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禄诗贾
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1 将传统方法转移成使用安捷伦 Poroshell 色谱柱的快速方法进行人参分析应用报告医药作者 Rongjie Fu 安捷伦科技 ( 上海 ) 有限公司中国上海浦东英伦路 4 号邮编摘要本文实验将使用 mm,5 µm 色谱柱进行人参分析的传统方法转移到了 Agilent Poroshell EC-C8,. mm mm,.7 µm 色谱柱上在线速度相同的情况下, 所需梯度时间从多分钟降至大约 7 分钟, 如果提高流速, 还可以将分析时间进一步降至 5 分钟以下在本示例中, 高流速条件下压力超过会 bar, 因此需要使用 bar 的仪器如果采用 Agilent Poroshell EC-C8 或 Poroshell SB-C8. mm 5 mm 色谱柱, 梯度时间还可进一步缩短最短的时间为分钟, 对关键化合物 ( 人参皂苷 Rg 和 Re) 的分离度为.57 另外, 由于色谱柱使用 µm 滤头, 因此, 在样品制备过程中新方法无需要更改压力仍低于 bar, 因此该方法可以在任何 HPLC 仪器上运行

2 前言亚洲人参原产于中国和韩国, 数个世纪以来应用于医学的不同系统中关于人参的治疗报道不计其数, 这种药材用于保健和增强免疫系统人参的传统方法和现代应用包括 : 增强大病初愈者的健康, 增加健康以及耐力, 改善精神和身体机能, 治疗勃起障碍, 丙型肝炎, 以及妇女绝经综合症 ; 降低血糖, 并且控制血压亚洲人参的根含有的活性化学物质名为人参皂苷, 是人参药用价值的所在 [] 在中国药典中, 采用高效液相色谱方法测定人参中三种主要人参皂苷 Rg,Re 和 Rb 的含量 [] 最初的方法使用传统的 4.6 mm 5 mm,5 µm 色谱柱, 使用长达分钟的梯度洗脱因此, 有必要建立一种快速的分析方法以增加分析通量并降低实验成本在本研究中, 将传统方法转移到安捷伦 Poroshell EC-C8 和 Poroshell SB-C8 色谱柱上安捷伦 Poroshell.7 µm 色谱柱使用表面多孔材料填装, 使其能实现快速分离, 且性能类似于亚 µm 全多孔材料这种方法根据色谱柱的长度内径以及样品大小进行比例转换在较短的色谱柱上, 仍然能保持原来的线速度实验部分系列 SL 型液相色谱系统包括 : 二元泵, 柱温箱 (TCC), 高性能自动进样器以及二级管阵列检测器 (DAD) 本文所用色谱柱包括 : 安捷伦 ZORBAX StableBond C8,4.6 mm 5 mm,5 µm 色谱柱 ( 部件号 : ) 安捷伦 ZORBAX Eclipse Plus C8,4.6 mm 5 mm,5 µm 色谱柱 ( 部件号 : ) 安捷伦 Poroshell EC-C8,. mm mm,.7 µm 色谱柱 ( 部件号 : ) 安捷伦 Poroshell EC-C8,. mm 5 mm,.7 µm 色谱柱 ( 部件号 : ) 安捷伦 Poroshell SB-C8,. mm 5 mm,.7 µm 色谱柱 ( 部件号 : ) 人参样品采用下列样品制备步骤 :. 称量. g 干粉. 用 5 ml 乙酸乙酯在索氏提取器中脱脂小时. 冷却, 过滤, 弃掉液相, 之后, 将残留物干燥 4. 用滤纸将残留物移入 5 ml 烧瓶加入 ml 水饱和的正丁醇, 超声萃取分钟 5. 过滤萃取液, 收集 ml 正丁醇液 6. 水浴蒸发正丁醇, 残留物加入 ml 甲醇溶解 7. 用.45 µm 再生纤维素滤膜 ( 部件号 :564-8) 过滤, 之后进行高效液相色谱分析结果和讨论将分离人参皂苷 Rg,Re 和 Rb 的传统方法在 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C8,4.6 mm 5 mm,5 µm 色谱柱和 Agilent ZORBAX SB-C8,4.6 mm 5 mm,5 µm 色谱柱上进行重复人参皂苷 Rg 在这两根色谱柱上的理论塔板数都大于 9, 分离度在. 左右, 足够分离三种人参皂苷了单次运行时间超过分钟, 见图所示

3 ml/ nm 5 µl C Agilent ZORBAX Eclipse Plus C8 4.6 mm 5 mm 5 µm Rs, =.97 = 9549 Rg Re Rb ml/ nm 5 µl C ZORBAX SB-C8 4.6 mm 5 mm 5 µm Rs, =. = 99 Rg Re Rb 图. 在安捷伦 ZORBAX Eclipse Plus C8,4.6 mm 5 mm,5 µm 色谱柱和安捷伦 ZORBAX SB-C8, 4.6 mm 5 mm,5 µm 色谱柱上运行人参的传统分析方法随后, 将传统方法转移到安捷伦 Poroshell EC-C8,. mm mm,.7 µm 色谱柱上根据下面的方程调整流速以保持相同的线速度方程 : F /(r ) = F /(r ) 其中 F 是传统色谱柱的流速 F 是新色谱柱的流速 r 是传统色谱柱的半径 r 是新色谱柱的半径如需保持分离度不变, 梯度洗脱时间与色谱柱长度需成比例变化对比传统的 4.6 mm 5 mm 色谱柱, 在相同的线速度下使用. mm mm 色谱柱, 梯度洗脱时间将会比原来减少三分之一进样体积适当减少避免样品量过载所以分析时间由原来的分钟减少到 66.7 分钟, 如图所示 74 bar 的反压对于一台 bar 的高效液相色谱仪来说是可以接受的该色谱图中显示的分离度和理论塔板数比传统方法更高

