显增强 ( 图 2), IC 50 降为 μmol L 1, 差异具有统计学意义 (P < 0.05) 该结果与中效原理判断一致, 薯蓣皂苷元与 TRAIL 合用可增强对 A549 细胞的增殖抑制作用同时, 选取人肾上皮 293T 细胞, TRAIL 对人正常细胞不敏感, 与薯蓣皂苷元合用并 Figure 3 Inhibition effects of diosgenin (Dio) and TRAIL on 293T cells. n = 3, x ± s 4 薯蓣皂苷元与 TRAIL 合用促进细胞凋亡形态学变化 Hoechst 荧光染色显示, 对照组的 A549 细胞核形态完整 μmol L 1 TRAIL 分别与薯蓣皂苷元 (10 及 20 μmol L 1 ) 合用后, 出现部分染色质浓缩细胞核固缩或崩解凋亡小体出现等典型的细胞

何焱等: 薯蓣皂苷元联合 TRAIL 对非小细胞肺癌 A549 细胞的协同作用及其中效原理评价 49 凋亡特征, 随着药物浓度增加, 凋亡现象更为显著 (图 4) 5 薯蓣皂苷元与 TRAIL 合用促进细胞凋亡比率增加经过 AnnexinV-FITC/PI 染色后, 利用流式细胞仪检测可得到早期凋亡中晚期凋亡坏死和活细胞比率左下象限代表活细胞, 右下象限代表早期凋亡细胞,

5 何焱等: 薯蓣皂苷元联合 TRAIL 对非小细胞肺癌 A549 细胞的协同作用及其中效原理评价 49 凋亡特征, 随着药物浓度增加, 凋亡现象更为显著 (图 4) 5 薯蓣皂苷元与 TRAIL 合用促进细胞凋亡比率增加经过 AnnexinV-FITC/PI 染色后, 利用流式细胞仪检测可得到早期凋亡中晚期凋亡坏死和活细胞比率左下象限代表活细胞, 右下象限代表早期凋亡细胞, 右上象限代表中晚期凋亡细胞, 左上象限代表坏死细胞 (图 5) 薯蓣皂苷元 (10 μmol L 1) 作用于 A549 细胞的凋亡诱导率为 (7.33 ± 0.33) %, TRAIL (0.003 μmol L 1 ) 的凋亡诱导率为 (19.58 ± 1.57) %, 联合用药组的凋亡诱导率则为 (24.15 ± 1.41) %, 与对照组凋亡诱导率 (7.79 ± 0.38) % 比较, 薯蓣皂苷元 Figure 6 The apoptosis ratio of A549 cell induced by diosgenin (10 μmol L 1) and TRAIL (0.003 μmol L 1). n = 3, x ± s. **P < 0.01, *** P < vs control group; P < 0.05 vs TRAIL group 组没有显著差异, TRAIL 组 (P < 0.01) 和联合给药组 (P < 0.001) 有显著差异同时, TRAIL 组与联合给药 Caspase-9 Bid Caspase-3 PARP Bcl-2 Bax 等凋组比较有显著差异 (P < 0.05), 见图 6 亡相关蛋白的表达薯蓣皂苷元单用组对蛋白表达没薯蓣皂苷元与 TRAIL 合用对凋亡相关蛋白表达有明显的影响; 但合用组与 TRAIL 单用组相比, PARP 的影响为了进一步确定联合用药对于 A549 细胞凋亡切割体明显增加, Caspase-8 Caspase-9 Caspase-3 的协同作用并探讨可能的机制选取薯蓣皂苷元 (10 表达减少, 而 Bax 表达增加 (图 7) 同时, 与凋亡密蛋白激活, 前体减少而切割体增加, Bid 和 Bcl-2 蛋白 μmol L ) 和 TRAIL (0.003 μmol L ) 单用及合用处切相关的 MAPK 信号途径中 p38 JNK 和 ERK 在理 A549 细胞 24 h 后, Western blotting 检测 Caspase-8 TRAIL 单用和与薯蓣皂苷元合用后明显激活 (图 8) Figure 4 Combination of diosgenin and TRAIL induces A549 cell morphology change (Hoechst 33342, 40). A: Control; B: Diosgenin (10 μmol L 1); C: Diosgenin (20 μmol L 1); D: TRAIL (0.003 μmol L 1); E: Diosgenin (10 μmol L 1) + TRAIL (0.003 μmol L 1); F: Diosgenin (20 μmol L 1) + TRAIL (0.003 μmol L 1) Figure 5 Combination of diosgenin and TRAIL induces A549 cell apoptosis. (0.003 μmol L 1); D: Diosgenin (10 μmol L 1) + TRAIL (0.003 μmol L 1) A: Control; B: Diosgenin (10 μmol L 1); C: TRAIL

6 50 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (1): Figure 7 Effect of combination of diosgenin (10 μmol L 1 ) and TRAIL (0.003 μmol L 1 ) on expression of apoptosis-associated proteins Figure 8 proteins Effect of combination of diosgenin (10 μmol L 1 ) and TRAIL (0.003 μmol L 1 ) on expression of MAPK signaling pathway 讨论肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 TRAIL 是一种能够诱导多种肿瘤细胞凋亡的细胞因子, 属肿瘤坏死因子 (tumor necrosis factor, TNF) 超家族成员, 具有 Ⅱ 型跨膜蛋白的结构特点 [2] TRAIL 通过与多种膜蛋白受体结合而发挥抗癌作用现有实验研究表明,

