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1 LC/MS/MS 技术基础及工作流程 安捷伦科技有限公司

2 概 要 LC/MS/MS 技术基础 LC/MS/MS 方法开发流程

3 Agilent 6000 系列液质产品家族 应用于从生命科学到化学分析的所有领域 6300 Ion Trap MS SL, XCT and XCT ultra 6100 Single Q 6200 TOF MS 6500 Q-TOF MS 6400 QQQ MS Quantitative Qualitative

4 Total Active LC-MS Installed Base by Technique QQQ and Ion Trap segments comprise nearly half of the MS market 串接四极杆和离子阱质谱占近一半 Triple Quad LC-MSMS dominated the quantitative markets 定量应用市场主要采用串接四极杆质谱 FTMS 7% TOF/ TOF 3% MALDI TOF 5% WW CY05 CY06 MS LC-Market Segmentation Services 23% ESI 2% Single Quad 6% Ion Trap 23% Source: estimates based on available CY data Triple Quad 24% QTOF 6%

5 串联四极杆液质在定量分析中的优势 高灵敏度 ( 适合复杂基体中低浓度化合物的分析 ) 高选择性 消除干扰 定量分析结果更准确 快速, 实现高通量分析 定量分析与定性确证一次完成 LC-MS LC-MS/MS

6 Agilent QQQ 系统 a 机械泵 Edwards E2M28 单个 3- 阶段 Edwards 分子泵 8 1. 毛细管 2. Skimmer 与八极杆 3. lens1 和 lens2 4. 四极杆 1(MS1) 5. RF 四极杆段 6. 碰撞池 7. 四极杆 2 (MS2) 8. 打拿极 9. 电子倍增器 6

7 四极杆工作原理 过滤高质量离子 M + * Negative Rods 特定质量离子 M + Positive Rods + 过滤低质量离子 * Positive Rods M +

8 LC/MS QQQ: 卓越的灵敏度和选择性 MRM (Multiple Reaction Monitoring) Quad Mass Filter (Q1) Quad Mass Filter (Q3) Collision Cell Spectrum with background ions (from ESI) 210 Q1 lets only target ion 210 pass through 210 Collision cell breaks ion 210 apart Q3 monitors only characteristic fragments 158 and 191 from ion 210 for quant and qual no chemical background 190

9 MS/MS 可以消除 Scan 和 SIM 的干扰 SIM 选择性与谱图分辨率相关, 对相同质荷比不具有选择性 Interference* 子离子扫描母离子选择性同左, 极大可能是干扰物和样品的碎裂后产生的子离子不重合 analyte Product 2 unit mass resolution Product 3 Product 1 interference analyte *Because the concentrate of the matrix may be much greater than the analyte, even matrix isotope ions (A+1, A+2, etc) may be a significant interference

10 名义分子量和平均分子量 对于分子 C 6 H 3 Cl 3 平均分子量为 6( ) + 3( ) + 3(35.453)= MW = ( ) + 3( ) + 3( )= 精确质量 / 单同位素质量 daltons---- 名义分子量 nominal mass

11 MH Qualitative SW 质量计算器

12 原子的精确原子量和同位素峰值 原子质量相对丰度质量相对丰度质量相对丰度分类 氢 A 碳 A+1 氮 A+1 氧 A+2 氟 A 钠 A 硅 A+2 磷 A 硫 A+2 氯 A+2 钾 A+2 溴 A+2 碘 A 12

13 同位素丰度比可以用 (a+b) n 二项式展开来表示 a 为轻同位素的丰度 b 为重同位素的丰度 n 为卤素原子的数目 例如 C6H3Cl3, 含有 3 个氯原子, 即 n=3; 35Cl 的丰度为 75.4%,37Cl 的丰度为 24.6%, 即 a:b 约为 3:1 则 (a+b)3=a3+3a2b+3ab2+b3=(3+1)3= 3*3*3+3*(3*3*1)+3*(3*1*1)+1*1*1=

14 常见的 A+2 同位素峰 A+2 ISOTOPES 98 Br Cl Si S 76.6 BrCl Br 2 65 Cl 2 Si 2 S Br Cl Br Cl Si S Br Cl Br Cl 4 Si4 S BrCl

