前言 1290 Infinity ELSD 是对没有发色团的分析物进行分析的理想检测器 ESLD 检测基于分析物的通性, 所使用的蓝色激光光源可以在宽浓度范围内获得高灵敏度的结果 1290 Infinity ELSD 可以高速输出数据, 从而可以与 1290 Infinity LC 联用 1290

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谚洁盛
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Agilent 1290 Infinity 蒸发光散射检测器的性能特点技术概述 mv 400 作者 Bettina Schuhn 安捷伦科技有限公司德国瓦尔德布隆 350 300 250 200 150 100 50 0 0 0.5 (min) 1.

1 Agilent 1290 Infinity 蒸发光散射检测器的性能特点技术概述 mv 400 作者 Bettina Schuhn 安捷伦科技有限公司德国瓦尔德布隆 (min) 1.0 摘要 Agilent 1290 Infinity 蒸发光散射检测器 (ELSD) 对于多种化合物可以实现宽检测范围, 同时具有优异的低至纳克水平的检测灵敏度更高的效能和更好的重现性它非常适合分析半挥发和不挥发性化合物, 以及没有 UV 发色团的化合物, 例如多数氨基酸和糖类 1290 Infinity ELSD 不依赖于化合物的光学特性, 无需衍生和繁冗的样品制备即可对化合物进行检测本技术概述阐明与 Agilent 1290 Infinity LC 系统联用的 1290 Infinity ELSD 可改善检测灵敏度和性能 1290 Infinity ELSD 显然比其它任何 ELSD 都具有更高的检测灵敏度, 即使在低浓度下也能给出满意的数据

前言 1290 Infinity ELSD 是对没有发色团的分析物进行分析的理想检测器 ESLD 检测基于分析物的通性, 所使用的蓝色激光光源可以在宽浓度范围内获得高灵敏度的结果 1290 Infinity ELSD 可以高速输出数据, 从而可以与 1290 Infinity LC 联用 1290 Infinity ELSD 非常适合快速液相色谱分析应用与 Agilent 385 ESLD

2 前言 1290 Infinity ELSD 是对没有发色团的分析物进行分析的理想检测器 ESLD 检测基于分析物的通性, 所使用的蓝色激光光源可以在宽浓度范围内获得高灵敏度的结果 1290 Infinity ELSD 可以高速输出数据, 从而可以与 1290 Infinity LC 联用 1290 Infinity ELSD 非常适合快速液相色谱分析应用与 Agilent 385 ESLD 相比, 本技术概述展示出 1290 Infinity ELSD 具有明显更低的检测限更高的激光强度辅以高增益光电倍增管和数字信号处理技术, 提高了其信号强度并降低了噪音本技术概述展示了该检测器具有极好的数据重现性, 并且结果更加可靠和准确, 一致性更高在不衍生的条件下, 我们分离检测了咖啡因和三种氨基酸采用蒸发光散射检测器进行检测, 同时串联 UV/DAD 检测 1290 Infinity ELSD 可以单独使用, 或者在 HPLC 系统中与其它类型的检测器串联使用如果连同其它检测器一起使用, 必须将 1290 Infinity ELSD 串联到末尾位置, 因为在分析过程中会将溶剂和洗脱液蒸干操作原理 1290 Infinity ELSD 是一款高灵敏度检测器, 可对液流中半挥发和不挥发性化合物进行检测含有溶质的溶剂流首先被雾化 (1), 并被气流携带通过蒸发室 (2) 溶 1. 图 1 ELSD 工作原理图剂挥发掉, 留下溶质颗粒形成的薄雾, 它可将光散射至光敏器件 (3) 信号被放大后, 一定的电压输出可以使我们了解通过光检测池的溶质颗粒的浓度 ( 图 1)

