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1 苯丙胺类药物的苯甲酰化提取和 LC/MS/MS 定量分析应用法庭科学作者 Neil Campbell, B. Sc. 化学中心 (WA), 法庭科学实验室 5 Hay Street East Perth, Western Australia 澳大利亚 Michael Zumwalt 安捷伦科技公司 978 S. Meridian Blvd. Englewood, CO 8 美国摘要本文报导了一种用 Agilent G6A 三重串联四极杆质谱仪 (QQQ) 确证苯丙胺类药物是否存在的快速灵敏并经过验证的技术方法在 5 到, ng/ml 范围内呈良好线性本研究中所分析的苯丙胺类药物包括血液中的苯丙胺甲基苯丙胺甲撑二氧苯丙胺 (MDA) 和亚基双氧甲基苯丙胺 (MDMA) 这些药物的制备采用提取烷基化技术, 样品制备后经反相 LC/MS/MS 测定, 采用.8 µm 粒度 C8 柱进行高分离度的快速分离待测物和内标的洗脱时间均短于或等于.6 分钟前言苯丙胺是一类对中枢神经系统有强兴奋作用的拟交感胺类药物苯丙胺是这类药物的母体药物, 其它均在结构上与之相关该系列的其它药物还包括 : 麻黄碱伪麻黄碱甲基苯丙胺苯丁胺氟苯丙胺对氯苯丁胺 MDA 和 MDMA( 摇头丸 ) 本研究中所用的 LC/MS/MS 方法可以对死前和死后血液和尿样, 以及死后肝脏及内脏样品中的苯丙胺类药物进行定量分析一级和二级脂肪胺在碱性条件下与五氟苯甲酰氯反应, 生成各自的酰胺本方法利用这一反应和提取烷基化的原理, 分离这些药物在血液或尿液中形成的产物这些药物的定量采用的是电喷雾液相色谱 / 串联质谱, 多反应监测法 (LC/MS/MS-MRM) 每种药物分析物都监测一个定量子离子, 用于定量, 每种分析物都监测一个另外的子离子进行确证, 称为确认离子将确认离子与定量离子的总离子比定为方法测定值, 用以确证所有样品中是否存在这些化合物这一比值的确认允差为 ± %

2 对于相应的 D5 内标, 因为不需要确证, 所以只监测定量离子的浓度范围中有所反映标准用甲醇稀释, 加入血液中, 使浓度范围达到约 5 到, ng/ml 这些化合物的结构见图 NH CH C 9 H N NH CH CH C H 5 N. 内标 µg/ml D5- 苯丙胺 D5- 甲基苯丙胺 D5-MDMA 和 D5-MDA 混合物标准品购自生产厂商, 安瓿封装, ml 甲醇中各含 µg 药物. 按预测的浓度范围将标样加到血液中, 测定响应因子相应的血液浓度为和 µg/ml 每批分析必须含空白 H N 图. 实验 CH O MDA MDMA C 9 H NO C H 5 NO 本研究中所分析化合物的结构 O 试剂 (Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia). 5% 五氟苯甲酰氯 (PFBCl)( 将.5 ml PFBC 加入 5 ml 氯丁烷中 ). 三乙胺 / 环己烷 (TEA/CH)( 将.5 ml TEA/CH 加入 5 ml 量筒中, 滴加环己烷使终体积为 5 ml, 混合, 使两相分离 ). 氨缓冲液 ( 烧杯中加入 ml 水, 溶解氯化铵至得到饱和溶液用浓氨水调节 ph 至 9. ). 无水硫酸钠标样 (Cerilliant, Round Rock, TX, USA). 目标药物的固体标样溶于甲醇制成标准参考溶液各化合物之间的实际量稍有不同, 将在后面报告 O O HN CH CH 样品制备. 将. ml 血液加至 5 ml 一次性试管中, 用 ml 水稀释加入 5 ml 含有 D5- 苯丙胺混合标样的 TEA/CH 溶液 ( 使浓度达到 5 ng/5 ml). ml 氨溶液和. ml 新配制的 5% PFBCl 溶液或者, 用自动稀释器 (Hamilton Microlab Series 5). 到 ml 稀释程序, 也可以更方便地对血液取样和稀释. 标准参考溶液的处理同上, 将. ml 空白血加到稀释的标样中. 涡旋混合分钟,6 C 加热分钟, 并离心 ( 见注 ). 去除有机相, 使其通过填充无水硫酸钠的巴斯德吸管进行干燥, 并蒸干 5. 用 µl 甲醇复溶后, 移至自动进样器微量样品管中, 盖封, 用 LC/MS/MS-MRM 进行分析注 :. 前述的内标量相当于 5 ng/ml, 相应的浓度范围为到 ng/ml. 如果没有氘代类似物, 为分析物选择的内标必须与其化学性质相匹配, 即, 伯胺使用伯胺, 仲胺使用仲胺

