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1 使用 Agilent J & W DB-35MS 超高惰性 GC 色谱柱分析主流香烟烟雾中烟草特有 的亚硝胺类致癌物质 应用报告 GC/MS 作者 Da Wu 上海烟草 ( 集团 ) 股份有限公司长阳路 77 号中国, 上海 8 Yun Zou, Chongtian Yu Agilent 科技 ( 上海 ) 有限公司英伦路 4 号外高桥保税区中国, 上海 3 摘要 开发了一种简便 灵敏的测定主流香烟烟雾中 TSNAs 的常规分析方法 采用 ISO 4387 方法收集香烟烟雾中的微粒物质 用二氯甲烷 Agilent Bond Elut 氧化铝 B SPE 小柱进行颗粒物的提取 净化, 后用配备 Agilent J & W DB-35MS 超高惰性 GC 色谱柱的 Agilent 7A 三重四极杆 GC/MS 系统进行分析 正如本研究中对 NNK 的分析结果一样, 方法的检测限较低并且具有良好的线性和样品回收率 前言 烟草中特有的亚硝胺类化合物 (TSNAs), 是一组只存在于烟草和烟草烟雾中的致癌物质 他们产生于烟草和烟草制品生产加工过程中的产生的尼古丁和相关的生物碱类化合物 [] NNN(N' 亚硝基去甲烟碱 ),NNK((4- 甲基亚硝胺 )--(3- 吡啶基 )-- 丁酮 ),NAB (N'- 亚硝基假木贼碱 ) 和 NAT(N- 亚硝基新烟草碱 ) 是烟草及其烟雾中常见的 TSNAs [] NAB 是一种弱致癌物质,NAT 缺乏活性 [], 但国际癌症研究署经过研究已将 NNK 和 NNN 列为最有可能致癌的化合物 [3,4] TSNA 的常规分析可以采用基于带热能量分析仪 (GC-TEA) 的 GC 法 [5,6], 也可以采用配备不同检测技术 ( 诸如 UV 或 MS) 的高效液相色谱法 (HPLC)[7 8] 然而,TEAs 是硝基专署检测器, 使用 TEA 无法区别与硝基化合物共流出的亚硝基化合物 因此低含量水平的 TSNAs 分析对这一技术的灵敏度而言是一个巨大的挑战

2 通常情况下, 采用非极性或中等极性 GC 色谱柱分析 TSNAs, 如 (5%- 苯基 )- 甲基聚硅氧烷,(5%- 苯基 )- 甲基聚硅氧烷, 效果差不多 TSNAs 是活性化合物 为了监测烟草烟雾的危害, 需要对痕量水平的 TSNAs ( 低于皮克级 ) 进行测定 为了确保准确定量 TSNAs, 选择低柱流失和高惰性的色谱柱是非常重要的 本应用报告展示使用 Agilent J&W DB - 35MS 超高惰性 GC 毛细管色谱柱在 Agilent 7A 三重四极杆 GC/MS 系统上分析主流烟卷烟雾中 TSNA 化合物的分析方法 对该方法的线性 检测限 回收率和准确性等方面进行了评估 色谱柱惰性的提高, 使这种分析方法非常适用于 TSNAs 的常规分析 实验部分试剂与标准品 实验中使用的标准品均购自 Sigma Aldrich 公司 ( 中国上海 ) 包括 NNN,NAT,NAB 和 NNK 的 TSNAs 的储备液, 通过将浓度为 ng/ml 的标准品储备液用二氯甲烷适当稀释制成 将 D4 NNK 和 D4 NNN 作为内标 内标物标准溶液采用等分法, 用二氯甲烷稀释纯化合物至浓度为 4 ng/ml 储备液用于制备校正曲线的标准溶液 校正溶液通过用二氯甲烷稀释 TSNA 储备液的方法制得, 共分 9 个浓度标准, 浓度范围从.5 ng/ml 到 ng/ml 每个标准溶液样品中含有 ng/ml 的内标 样品制备本文中的香烟由上海烟草公司提供 按照 ISO 4387: 的方法将 支香烟中产生的烟雾颗粒收集于 CFPs 将 CFPs 转移到 5 ml 锥形瓶中, 然后加入 ml 内标溶液 ( ng/ml 的 D4 NNK 二氯甲烷溶液 ) 将锥形瓶置于水平摇床, 摇动 4 min 取 3 ml 提取液上样于经二氯甲烷预活化处理过的 Bond Elut 氧化铝 B SPE 小柱 ( 部件号 48,5mg,3 ml) 后用 ml 二氯甲烷淋洗 接着用 3 ml 8% 的甲醇二氯甲烷 (V/V) 溶液洗脱, 收集洗脱液并用 Agilent 7 A 三重四极杆 GC/MS 系统分析 仪器 分析在 Agilent 789 GC 与 7 A 三重四极杆 GC/MS 系统联用平台上进行 分流 / 不分流进样口使用长寿命隔垫 ( 部件号 ) 和不分流脱活衬管 ( 部件号 ) 仪器条件列于表 7 A 三重四极杆系统配备惰性电子轰击 (EI) 离子源, 在 MRM 模式下运行 对每个目标流份选定母离子和两个子离子 ( 见表 ) 表. Agilent 7A 三重四极杆 GC/MS 的仪器和分析条件 GC Agilent 789 A 系列 自动进样器 Agilent 7683 A 自动进样器和样品盘 进样模式 脉冲不分流 载气 氦气 柱流速. ml/min 流量恒定 进样口温度 5 C 进样量 µl 色谱柱 Agilent J&W DB-35ms Ultra Inert, 3 m.5 mm,.5 µm( 部件号 -383UI) 柱箱温度 三重四极杆质谱仪 Agilent 7 A 系列 模式 电子轰击 传输线温度 5 C 溶剂延迟 5 C ( 保持 min), 以 3 C/min 的速度升温至 7 C, 后以 5 C/min 的速度升温至 5 C, 接着以 3 C/min 的速度升温至 3 C ( 保持 5 min) min 离子源温度 8 C 四极杆温度 Q 和 Q = 5 调谐文件 MRM 模式条件分辨率碰撞气体流量 Atunes.tune.xml 宽 检测器增益 5 氮气. ml/min, 氦气.5 ml/min