15 同位素类型分布计算器 15

16 离子化理论 HPLC Interface (Key to Success!) MS NPT/LC/MS CAS Page Agilent Restricted January, 2007

17 离子源 电喷雾 (ESI): 电离过程是由电场产生带电液滴, 然 后通过离子蒸发生成待分析离子 雾化通常通过气动 辅助 APCI 大气压化学电离 (APCI): 气态化学电离 (CI) 过程 溶剂 或反应气在电晕针的作用下先带电, 再转移给化合物 形成离子 ESI 17

18 大气压电离 - 电喷雾电离 (API-Electrospray Ionization) 雾化器组件 (nebulizer) 是同轴套管 雾化气 电喷雾离子 V 加热的氮气干燥气 溶剂喷雾 毛细管入口 气帘

19 大气压电喷雾电离过程 带电液滴 分析离子 溶剂蒸发 Rayleigh 极限 Coulomb 爆炸 溶剂离子簇 分析离子

20 APCI 大气压化学电离 雾化气压力 蒸发室温度 雾化 蒸发液滴 气相电离 电晕电流 Vcap [Solvent + H] + + A Solvent + [A + H] + 干燥气温度和流速 Fragmentor 20

21 APCI 电离过程 含有气溶胶的分析物 溶剂 >[ 溶剂 +H] + [ 溶剂 +H] + +M > 溶剂 +[M+H] + 溶剂在蒸发器中蒸发 蒸汽 通过电晕针放电形成带电荷的反应剂离子 流动相 分析物 电荷转移至分析物分子 分析物离子 21

22 NPT/LC/MS CAS Page Agilent Restricted January, 2007

23 概 要 LC/MS/MS 技术基础 LC/MS/MS 方法开发流程 MH Quantitative 定量分析软件

24 LC/MS/MS 定量方法开发流程 1 电离模式的选择 2 MRM 参数优化使用标准品优化 fragmentor 和 collision energy 3 离子源参数的优化 4 LC 分离方法的优化

25 离子源的选择 ESI APCI ò 离子在溶液中以已生成 J 离子在气态条件中生成 ò 化合物无需具有挥发性 J 化合物需具有一定的挥发性 ò 是分析热不稳定化合物的首选 J 化合物必需是热稳定的 ò 除了生成单电荷离子之外还可 J 只生成单电荷离子 以生成多电荷离子

26 ESI 正离子 ES 模式 : 适合于碱性样品,amines, amides, aminoacids, antibiotics 等 有杂原子, 可接受质子 如 NH 2 N NH CO COOR 酸性流动相 负离子 ES 模式 : 适合于酸性样品,acids, hydroxyls, phosphates, sulfates; 含强负电性基团 有杂原子, 可失去质子 如 COOH OH 中性偏碱性流动相 可正可负 : 比较灵敏度

27 APCI 需考虑 样品 分子量和极性中等的化合物 : 脂肪酸, 邻苯二甲酸酯类. 不含酸性和碱性位点的化合物 ( 碳氢化合物 醇 醛 酮和酯 ) 含有杂原子的化合物 : 脲 氨基甲酸酯 电喷雾响应不好的样品 溶液化学参数 较 ES 对溶液化学作用不灵敏 较 ES 更耐大的流速 适用 ES 不宜的一些溶剂 应避免的样品 在气化过程中热不稳定的化合物 27

28 LC/MS/MS 定量方法开发流程 1 电离模式的选择 2 MRM 参数优化使用标准品优化 Fragmentor 和 Collision Energy 3 离子源参数的优化 4 LC 分离方法的优化 Fragmentor Collision Energy Octopole 1 Quad Mass Filter (Q1) Quad Mass Filter (Q3) Lens 1 and 2 Collision Cell 10KV Dynode Detector Rough Pump Turbo 1 Turbo 1 Turbo 1