3 . 涡旋混合时可能出现乳化, 用巴斯德吸管搅拌, 并重新离心, 即可破乳. 苯丙胺甲基苯丙胺 MDMA MDA 反应时不需要加热, 如果还要对麻黄碱进行测定, 则必须包含加热步骤 LC/MS/MS 仪器本工作所用的 LC/MS/MS 系统包括 :Agilent 系列真空脱气机二元泵自动进样器柱温箱 Agilent G6A 三重串联四极杆质谱仪 (QQQ) 和 G98B 电喷雾离子源 (ESI) 用 Agilent MassHunter B.. 软件进行系统控制和数据处理液相色谱和质谱的详细条件如下 LC/MS 方法 LC 条件色谱柱 : Agilent ZORBAX XDB-C8,.6 x 5 mm,.8 µm ( 部件号 ) 柱温 : 6 C 流动相 : A = 氨缓冲液 (ph = 9), 见试剂 B = 甲醇流速 :.7 ml/min 梯度 : 时间 ( 时间 ) %B. 5.. 后运行时间 = 分钟进样体积 : µl MS 条件 : 模式 : Agilent G98B 离子源 ESI 正离子化模式喷雾器 : 5 psig 干燥气流量 : 6 L/min 干燥气温度 : 5 C V cap: V Q 分辨率 : 单位,.7 amu (FWHM) Q 分辨率 : 单位,.7 amu (FWHM) MRM 设置见表注意, 各 MRM 的裂解电压和停留时间都是固定的, 分别为 V 和毫秒表. 本工作中所分析化合物的 MRM 设置 ( 用于确证的确认离子也在括号中显示 ) 化合物母离子子离子 ( 确认离子 ) 碰撞能量苯丙胺 9 (9) 5 D5- 苯丙胺 5 5 甲基苯丙胺 9 (9) 5 D5- 甲基苯丙胺 9 5 MDMA 88 6 (5) D5-MDMA 9 65 MDA 7 6 (5) D5-MDA 结果与讨论图 a 到 d 显示了各化合物从 5 到, ng/ml 范围的线性注意, 进行了二次曲线拟合, 这里没有权重, 未过原点所有条拟合曲线的相关系数均大于.999 从图 a 到 d 可见, 二阶系数均小于.7, 对线性拟合的影响很小, 得到的曲线对所有测定来说可以认为是线性的要确证是否存在某种化合物, 其确认离子和定量离子的峰面积之比必须符合方法开发时得到的理论值, 允差在 ± % 范围内批内的所有样品, 包括校正样品和质控 (QC) 样品, 都必须符合这一标准, 否则视为阴性每个化合物的离子比值确认实例见图 a 到 d

4 .5 Amphet - 7 Levels, 7 Levels Used, 7 Points, 7 Points Used, QCs y =.69 * x ^ * x -.89E-5 R^ = Relative responses.5.5 苯丙胺.5 86 ng/ml R > _ Relative concentration 图 a. 血中苯丙胺的线性 Relative responses Methamphet - 7 Levels, 7 Levels Used, 7 Points, 7 Points Used, QCs y =.6 * x ^ +.68 * x -. R^ =.9999 甲基苯丙胺 ng/ml R > _ Relative concentration 图 b. 血中甲基苯丙胺的线性

5 . MDA - 7 Levels, 7 Levels Used, 7 Points, 7 Points Used, QCs y =.878E- * x ^ +.85 * x -.85 R^ = Relative responses MDA ng/ml R > _ Relative concentration 图 c. 血中 MDAL 的线性.8.6. MDMA - 7 Levels, 7 Levels Used, 7 Points, 7 Points Used, QCs y =.6 * x ^ +.6 * x -.7 R^ =.9999 Relative responses..8.6 MDMA 6. 8 ng/ml R > Relative concentration 图 d. 血中 MDMA 的线性 5

