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1 RRHT LC/MS/MS 分析人发中的苯二氮艹卓类成分应用法医学作者 Christine Moore, Cynthia Coulter, and Katherine Crompton Immunalysis Corporation 829 Towne Center Drive Pomona, CA USA Michael Zumwalt Agilent Technologies, Inc S. Meridian Blvd. Englewood, CO USA 摘要本文建立并验证了人发中苯二氮艹卓类成分及其代谢物的定量分析方法人发样品经清洗和消化处理, 其中存在的所有药物成分采用混合模式固相萃取和液相色谱 - 串联质谱 (LC/MS/MS) 在电喷雾正离子化模式下进行检测液相色谱分离采用粒径为 1.8 µm 的 ZORBAX 快速分离高通量 C18 色谱柱 (RRHT) 方法验证采用监测两种离子转变和测定其离子比值的方法, 该比值应在已知校正标准的 20% 之内每种化合物测定的浓度范围是 50 ~ 1000 pg/mg 人发在 100 pg/mg(n = 5) 浓度下的日内精密度最低为测定 7- 氨基硝西泮时的 1.75%, 最高为测定 α- 羟基阿普唑仑的 11.8% 日间精密度( 每天一次, 连续五天 ) 最低为测定地西泮的 2.55%, 最高为测定 7- 氨基氯硝西泮的 13.4% 据我们所知, 本方法首次包括了同时监测确认离子, 且要求所含确认离子与初级离子的比值应在一个特定的比值之内以获得可靠的鉴定结果 Agilent 软件独有性能可以监测转变并自动计算成比值, 该比值必须落在校正标准范围之内才可认为是正确的结果, 确认离子在监测时必然抑制测定的灵敏度, 但增加结果的可信度对法医学分析而言是一个更为关键的因素引言苯二氮艹卓类化合物是频繁使用的处方药物, 用作镇静抗焦虑催眠和肌肉松弛剂当与乙醇或其它药物结合使用时会产生强化效果, 因此, 常被滥用并表现出潜在的成瘾性特别是保健从业人员对苯二氮艹卓类药物和鸦片制剂的滥用率比其它药物更高 [1] 采用人发作为生物标本, 依靠被测人发的长度并与血样或尿样对比可以更好地监控个体的药物使用历史对于医疗从业人员寻求重获许可或对于那些不得不频繁检测的人员将人发样品纳入检测可能是很有用的 Scott 和 Nakahara 于 2003 年报道了鼠毛中检测八种苯二氮艹卓类成分能够结合进入人发 [2], 而其他文献仅对单一药物进行了报道, 如与药物有关的性侵害案中的检测 [3] 最近,Miller 等报道了采用免疫检测和 LC/MS/MS 方法对人发中九种苯二氮艹卓成分的测定方法并应用于真实样品的测定在人发样品中测得的药物浓度范围对地西泮而言从 30 pg/mg 至 200 pg/mg[4] 以上