7 何焱等 : 薯蓣皂苷元联合 TRAIL 对非小细胞肺癌 A549 细胞的协同作用及其中效原理评价 51 TRAIL 可诱导多种肿瘤细胞包括肠癌乳腺癌黑色素瘤肺癌肾癌白血病和皮肤癌等发生凋亡, 但是对于正常组织并不敏感由于 TRAIL 对不同肿瘤细胞的敏感性不同, 再加上 TRAIL 在使用中容易产生耐药性, 因而增强 TRAIL 诱导不同肿瘤细胞凋亡的敏感性, 使这一安全的特异性抗肿瘤药物更好地应用于临床治疗尤为重要薯蓣皂苷元具有良好抗癌活性, 可通过干扰细胞膜装配抑制炎症反应诱导细胞凋亡阻断细胞周期等多种途径发挥抗肿瘤效果 [3] 对于死亡率在世界范围内居恶性肿瘤之首的肺癌, 进行薯蓣皂苷元与 TRAIL 的联合应用以更好地发挥两者的抗癌效果, 为肺癌提供新的临床治疗策略本研究首先采用中效原理评价薯蓣皂苷元与 TRAIL 的联合应用效应实验结果显示, 薯蓣皂苷元与 TRAIL 合用抑制 A549 细胞增殖属于协同作用同时 MTT 实验结果也进一步表明, TRAIL 能够显著降低薯蓣皂苷元对 A549 细胞的 IC 50 但对于正常细胞没有出现相似的协同抑制效应, 表明 TRAIL 和薯蓣皂苷元合用对癌细胞的选择性较好 Hoechst 染色及流式细胞术检测证实, 两药合用可协同诱导细胞凋亡为了进一步探讨薯蓣皂苷元与 TRAIL 在 A549 细胞上的合用效应及其可能的协同机制, 检测了凋亡相关蛋白的表达外源性死亡受体途径和内源性线粒体途径相关的蛋白 Caspase-8 Caspase-9 Caspase-3 前体减少, 切割体增加, 合用后效果更为明显, PARP 切割增加, Bid 表达量减少肺癌细胞中高表达的凋亡相关蛋白 Bcl-2, 合用之后表达量减少, 而 Bax 表达增加结果说明, 薯蓣皂苷元与 TRAIL 协同的增殖抑制机制与协同诱导细胞凋亡相关, 并且很可能与内源性线粒体途径和外源性死亡受体途径都有关另外, 还对与凋亡密切相关的 MAPK 信号途径也进行了研究, TRAIL 单用或两药合用均导致 MAPK 信号途径中的 p38 JNK ERK 明显激活在本研究中, 蛋白表达水平上由于薯蓣皂苷元用药浓度较低, 因此未在结果中发现薯蓣皂苷元对蛋白表达的影响已知薯蓣皂苷元可以增加 p38 的激活, 但对 ERK 和 JNK 的激活没有影响 [6] 这提示薯蓣皂苷元与 TRAIL [6, 7] 合用还与激活 MAPK 信号途径有关综合文献和实验结果, 薯蓣皂苷元与 TRAIL 合用协同诱导肿瘤细胞凋亡的机制可能与内源性线粒体途径外源性死亡受体途径以及 MAPK 信号途径均有关 ( 图 9) 本研究表明, 在体外实验中, 对于非小细胞肺癌 Figure 9 Proposed mechanism of combination of diosgenin and TRAIL A549 细胞, 薯蓣皂苷元与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 TRAIL 能够协同抑制细胞增殖, 诱导细胞凋亡, 协同机制与线粒体途径和死亡受体途径以及 MAPK 信号途径有关但对于正常细胞没有出现相似的协同抑制效应, 提示薯蓣皂苷元与 TRAIL 联合使用可能是治疗非小细胞肺癌的新策略对于动物实验以及临床试验有待于进一步的研究 References [1] Yang J, Chen SZ. Synergistic effect and its possible mechanisms of lidamycin in combination with TRAIL in NSCLC [J]. Acta Pharm Sin ( 药学学报 ), 2010, 45: [2] Chen SZ. Progress on targeting TRAIL s receptor as antitumor strategy [J]. Acta Pharm Sin ( 药学学报 ), 2009, 44: [3] Raju J, Mehta R. Cancer chemopreventive and therapeutic effects of diosgenin, a food saponin [J]. Nutr Cancer, 2009, 61: [4] Cao L, Du P, Jiang SH, et al. Enhancement of the antitumor properties of TRAIL by its targeted delivery to the tumor neovasculature [J]. Mol Cancer Ther, 2008, 7: [5] Chou TC. Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method [J]. Cancer Res, 2010, 70: [6] Lepage C, Léger DY, Bertrand J, et al. Diosgenin induces death receptor-5 through activation of p38 pathway and promotes TRAIL-induced apoptosis in colon cancer cells [J]. Cancer Lett, 2011, 301: [7] Szliszka E, Czuba ZP, Bronikowska J, et al. Ethanolic extract of propolis augments TRAIL-induced apoptotic death in prostate cancer cells [J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2011, 2011:

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马丽媛, 等. 油茶皂苷体外诱导人白血病 Jurkat 细胞凋亡及其可能机制 1073 力争将茶油作为食用油的主流品种 [5] 茶麸系油茶果实榨除茶油后的废弃残渣, 药用名为茶子饼, 1072 基础研究 Basic Research www.tumorsci.org 肿瘤 2011 年 12 月第 31 卷第 12 期 TUMOR Vol. 31, December, 2011 DOI: 10.3781/j.issn.1000-7431.2011.12. 004 Copyright 2011 by TUMOR 油茶皂苷体外诱导人白血病 Jurkat