3 表. MRM 参数 定量转换 定量转换 化合物 母离子 (m/z) 子离子 (m/z) CE (ev) 易制毒化学离子 (m/z) 子离子 (m/z) CE (ev) NNN D4-NNN NAT NAB D4-NNK NNK 结果与讨论 碱性氧化铝 SPE 小柱在许多标准中都有使用, 目的是为了进一步净化烟雾提取物 烟草的类型, 产地和储存条件可能影响 TSNA 的含量 碱性氧化铝 SPE 小柱适用于大多数类型的香烟烟雾分析, 但有时也需要进一步的浓缩或稀释 色谱柱选择烟草烟雾基质中包含了痕量水平的 TSNAs 为了达到最高灵敏度并优化峰形, 对包括 (5%- 苯基 )- 甲基聚硅氧烷和 (5%- 苯基 ) - 甲基聚硅氧烷在内的不同类型的 GC 柱分离 TSNAs 的性能进行了比较, 当色谱柱为非惰性或者存在活性位点时, 活性 TSNAs 将出现峰拖尾现象 图 显示的是 7A 三重四极杆 GC/MS 系统测定 TSNAs 标准溶液 (5 ng/ml, 含有 ng/ml ISTDs) 和实际样品提取物的色谱图 TSNA 化合物可以在 Agilent J & W DB - 35MS 超高惰性 GC 色谱柱上获得基线分离, 而且峰形良好 按照先前的步骤制备了两种品牌的香烟样品 图 的分析结果显示, 使用 DB-35MS 超高惰性 GC 色谱柱时, 烟草烟雾中的杂质和基质不会对目标化合物的定量测定产生影响 超高惰性色谱柱的性能确保了 TSNAs 分析中的准确定量 3

4 NNN-STD NNK-STD NNN 3 NNK NNN D4-NNN (ISTD) 3 NNK D4-NNK (ISTD) NAT-STD NAT NAB-STD NAB NAT NAB 图. 使用 Agilent 7 A 三重四极杆 GC/MS 系统和 Agilent J & W DB 35 MS 超高惰性.5 mm 3 m,.5 µm 色谱柱分析 TSNA 标准溶液和实际样品的 MRM 色谱图 方法性能 TSNAs 中致癌性最强的是 NNK [9] NNK 监测是常规分析中最重要的工作 由于 TEA 方法灵敏度的限制, 一些弗吉尼亚型主流香烟烟雾中的 NNK 无法被检测到 [] 因此用如下简单而高灵敏度的方法应用 Agilent 7 A 三重四极杆 GC/MS 配备 Agilent J & W DB 35 MS 超高惰性 GC 色谱柱对主流香烟烟雾中的痕量 NNK 进行分析 采用同位素标记的 D4 - NNK(ISTD) 作为内标定量 配置浓度范围从.5 ng/ml 至 ng/ml 的 9 个不同水平的校正标准品 重复进样三次绘制校正曲线,NNK 的线性极佳,R =.9993, 表明使用同位素标记的取代物作为内标, 可以得到更好的定量准确度和精密度 校准曲线如图 所示 4