2 本文报道人发中 14 种苯二氮艹卓类成分和 5 种代谢物的测定测定过程包括同时监测确认离子, 所含确认离子与初级离子的比值应在一个特定的比值之内以获得可靠的鉴定结果 Agilent 软件的性能使转变可以被监测并自动计算成比值, 该比值必须落在校正标准范围之内才可确定为可靠的结果在一些情况下, 监测确认离子转变可能降低检测的灵敏度, 但对于法医学分析而言, 增加结果的可信度是一个更为关键的因素该方法的定量限为 50 pg/mg 人发 ; 日内精密度 (n = 5) 范围从测定 7- 氨基氯硝西泮的 1.75% 至测定 α- 羟基阿普唑仑的 11.78%, 日间精密度 (n = 5) 范围从测定地西泮的 2.55% 至测定 7- 氨基氯硝西泮的 13.37% 在另一篇 Agilent 应用报告 ( EN) 中已报道血样和尿样中这类化合物的分析方法, 读者可参考该报告中给出的这些化合物的结构图实验部分样品制备溶剂和试剂所有溶剂均为 HPLC 级或更高纯度的溶剂 ; 所有试剂均为 ACS 级并购自 Spectrum Chemical (Gardena,CA) 标样 ( 购自 Cerilliant,Round Rock,TX) 混合内标 :7- 氨基氟硝西泮 -d7, 阿普唑仑 -d5, 氯硝西泮 -d4, 替马西泮 -d5, 奥沙西泮 -d5, 去甲地西泮 - d5, 地西泮 -d5(100ng/ml) 未标记物 :7- 氨基氟硝西泮,7- 氨基氯硝西泮,7- 氨基硝西泮,α- 羟基阿普唑仑,α- 羟基三唑仑, 去烃氟西泮, 溴西泮, 氯硝西泮, 硝西泮, 三唑仑, 阿普唑仑, 氟硝西泮, 氟西泮, 劳拉西泮, 咪达唑仑, 氯氮艹卓, 地西泮, 奥沙西泮, 去甲地西泮, 替马西泮提取方法对于每一级定量校正水平, 人发试样 (10 mg) 采用二氯甲烷 (1.5 ml) 直接冲洗以除去人发上的护发成分, 如摩丝喷发胶发胶等, 晾干将人发试样剪成小段, 按下列要求加入被测物和氘代内标物校正曲线 : 阴性 : 50 µl 氘代储备液 (100 ng/ml) 50 pg/mg: 50 µl 氘代储备液 (100 ng/ml), 5 µl 100 ng/ml 储备液 100 pg/mg: 50 µl 氘代储备液 (100 ng/ml) 10 µl 100 ng/ml 储备液 500 pg/mg: 50 µl 氘代储备液 (100 ng/ml), 50 µl 100 ng/ml 储备液 1 ng/mg: 50 µl 氘代储备液 (100 ng/ml), 100 µl 100 ng/ml 储备液在方法验证研究中使用的能力实验样品也要加入氘代内标物 (50 µl) 加入人发提取缓冲液 (0.025 M 磷酸缓冲液,pH 2.7, 1.5 ml); 混合超声振荡 (2 小时,75 C); 倾泻出液体, 加入 0.1 M 磷酸钠缓冲液 (ph 6.0, 1 ml); 涡旋, 将固相萃取柱 (CSDAU020) 放在固相萃取装置上柱预处理 : 甲醇 (3 ml) 去离子水 (3 ml) 0.1 M 磷酸缓冲液 (ph 6.0,2 ml) 重要提示 : 不要使柱床放干 2

3 将样品通过萃取柱, 放干按下列顺序冲洗萃取柱 : 去离子水 (3 ml) 0.1 M 磷酸缓冲液 ph 6.0: 乙腈 (80 : 20 ; 2 ml) 放干萃取柱 ; 用己烷冲洗 (1 ml) 药物洗脱 : 乙酸乙酯 + 2% 氨水 (2 ml) 氮气吹干 (20 psi/37 C) 重新溶于水 (50 µl), 转至自动进样瓶, 盖好分析方法仪器 :Agilent 1200 系列 RRLC ; 6410 三重串联四极杆质谱仪 LC 条件 : 色谱柱 : ZORBAX RRHT Eclipse XDB C18, 4.6 mm 50 mm 1.8 µm ( 部件号 : ), 即使流速为 0.2 ml/min, 氟硝西泮硝西泮和氯硝西泮的 7- 氨基代谢物也能从分析柱上快速洗脱下来对这三个代谢物进行梯度和流速优化也未得到满意的色谱分离随后建立了一个持续仅 3.5 分钟的单独方法, 仅用于监测这三个代谢物通过建立两种方法, 大大改进了色谱分离并提高了灵敏度尽管作者 (CM) 使用 4.6 mm 直径色谱柱也获得了良好的结果, 但 Agilent 还是将填料为 1.8 µm 的 2.1 mm 内径色谱柱作为正常推荐产品, 以便在所采用的流速下提高灵敏度仅用于 7- 氨基代谢物 : 柱温 : 45 C 溶剂流速 : 0.6 ml/min 流动相 : A = 20 mm 甲酸铵,pH 8.6 B = 乙腈等度洗脱,35% B Stop time: 3.5 min Post time: Off 流动相 : A = 20 mm 甲酸铵,pH 8.6 B = 乙腈等度洗脱,50% B 时间 ( 分 ) 流速 (ml/min) Stop time = 10 min; Post time = 5 min MS 条件操作模式 : 电喷雾 ESI 正离子化模式 7- 氨基代谢物其它苯二氮艹卓成分气体温度 : 350 C 300 C 气体流速 (N 2): 6 L/min 6 L/min 喷雾器压力 : 20 psi 50 psi 毛细管电压 : 4000 V 4500 V 多反应监测 (MRM) 示于图 1 对于所有化合物, 第一级四极杆用于母离子的分离, 在低分辨率下操作, 即半峰宽 (FWHM) 等于 2.5 amu 最后一级四极杆用于子离子在单位分辨率下操作, 即 FWHM = 0.7 amu 给出的保留时间与用于定量方法的相同对于每个化合物需要优化两个参数, 包括裂解 (Frag) 电压和碰撞能量 (CE), 以电压为单位表示裂解器是离子传输光学系统的组成部分, 位于离子源和质量分析器之间, 负责传输特定质量的化合物母离子对于每一个化合物都要采用相应标准物质的流动注射分析进行该参数的优化, 通过改变裂解电压, 确定最佳裂解电压值裂解电压一经优化完成, 就要确定碰撞能量电压以保证定量离子和定性离子得到最佳响应定量离子就是所有子离子中信号响应最强的离子定性离子即为次强响应的子离子, 依据其与定量离子峰面积比值用于确证化合物苯二氮艹卓类 ( 除 7- 氨基代谢物 ): 柱温 : 35 C 溶剂流速 : 0.2 ml/min 3