3 Agilent 1290 Infinity ELSD 设计更完善雾化 : 使用低气体流速实现高效雾化是安捷伦 ELSD 的特点之一独立的雾化器温度和气流控制提供了极佳的稳定性和重现性通过排液端口排出雾化不佳的洗脱液, 最大限度地降低了基线噪音蒸发 : 雾流通过一个独立温控的蒸发管, 此时溶剂在高温下被去除, 留下挥发性较低的颗粒 1290 Infinity ELSD 配有专利气流控制技术, 可以使用短蒸发管因此吹扫体积极低, 使峰扩散程度降至最低, 同时使分离度最大化 ( 这对使用短色谱柱的分析工作尤其重要 ) 光学检测 : 当溶质颗粒通过光检测池时即进行检测 1290 Infinity ELSD 配有蓝色激光光源高增益光电倍增管, 以及可以增强信号并大大减小基线噪音的数字信号处理技术, 从而提高了检测灵敏度检测限可以提高一个数量级实验条件溶剂乙腈为 LC 级, 购自 Sigma Aldrich 公司 ( 圣路易斯, 密苏里州, 美国 ) 新鲜的超纯水来自配有 LC-Pak Polisher 的 Milli-Q Integral 系统样品缬氨酸亮氨酸和苯丙氨酸购自 Sigma Aldrich 公司 ( 圣路易斯, 密苏里州, 美国 ), 纯度 >98% 咖啡因来自安捷伦科技公司( 圣克拉拉, 美国 ), 纯度 >99%( 部件号 ) 软件 Agilent OpenLAB CDS ChemStation(A 版 ) 部件号说明 G4261B Agilent 1290 Infinity 蒸发光散射检测器 ( 带制冷功能 ) G4212A Agilent 1290 Infinity 二极管阵列检测器 (10 mm 光程流通池 ) G1316C Agilent 1290 Infinity 柱温箱 G4226A Agilent 1290 Infinity 自动进样器 G4220A Agilent 1290 Infinity 二元泵表 1 系统模块 3

4 1290 Infinity ELSD 性能基线 ASTM 噪音和漂移使用限流毛细管 ( 部件号 ) 并以水作为流动相测定 ASTM 噪音和漂移在 40 Hz 的数据输出速率和响应时间 ( 平滑 =SMTH) 为 20 (2 s) 的条件下采集噪音电平平滑指可以平均输出数据, 以获得更平滑的响应对 30 分钟测量过程进行采集以确定 1290 Infinity ELSD 的噪音和漂移 7 次重复测定的 ASTM 噪音平均值为 0.05 mv, 漂移为 0.04 mv/h 图 2 中所示为 30 min 过程中噪音和漂移的示例色谱图通过排液端口排出雾化不佳的洗脱液, 最大限度地降低了基线噪音, 从而使基线更加平稳 mv 图 2 采用 100% 水获得的 30 min 色谱图 (n=7), 其中 ASTM 噪音为 0.05 mv, 漂移为 0.04 mv/h 色谱条件色谱柱 : 可承受 110 bar 反压的限流毛细管 ( 部件号 ) min 流动相 : 流速 : 停止时间 : ELSD: A = 水 1 ml/min 30 min 蒸发 40 C/ 雾化 40 C/ 气流 1.2 SLM/ 平滑 20 (2 s)/pmt 增益 1/40 Hz 4

5 线性和动态范围采用包含等摩尔缬氨酸 (Val) 亮氨酸 (Leu) 和苯丙氨酸 (Phe) 的测试混合物进行线性测定这些氨基酸是非挥发性的, 非常适合由 ELSD 进行检测, 也适合由安装在 ELSD 前面的 DAD 进行检测混合液的浓度范围为 0.05 mm 20 mm, 共 10 个浓度水平采用反相 UHPLC 梯度洗脱, 这些氨基酸在大约 3 min 内实现分离图 3 表明 1290 Infinity ELSD 在 0.05 mm 20 mm 的浓度范围内具有良好的线性所有化合物的相关系数均大于结果表明, 所有化合物在 ng 柱上量范围内, 线性关系良好缬氨酸亮氨酸和苯丙氨酸的相关系数范围为 ( 表 2) 在当前色谱条件下, 氨基酸柱上量的最低响应值分别为缬氨酸 5.85 ng 亮氨酸 6.55 ng 和苯丙氨酸 8.25 ng 最高响应值分别为缬氨酸 2340 ng 亮氨酸 2620 ng 和苯丙氨酸 3300 ng 结果表明总体动态范围高达三个数量级, 而此时 PMT 的增益设置仅为 1 在测量线性时, 采用了相同的等摩尔浓度化合物混合液, 而氨基酸间的响应不同, 这说明 1290 Infinity ELSD 可以针对每种化合物提供通用响应图 3 log _ R 2 = _ log ng 对于所有三种氨基酸,Agilent 1290 Infinity ELSD 的动态范围均涵盖了 mm 的浓度范围色谱条件色谱柱 : 流动相 : 流速 : 梯度程序 : Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 RR HD, mm,1.8 µm 粒径 ( 部件号 ) A:2% 乙腈水溶液 B: 乙腈 0.6 ml/min 0 min 5 % B min 30% B min 100% B 3 min 后运行时间 : 柱温 : 25 C 进样体积 : 1 µl DAD: 210/4 nm, 参比关闭 ELSD: 蒸发 50 C/ 雾化 50 C/ 气流 1.0 SLM/ 平滑 1 (0.1 s)/pmt 增益 1/40 Hz 化合物 R 2 缬氨酸亮氨酸苯丙氨酸表 2 氨基酸的相关系数 5