5 方法的检出限 (MDLS) 通过统计方程 MDL = S t(99%,n = ) 计算得出, 其中 S 是标准偏差,t 是学生的 99% 置信区间 将浓度为.5 ng/ml 的标准溶液重复进样十次, 用于进行 MDL 的计算 NNK 的 MDLs 估计值是.3 ng/cig 这种方法的 MDL 比 GC/TEA 法低得多 (NNK 的 MDL 是.4 ng/cig)[], 这说明使用 Agilent 7 A 三重四极杆 GC/MS 系统和 DB-35MS 超高惰性 GC 色谱柱可以提供极高的灵敏度 定量限值 (LLOQ) 通过测定 NNK 响应的信噪比 (SNR) 来确定 LLOQ 是.87 ng/cig (SNR = ) 通常情况下, 弗吉尼亚型香烟烟雾中的 NNK 含量要比混合型香烟烟雾中的 NNK 含量低数倍, 后者范围为 ~ ng/cig 由于 7 A 三重四极杆具有出色的灵敏度, 几乎可以对所有类型香烟中的 NNK 含量进行监控, 而不需要进一步浓缩 采用基质空白加标的方法测定了方法的回收率 空白 CFP 中添加已知量的 NNK 按照上述样品制备过程对 CFP 进行提取和净化 结果列于表 3 回收率由实验得到的平均值除以理论值得到 结果范围从 98.8% 到.% 不等, 极为优异 采集混合型和弗吉尼亚型两种类型的香烟烟雾用于 NNK 的精确测定 方法的准确性通过在两种香烟样品的 CFPs 中加入已知量的 NNK 进行评估 加入三个浓度的 NNK: 约一半量的 NNK 大致相同的 NNK 约一倍量的 NNK 加标样品根据样品制备中的步骤进行处理 加标样品的分析精度数据列于表 4 所有数据均基于每个浓度水平的六次重复进样所得的分析结果 对 NNK 而言, 取得了良好的回收率, 范围处于.% 到 6.8% 之间, 方法重现性的 RSDs 小于 5% NNK QCs y =.48*x R = 图. NNK 校正曲线, 浓度范围从.5 ng/ml 到 ng/ml 的二次曲线拟合 >.999 5

6 表 3. 在空白 CFP 中加入三种浓度 NNK 的加标样品回收率 分析物 加标 (ng) 计算 (ng) 回收率 (%) NNK 参考文献. S.S. Hecht, D. Hoffmann, Carcinogenesis 988, 9, K.D. Brunnemann, L. Genoble, D. Hoffmann, Carcinogenesis 987; 8: S.S. Hecht, J. Natl. Cancer Inst. 9 (999), p. 94. 表 4. 三个加标浓度水平的烟雾提取物中实验室强化基质加标方法的准确度分析物 分析物 结论 样品 NNK 含量 (ng/ cig) 加标 (ng) 计算 (ng) 准确度 (%) NNK 弗吉尼亚型 香烟 NNK 混合型 香烟 此应用报告展示了一种主流香烟烟雾中 TSNA 化合物的高灵敏分析方法, 方法中使用了 Agilent J&W DB 35 超高惰性 GC 柱和 Agilent 7 A 三重四极杆 GC/MS 系统 TSNA 化合物可得到基线分离并具有良好的峰形 色谱柱优异的惰性确保了定量结果的准确性 使用该系统分析, 方法的检出限低于标准方法的要求 这项研究中观察到分析 NNK 时, 取得了良好的线性和回收率 本文所述的方法非常适合主流香烟烟雾中 TSNAs 的常规检测 4. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans, Smokeless Tobacco and Some Tobacco-specific Nitrosamines, vol. 89, International Agency for Research on Cancer (IARC), Lyon (7). 5. J.D. Adams, K.D. Brunnemann, D.J. Hoffmann, Chromatogr., A 983, 56, I.S. Krull, M. Swartz, R. Hilliard, K.H. Xie, J.N. Driscoll, J. Chromatogr., A 983, 6, K.A. Wagner, N.H. Finkel, J.E. Fossett, I.G. Gillman, Anal. Chem. 5, 77, J. Wu, P. Joza, M. Sharifi, W.S. Rickert, J.H. Lauterbach, Anal. Chem. 8, 8, S.S. Hecht, Biochemistry, Biology, and Carcinogenicity of Tobacco Specific N-nitrosamines, Chem Res Toxicol 998;: F. Xie, Y. Jin, M. Zhao, S. Wang, K. Liu, Q. Su, Acta Tabacaria Sinica 4; : 8. 如需了解更多信息 如需了解更多产品和服务方面的信息, 请访问网站 : 安捷伦对提供 展示或使用本材料所造成的任何直接或间接损失概不负责 本材料中的信息, 说明和技术指标如有变更, 恕不另行通知 安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司, 中国印刷 年 9 月 8 日, CHCN

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