4 表 1. 本文中用于苯二氮艹卓类成分分析的多反应检测 (MRM) 化合物 RT (min) MRM 转变 Frag (V) CE (V) 仅为 7- 氨基代谢物 7- 氨基氟硝西泮 -d > 氨基氯硝西泮 > 222 (121) (25) 7- 氨基硝西泮 > 121 (208) (35) 7- 氨基氟硝西泮 > 226 (256) (25) 其它苯二氮艹卓类成分 : 区段 1 (0.0 min) α- 羟基三唑仑 > 331 (176) (25) α- 羟基阿普唑仑 > 297 (216) (35) 溴西泮 > 288 (209) (30) 区段 2 (4.1 min) 奥沙西泮 -d > 奥沙西泮 > 241 (269) (20) 阿普唑仑 -d > 阿普唑仑 > 281 (274) (30) 劳拉西泮 > 275 (229) (35) 三唑仑 > 308 (239) (35) 硝西泮 > 236 (180) (35) 氯氮艹卓 > 283 (227) (30) 氯硝西泮 -d > 氯硝西泮 > 270 (214) (35) 区段 3 (5.6 min) 替马西泮 -d > 替马西泮 > 255 (177) (40) 氟硝西泮 > 268 (239) (35) 去甲地西泮 > 140 (165) (30) 咪达唑仑 > 291 (249) (40) 区段 4 (7.4 min) 地西泮 -d > 地西泮 > 257 (222) (25) 氟西泮 > 315 (288) (25) *( ) 定性离子 ; 定性离子比值必须小于校正点的 20% LC/MS/MS 方法学验证 100 pg/mg 含量水平上适应性好, 精密且准确 ; 线性范围为 50 ~ 1000 pg/mg 所有药物的日内和日间精分析方法通过标准方案进行验证, 包括线性范围密度均小于 20%, 而大多数苯二氮艹卓类成分的变异系相关性和五天内多次重复 (n = 5) 测定得到的日内数小于 10% 精密度和日间精密度校正曲线必须通过原点校正曲线的典型方程和相关系数 (R2) 示于表 2 ; 检测的图 1 表明测定尿中奥沙西泮的典型校正曲线日间精密度和准确度示于表 3 此外, 检测的日内精 (R 2 > ) 密度和准确度示于表 4 本检测方法在选择的 4

5 表 2. 测定人发中苯二氮艹卓类成分的线型相关系数和允许的定性比值被测物线性方程相关系定性比值 (R 2 ) (20% 范围 ) 7- 氨基氟硝西泮 y = x ( ) 7- 氨基硝西泮 y = x ( ) 7- 氨基氯硝西泮 y = x ( ) α- 羟基阿普唑仑 y = x ( ) α- 羟基三唑仑 y = x ( ) 阿普唑仑 y = 0.001x ( ) 溴西泮 y = x ( ) 氯氮艹卓 y = x ( ) 氯硝西泮 y = x ( ) 地西泮 y = x ( ) 氟硝西泮 y = x ( ) 氟西泮 y = x ( ) 劳拉西泮 y = x ( ) 咪达唑仑 y = x ( ) 硝西泮 y = x ( ) 去甲地西泮 y = x ( ) 奥沙西泮 y = 0.001x ( ) 替马西泮 y = x ( ) 三唑仑 y = x ( ) 表 3. 测定人发中苯二氮艹卓类成分的日间精密度平均值标准偏差 (SD) 精密度 (CV) 和准确度 (100 pg/mg 标准试样,n = 5) 被测物平均值 SD CV (%) 准确度 (%) 7- 氨基氟硝西泮氨基硝西泮氨基氯硝西泮 α- 羟基阿普唑仑 α- 羟基三唑仑阿普唑仑溴西泮氯氮艹卓氯硝西泮地西泮氟硝西泮氟西泮劳拉西泮咪达唑仑硝西泮去甲地西泮奥沙西泮替马西泮三唑仑

表 4. 测定人发中苯二氮艹卓类成分的日内精密度平均值标准偏差精密度和准确度 (100pg/mg 标准试样,n = 5) 被测物平均值 SD CV (%) 准确度 (%) 7- 氨基氟硝西泮 99.78 5.43 5.44 100.22 7- 氨基硝西泮 107.73 12.28 11.40 92.83 7- 氨基氯硝西泮 110.58 1.94 1.75 90.