6 缬氨酸亮氨酸和苯丙氨酸的检测灵敏度使用浓度为 0.1 mm 的 Val Leu 和 Phe, 通过检测限 (LOD;S/N=3) 和定量限 (LOQ;S/N=10) 确定 1290 Infinity ELSD 的检测灵敏度采用 7 次重复测定的平均值来计算 LOD 和 LOQ 图 3 中所示为色谱条件表 3 列出了 Val Leu 和 Phe 的 LOD LOQ 和信噪比 (S/N) 值图 4 中所示为这几种氨基酸在 100 µm 等摩尔浓度及不同增益设置条件下的色谱图显示能以高灵敏度检测所有化合物在样品浓度较低的条件下, 可调整检测器增益 (PMT) 设置以增强信号增益设置为检测器输出信号放大的倍数在设置增益后, 信号和噪音均会根据设置值放大, 所以 S/N 值基本不受影响参数屏幕上显示的原始信号输出反映了这种信号放大处理中的强度增减增益可在 1-10 的范围内调整表 4 列出了三种不同的增益设置, 以及其对低浓度样品 (100 µm) LOD (S/N=3) 的影响尤其对于低浓度样品, 假如需要手动积分, 提高增益设置很有用不同增益设置条件下的 LOD 变化更多是受数据采集影响而非 ELSD 影响一般来讲, 雾滴的大小决定了 ELSD 的检测灵敏度雾滴越大, 在光检测阶段的最终颗粒也就越大, 散射作用就会越强为获得理想的雾滴大小, 用户可以对雾化气和温度加以控制化合物 LOD (ng/µl) (S/N=3) LOQ (ng/µl) (S/N=10) 缬氨酸亮氨酸苯丙氨酸表 3 缬氨酸亮氨酸和苯丙氨酸的 LOD LOQ 和 S/N 值 (100 µm;n=7), 增益设置为 1 mv PMT 5 PMT 10 PMT min 图 mm 的缬氨酸 (RT 0.290) 亮氨酸 (RT 0.418) 和苯丙氨酸 (RT 0.731) 在增益设置分别为 1( 蓝色 ) 5( 红色 ) 和 10( 绿色 ) 时的色谱图更高的增益设置仅使化合物变得更易于观察 LOD (ng/µl) 化合物增益 1 增益 5 增益 10 缬氨酸亮氨酸苯丙氨酸表 4 更高的增益设置几乎不会使 LOD 发生变化亮氨酸 1 PMT 5 PMT 10 PMT 峰面积高度 S/N 表 5 不同的 PMT 增益设置只是改变了色谱图中色谱峰的外观图 5 中所示为亮氨酸的示例 6

7 DAD 与 ELSD 的比较检测无 UV 发色团的化合物 ELSD 尤其适合分析 DAD 无法检测的无发色团化合物即使在中等浓度 (1 mm) 条件下, 与 ELSD 相比,DAD 也几乎检测不到缬氨酸和亮氨酸 ( 图 5) 为了测量 DAD 信号和 ELSD 信号间灵敏度的差异, 我们将 DAD 和 ELSD 在线串联到一起 mau A) L- L- L min mv B) min 图 5 A) 缬氨酸亮氨酸和苯丙氨酸的紫外色谱图采用紫外检测时, 前两种化合物几乎无法检出 B) 相同化合物的 ELSD 色谱图 7