4 ml/ nm µl C Agilent Poroshell EC-C8. mm mm.7 µm 74 bar Rs, =.89 = 75 Rg Re Rb 5 图. 采用安捷伦 Poroshell EC-C8,. mm mm,.7 µm 色谱柱在常规流速下的色谱图新方法比传统方法节省了三分之一的分析时间, 且性能有了大幅改进通过增加流速并减少梯度洗脱时间可以进一步缩短分析时间使用同一根色谱柱时, 梯度洗脱时间是和流速是成正比的因此, 当新方法中使用的流速是原来的二倍时 ( 从.45 ml/ 增加到.85 ml/), 分析时间就会减少一半流速是原来的三倍时 ( 图 ) 分析周期将会进一步缩短, 但是分离度和理论塔板数会有所损失, 但即使是这样分离度和理论塔板数仍然比传统色谱柱要好这可能是由于装填表面多孔.7 µm 填料颗粒 Poroshell 色谱柱的范德华曲线类似于装填.8 µm 颗粒色谱柱的原因不同于装填.8 µm 填料粒径的色谱柱,Poroshell 色谱柱的柱效在高流速下并不会降低流速是原来流速倍的时候, 压力也是原来压力 74 bar 的大概倍, 就是大约 485 bar 这个压力对于耐受 bar 压力的色谱柱是可以接受的, 但是这就需要耐压至少 bar 的高效液相色谱仪或超高液相色谱仪了, 比如安捷伦 Infinity 液相色谱系统 ml/ nm µl C Agilent Poroshell EC-C8. mm mm.7 µm 4 bar Rs, =. = 56 Rg Re Rb 图. 采用 Agilent Poroshell EC-C8,. mm mm,.7 µm 色谱柱在较高流速下的色谱图 ( 接转下页 ) 4

5 ml/ nm µl C Agilent Poroshell EC-C8. mm mm.7 µm 485 bar Rs, =. = 47 Rg Re Rb 图. 采用 Agilent Poroshell EC-C8,. mm mm,.7 µm 色谱柱在更高流速下分析的色谱图从不同的流速下的重叠色谱图 ( 图 4) 中可以看出, 采用 Agilent Poroshell EC-C8,. x mm,.7 µm 色谱柱可以大大节省分析时间 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C8 4.6 mm 5 mm 5 µm Agilent Poroshell EC-C8. mm mm.7 µm 7 Agilent Poroshell EC-C8. mm mm.7 µm Agilent Poroshell EC-C8. mm mm.7 µm 图 4. 采用 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C8,4.6 mm x 5 mm,5 µm 色谱柱和 Agielnt Poroshell EC-C8,. mm mm,.7 µm 色谱柱在不同流速下的重叠色谱图 5

6 基于 Agilent Poroshell,. mm mm 色谱柱开发的新方法比原方法节约了四分之三 (75%) 的分析时间, 如果采用较短的色谱柱分离时间会进一步缩短随后, 将这个方法转移到安捷伦 Poroshell,. mm 5 mm 色谱柱上分离需要分钟, 人参皂苷 Rs 与人参皂苷 Rg,Re 的分离度接近. 当流速加倍, 完成分离仅需分钟 ( 是原来时间的十分之一 ), 虽然分离度和性能会有所降低但还是都还可以用于定量分析的重要的是, 此时压力只有大约 bar, 这远远低于 bar 仪器的压力上限理论上来说, 可以使用 bar 仪器运行这一快速分离方法, 但是, 由于延迟体积和柱后体积, 应该优化仪器, 调整高效液相色谱条件, 以获得最理想的分离效果 bar ml/ nm µl C Poroshell EC-C8 Rs, =.94. mm 5 mm.7 µm = 9 Rg Re Rb Rs, =.59 = bar ml/ nm µl C Agilent Poroshell EC-C8. mm 5 mm.7 µm Rs, =.57 = 6664 bar ml/ nm µl C Agilent Poroshell SB-C8. mm 5 mm.7 µm 图 5. 采用 Agilent Poroshell EC-C8,. mm 5 mm,.7 µm 色谱柱和 Agilent Poroshell SB-C8,. mm 5 mm,.7 µm 色谱柱分析人参的色谱图 6

7 结论将人参中人参皂苷的分析方法成功的从传统的 mm, 5 µm 色谱柱转移到 Poroshell 色谱柱上, 大大节省了分析时间, 同时也没有损失分离度根据所需要的分析时间以及可用的高效液相色谱仪器选择最好的分析方法相比于全多孔的亚 µm 填料填充的色谱柱, 表面多孔的.7 µm 颗粒填充的色谱柱显示出相似的性能, 但是压力较低由于压力较低, 该方法可以在 bar 的仪器上运行较高的流速在超高液相色谱仪上可以实现较快的分离, 压力最高可达色谱柱的压力上限 bar 参考文献. Ginseng, China Pharmacopoeia, edition 更多信息如需了解关于我们产品的服务的更多信息, 请访问我们的网站 7

8 安捷伦科技公司对本资料中包含的错误, 或由于提供展示或使用本材料造成的直接或间接损失概不负责本出版物中的信息说明和性能指标如有变更, 恕不另行通知安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司, 年月 9 日中国出版 CHCN

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5990-9029CHCN_5989_5672.qxd 将中国药典测定胰岛素的方法转换为使用 Agilent Poroshell 色谱柱的方法应用报告生物制药作者 Rongjie Fu 安捷伦科技有限公司 ( 上海 ) 英伦路 4 号上海 3 中国摘要中国药典 (Ch. P) 规定的检验胰岛素的方法需使用传统的 4.6