6 表 4. 测定人发中苯二氮艹卓类成分的日内精密度平均值标准偏差精密度和准确度 (100pg/mg 标准试样,n = 5) 被测物平均值 SD CV (%) 准确度 (%) 7- 氨基氟硝西泮氨基硝西泮氨基氯硝西泮 α- 羟基阿普唑仑 α- 羟基三唑仑阿普唑仑溴西泮氯氮艹卓氯硝西泮地西泮氟硝西泮氟西泮劳拉西泮咪达唑仑硝西泮去甲地西泮奥沙西泮替马西泮三唑仑奥沙西泮 pg/mg 人发 R 2 > 图 1. 采用线性拟合强制过原点和无权重下奥沙西泮的校正曲线 6

7 结果与讨论 Agilent 的仪器性能能够进行人发中 14 种苯二氮艹卓类成分和 5 种代谢物的快速测定在小粒径分析柱上进行的色谱分离能使每个区域的一组色谱峰分开 ( 图 2) 代谢物 7- 氨基硝西泮 7- 氨基氟硝西泮和 7- 氨基氯硝西泮在此 LC 条件下分离效果差, 所以这三种成分在另一个快速测定条件下 (3.5 min) 进行分析图 3 表明人发中确实存在含量为 50 pg/mg 的咪达唑仑在本工作中用于验证的要求是定量离子与定性离子的峰面积比值必须在预期比值的 ± 20% 允许范围内对于本校正浓度, 预期比值为 31%, 处于测定的允许范围 35% 之内 7-aminoclonazepam 氨基氯硝西泮 7-aminoflunitrazepam 氨基氟硝西泮 7-aminonitrazepam 氨基硝西泮 α-oh-triazolam 羟基三唑仑 α-oh-alprazolam 羟基阿普唑仑溴西泮 Bromazepam 三唑仑 Triazolam 硝西泮 Nitrazepam 劳拉西泮 Lorazepam 氯硝西泮 Triazolam 图 2. 从人发中提取的苯二氮艹卓类成分 (100pg/mg): 初级转变 ( 定量离子 ) 7

8 阿普唑仑 Alprazolam 甲氨二氮艹卓 Chlordiazepoxide 奥沙西泮 Oxazepam 咪达唑仑 Midazolam 氟硝西泮 Flunitrazepam 替马西泮 Temazepam 去甲地西泮 Nordiazepam 氟西泮 Flurazepam 地西泮 Diazepam 图 2. 从人发中提取的苯二氮艹卓类成分 (100pg/mg): 初级转变 ( 定量离子 )( 续 ) 8

9 Midazolam, 50 pg/mg level 定量 Qual // 定性 Quant 叠加 overlay Quant 定量离子 ion +/- 20% 允许范围 tolerance 图 3. 证实咪达唑仑存在所使用的定性与定量离子峰面积比值结论本文所述方法适用于采用 Agilent 科技公司的三重串联四极杆 LC/MS/MS 系统进行人发中苯二氮艹卓成分的测定就我们所知, 本方法首次要求定性转变强度与初级转变强度之比必须处于一个特定比值之内参考文献 1. M. R. Baldisseri, Impaired Healthcare Professional, Crit Care Med 35(2): S (2007) 2. K. S. Scott and Y. Nakahara, A Study into the Rate of Incorporation of Eight Benzodiazepines into Rat Hair, Forens Sci Int 133: (2003) 3. P. Kintz, M. Villain, M. Cheze, and G. Pepin, Identification of Alprazolam in Hair in Two Cases of Drug-Facilitated Incidents, Forens Sci Int 153: (2005) 4. E. I. Miller, F. M. Wylie, and J. S. Oliver, Detection of Benzodiazepines in Hair Using ELISA and LC-ESI-MS-MS, J Anal Toxicol 30(7): (2006) 更多信息欲了解本公司产品和服务的更多信息, 请访问本公司网址 9

10 安捷伦对本资料中的错误, 及因使用本资料所引发的相关损失不承担责任本资料中的信息说明和性能指标如有更改, 恕不另行通知安捷伦科技公司,2007 中国印刷 2007 年 5 月 CHCN

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CHCN.qxd LC/MS/MS 测定唾液中苯二氮艹卓类成分应用法医学作者 Christine Moore, Cynthia Coulter, and Katherine Crompton Immunalysis Corporation 829 Towne Center Drive Pomona, CA 91767 USA Michael Zumwalt Agilent Technologies, Inc.