6 . + MRM (. 9.) AMPH5.d. 9., 9.7. Counts.8.6. Counts.8.6. ± % 图 a. 血中苯丙胺的离子比值确证注 : 保留时间为.5 分钟 MRM (. 9.) AMPH5.d , Counts.5 Counts 图 b. 血中甲基苯丙胺的离子比值确证注 : 保留时间为.6 分钟.5 + MRM (7. 6.) AMPH5.d , 7 5 Counts.5.5 Counts 图 c. 血中 MDA 的离子比值确证注 : 保留时间为. 分钟 6

7 + MRM (88. 6.) AMPH5.d , Counts.5.5 Counts 图 d. 血中 MDMA 的离子比值确证注 : 保留时间为. 分钟我们还考察了血中两个不同浓度水平苯丙胺 (amp) 和甲基苯丙胺 (meth) 的重现性结果列于表 a 和 b, 血液浓度分别为.5 和.5 µg/ml, 各进样次结果显示,.5 µg/ml 苯丙胺和甲基苯丙胺相对于 D5 内标的峰面积相对标准偏差 (%RSD) 分别为.8 和.89,.5 µg/ml 浓度水平的峰面积相对标准偏差分别为. 和.7 验证. 本方法采用的是一个已发表的验证方法和一个经过广泛验证的内部 GC-MS 方法用 LC/MS/MS-MRM 检测是一项不需要再验证的确定技术. 每次分析之间的精密度已通过对重复进样的统计分析进行了测定表 a. 苯丙胺和甲基苯丙胺在.5 µg/ml 血液浓度水平时的重现性进样次数苯丙胺峰面积 D5 苯丙胺峰面积相对响应甲基苯丙胺峰面积 D5 甲基苯丙胺峰面积相对响应 (area cts*) (area cts*) (area cts*) (area cts*) 标准偏差. 标准偏差.6 %RSD.8 %RSD.889 7

8 表 b. 苯丙胺和甲基苯丙胺在.5 µg/ml 血液浓度水平时的重现性进样次数苯丙胺峰面积 D5 苯丙胺峰面积相对响应甲基苯丙胺峰面积 D5 甲基苯丙胺峰面积相对响应 (area cts*) (area cts*) (area cts*) (area cts*) 标准偏差. 标准偏差.8 %RSD.6 %RSD.7. 用本方法成功分析了已知浓度的苯丙胺和甲基苯丙胺商用质控样品, 和实验室间熟练水平测试样品. 空白血和尿中加入一定浓度的苯丙胺标样, 对其进行分析建立校正曲线结果显示, 方法在 5 到 ng/ml 浓度范围内呈线性对于大于或小于这一范围的结果, 将报告为大于或小于或者报告该结果为近似值, 或扩展标样范围使其包含该浓度, 再对样品重新进行分析 5. 通过质控数据和精密度考察测定方法的不确定度为 %(95% 置信度 ) 致谢特别感谢安捷伦同事 John M.Hughes 给予宝贵的评论和意见更多信息如果需要进一步了解我们的产品和服务, 请访问我们的网站了解本应用报告更详细信息, 请与安捷伦科技公司的 Michael Zumwalt 联系结论本文报道的 LC/MS/MS 方法可用非常短的分析时间, 对全血中的多种滥用药物进行快速确证和定量多反应监测的几个碎片离子不仅用作定量离子, 也作为确认离子用.8 µm 粒径的安捷伦 C8 柱获得了极高分离度和良好峰形, 使用.6 mm 内径色谱柱和 ESI 接口时, 采用了 7 µl/min 较高的流速在苯丙胺和甲基苯丙胺.5 µg/ml 的血液浓度下, 达到了 % RSD 相对响应安捷伦对本资料中出现的错误, 以及由于提供或使用本资料所造成的相关损失不承担责任本资料中涉及的信息说明和规格, 如有变更, 恕不另行通知安捷伦科技公司,7 年 7 年月 5 日中国印刷 CHCN

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CHCN.qxd Agilent 1200 RRLC 和 6410 三重串联四极杆质谱仪定量测定尿中乙基葡糖醛酸应用法医学作者 Julie Marr, Dustin Yaworsky, and Rita Steed Agilent Technologies, Inc. 2850 Centerville Road Wilmington, DE 19808 Jeffrey Keever Agilent Technologies,