29 2 MRM 参数优化 全扫描 scan 或 SIM, 优化毛细管出口电压 (fragmentor), 保证母离子的传输效率 子离子扫描 Product ion scan 使用已优化好的 fragmentor, 选择定性定量离子, 优化碰撞能量 (collision energy), 得到 / 优化 子离子的响应 多反应监测 MRM 定量, 使用已优化好的 fragmentor 和 collision energy, 优化 Dwell time

30 MS2 Scan 优化 Fragmentor 100V 80V 120V 140V 选择最高响应对应的碎裂电压值

31 Product ion Scan 选择子离子并优化 Collision Energy 选择最高响应对应的碰撞能量值 每个化合物一般选择两个强度最高的子离子, 分别作定性离子与定量离子 EU Criteria 1. The IP of parent ion is 1.0 point. 2. The IP of two product ions are 3.0 point.

32 MRM Dwell time( 驻留时间 ) 优化 影响灵敏度 重现性 决定色谱峰的数据点数

33 MRM Dwell time 优化 设置 Time segment 定量离子分配更长的 Dwell time

34 LC/MS/MS 定量方法开发流程 1 电离模式的选择 2 MRM 参数优化使用标准品优化 fragmentor 和 collision energy 3 离子源参数的优化 4 LC 分离方法的优化

35 3 离子源参数的优化 - 电喷雾喷雾室参数设置 ESI Source 雾化气压力和干燥气流速参数设置 ( 建议 HPLC 流速 <500 L/min) Flow Rate Gas Flow Nebulizer 0.2mL/min, 7-9 L/min psi 0.3mL/min ~ 0.4mL/min, 9-11 L/min psi 0.5mL/min, L/min psi 含水高需更高的流速 如果太低 : 液滴会导致谱图中的尖峰 ;MRM 背景变高 干燥气温度 C ESI 源参数与液相流速和流动相水相的比例相关 Positive Negative Capillary Nozzle Voltage

36 MS QQQ- 离子源参数 HPLC 流速 >500 L/min APCI Source 雾化气压力 60 psig 干燥气温度 start with 350 C 干燥气流速 4 L/min 气化温度一般 350 C 毛细管电压需调节 ( V) 开始 3500 V 电晕电流开始 20 µa (neg) 或 4 µa (pos)

37 LC/MS/MS 定量方法开发流程 1 电离模式的选择 2 MRM 参数优化使用标准品优化 Fragmentor 和 Collision energy 3 离子源参数的优化 4 LC 分离方法的优化

38 LC 分离方法的建立 ESI APCI ò 色谱柱内径建议用 2.1mm 或 ò 色谱柱内径 4.6, 3.0, 2.1 mm 3.0mm ò 建议用 4.6mm ò ò 建议用 1.8µm 或 3.5µm( 小颗粒填料的柱子具有增加分辨率和灵敏度的优点 ) 反相流动相 ò ò 反相和正相流动相 建议高 LC 流速 ò 建议低 LC 流速

39 API-MS 常用添加剂 降低 ph 值 : 乙酸 (ph3-4), 甲酸 (ph2-3), 甲酸铵 (ph5-6), 乙酸铵 (ph6-7) 升高 ph 值 : 氢氧化铵 (ph ) 不能使用在 HPLC 中常使用的磷酸盐, 硫酸盐或硼酸盐 ( 严重干扰离子化过程并使质谱污染 )! 将现有的 LC 方法改编为 LC/API-MS 方法 非挥发性的酸 / 碱 / 缓冲盐改为挥发性的酸 / 碱 / 缓冲盐 浓度 <10 mm ( 对于 ES ) 或 <100 mm ( 对于 APCI)

40 流动相的考虑 金属离子缓冲盐影响离子化表面活性剂影响去溶剂化过程离子对试剂可以离子化, 而导致高背景噪音强离子对试剂可与待测物反应, 导致待测物不能离子化某些流动相添加剂可造成持续的高背景噪音 TEA 干扰正离子模式 (m/z102) TFA 扰负离子模式 (m/z113) 增塑剂 ( 邻苯二甲酸酯 ) 背景干扰,(m/z149,315, 391)