8 咖啡因的检测灵敏度对咖啡因这种半挥发性化合物的检测灵敏度良好咖啡因的柱上进样量为 40 ng 如图 6 中所示, 咖啡因柱上进样量为 40 ng 时的信噪比为 29.2, 说明 1290 Infinity ELSD 具有良好的检测灵敏度咖啡因的 LOD 为柱上量 4.1 ng 总之, 对于氨基酸和咖啡因这两类不同的化学物质, 它们都具有极高的检测灵敏度所有化合物的 LOD 均在 10 ng 柱上量以下, 所有测试的化合物均具有很高的信噪比带制冷功能的 1290 Infinity ELSD 还是检测半挥发性化合物的理想选择 mv min 图 6 咖啡因的柱上进样量为 40 ng 时的色谱图, 信噪比为 29.2 色谱条件色谱柱 : Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18, mm,5 µm 粒径 ( 部件号 ) 流动相 : A:80/20( 水 / 乙腈 ) 流速 : 1 ml/min 梯度程序 : 等度 5 min 柱温 : 25 C 进样体积 : 10 µl 浓度为 21 µm 的咖啡因标准溶液 ( 部件号 ) DAD: 273/4 nm, 参比关闭 ELSD: 蒸发 40 C/ 雾化 40 C/ 气流 1.2 SLM/ 平滑 20 (2 s)/pmt 增益 5/40 Hz 8

9 咖啡因的峰面积和保留时间精度在咖啡因柱上进样量为 250 ng 时检测其保留时间和峰面积精度取 7 次重复测定的平均值, 其保留时间的相对标准偏差 (RSD) 为 0.22%, 峰面积精度为 1.10% RSD 图 7 显示了峰面积和保留时间的卓越精度 mv min 图 7 10 µl 咖啡因标准溶液 7 次重复测定的重叠色谱图色谱条件色谱柱 : Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18, mm,5 µm 粒径 ( 部件号 ) 流动相 : A:80/20( 水 / 乙腈 ) 流速 : 1 ml/min 梯度程序 : 等度 5 min 柱温 : 25 C 进样体积 : 10 µl 浓度为 25 µm 的咖啡因标准溶液 ( 部件号 ) DAD: 273/4 nm, 参比关闭 ELSD: 蒸发 40 C/ 雾化 40 C/ 气流 1.2 SLM/ 平滑 20 (2 s)/pmt 增益 5/40 Hz 9

10 结论本技术概述论证了与 Agilent 1290 Infinity LC 系统联用的 1290 Infinity ELSD 具有极高的检测灵敏度可以获得高质量的数据, ASTM 噪音为 0.05 mv, 漂移为 0.04 mv/h 可以得到优异的 S/N 值, 例如, 咖啡因柱上进样量为 40 ng 时, 信噪比为 29.2 所有测试化合物的 LOD 均低于 10 ng 柱上量采用 1290 Infinity ELSD 时, 大多数测试化合物的典型 LOD 为 1-25 ng 柱上量 1290 Infinity ELSD 使用蓝色 (405 nm) 激光代替了 LED, 使小颗粒的散射强度最大化, 并且采用数字信号处理技术使基线噪音降至最低, 从而获得了极高的检测灵敏度对于所分析的氨基酸, 动态范围约为 3 个数量级, 并且一般来说, 对于大多数化合物动态范围都在 2-3 个数量级之间可以获得理想的保留时间和峰面积精度 RSD 值保留时间精度通常为 0.22% RSD, 峰面积精度通常为 1.10% RSD 1290 Infinity ELSD 采用激光技术, 具有更高的检测灵敏度分析效能和重现性在制药药物筛选食品质量检验和化学分析应用中,1290 Infinity ELSD 是检测半挥发性和不挥发性溶质的理想选择此外, 低扩散和高数据输出速率 (80 Hz) 使它非常适合快速液相色谱应用, 尤其是采用短色谱柱的应用 10

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12 安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司, 年 4 月 1 日, 中国出版 CHCN

Agilent 1260 Infinity 蒸发光散射检测器 (ELSD) 产品说明前言由于不依赖化合物的光学特性, 蒸发光散射检测器 (ELSD) 非常适合检测没有 UV 发色团的分析物 Agilent 1260 Infinity ELSD 是一款高性能的 ELSD, 得益于安捷伦近 20 年

Agilent 1260 Infinity 蒸发光散射检测器 (ELSD) 产品说明前言由于不依赖化合物的光学特性, 蒸发光散射检测器 (ELSD) 非常适合检测没有 UV 发色团的分析物 Agilent 1260 Infinity ELSD 是一款高性能的 ELSD, 得益于安捷伦近 20 年 Agilent 16 Infinity 蒸发光散射检测器 (ELSD) 产品说明前言由于不依赖化合物的光学特性, 蒸发光散射检测器 (ELSD) 非常适合检测没有 UV 发色团的分析物 Agilent 16 Infinity ELSD 是一款高性能的 ELSD, 得益于安捷伦近年的 ELSD 设计制造经验 16 Infinity ELSD 是目前市面上最小巧最灵活的一款 ELSD 专利型气流技术使