41 如何判断 LCMS 系统 通常在 Scan 模式下 : Positive Mode 50000; Nagative Mode 10000

42 色谱柱 ZORBAX 主要反相键合相 系列 StableBond Eclipse Plus Eclipse XDB Extend Bonus-RP 键合相 C18, C8, C3,Phenyl,CN, AQ C18, C8, PAH, phenyl-hexyl C18, C8, Phenyl, CN 粒径 1.8,3.5,5,7um 1.8,3.5,5um 1.8,3.5,5,7um 1.8,3.5,5um 3.5,5,7um 内径毛细管柱, 1.0,2.1,3.0,4.6, 9.4, 21.2mm 柱长 20,30,50,75,10 0,150,250mm 耐受 ph 范围 特点 2.1,3.0,4.6mm 1.0,2.1,3.0,4.6, 30,50,75,100,1 50,250mm 9.4,21.2mm 20,30,50,75,10 0,150,250mm C18 毛细管柱, 1.0,2.1,3.0,4. 6, 21.2mm 30,50,100,15 0, 250mm C18 1~8 2~9 2~9 2~11.5 2~9 低 ph 流动相极其优异的稳定性 ; 丰富的键合相选择 方法开发首选柱, 方法开发首选柱, 高 ph 流动相 对于碱性化合物峰形优异 对于碱性化合物峰形优异 优异的稳定性 1.0,2.1,3.0, 4.6,21.2mm 30,50,75,100,150,250mm 独特的选择性 ; 高水相分离碱性化合物 Agilent LC colmns 43

43 液相柱 ---ph 选择策略 Extend C18 ph 2~11.5 Bonus-RP ph 2~9 Eclipse PLUS/ XDB C18 ph 2~9 StableBond C18 ph 1~8 对于一个已知方法, 选择色谱柱的首要思路应先从色谱条件尤其是流动相的 ph 值入手, 考虑色谱柱所能耐受的流动相范围及柱温, 这是保证方法稳定的基础和关键

44 Zorbax 反相色谱柱选择的建议 General guidance on choosing a column based on sample type 较强极性 极性 中等极性 弱极性 SB-Aq Bonus-RP SB-C8 Eclipse XDB-Phenyl Eclipse Plus/XDB-C8/C18 Eclipse XDB-CN Eclipse XDB-Phenyl SB-C3 Eclipse Plus/ XDB-C18 Eclipse Plus/ XDB-C8 Eclipse XDB-CN Eclipse XDB-Phenyl SB - all Eclipse Plus XDB-C8 Eclipse Plus/ XDB-C18 Eclipse XDB-CN SB-C8 SB-C18 Other columns will work in some cases and could provide a better separation, depending on the actual analytes and excipients present in the sample. 结论 : 色谱柱的键合相选择, 主要从色谱柱的耐受性出发 而对于化合物选择性, 流动相和色谱柱键合相不同, 都会产生差异 Group/Presentation Title Agilent Restricted

45 选择 Eclipse Plus C18 低 ph 调节 %ACN for 0.5 <k < 20 方法开发的起始步骤 STEP 1 选择一根性能优越的 C18 或 C8 键合相作为方法开发的起始, 这个键合相应对酸性 碱性及中性化合物都可以提供好的峰形和保留 峰间隔问题 改变有机相比例 STEP 2 优化流动相中有机相的组成以改变其选择性 峰间隔问题 改变有机相 调速有机相比例以使 0.5 < k <20 峰间隔问题 改变键合相 Eclipse Plus C8, SB-C18, CN, Phenyl, 其它的反相键合相 STEP 3 STEP 4 方法开发通常从 ph3.0 开始尝试 如果样品中的某些化合物酸性较强, 需要将流动相的 ph 调节在 1-2 时, 请选择 SB-C18 色谱是经验科学, 选择性的优化, 只能通过不同的键合相来尝试实现 Group/Presentation Title Agilent Restricted

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untitled Agilent ZORBAX Agilent ZORBAX HPLC... phzorbax 3 1. 6-9 2. www.agilent.com/chem/lccolumntips 3. 800-820-3278 ...2 ZORBAX...5........................................................................ 6 ZORBAX..................................................................

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