高效药物清洁验证的通用 UHPLC/UV/MS 方法应用简报药物质量控制 (QC) 原料药和药品生产 GMP 清洁验证作者 Syed Salman Lateef Vinayak AK 安捷伦科技公司 Michael W. Dong Christine Gu 小分子分析化学与质量控制 Genen

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1 高效药物清洁验证的通用 UHPLC/UV/MS 方法应用简报药物质量控制 (QC) 原料药和药品生产 GMP 清洁验证作者 Syed Salman Lateef Vinayak AK 安捷伦科技公司 Michael W. Dong Christine Gu 小分子分析化学与质量控制 Genentech, South San Francisco 摘要清洁验证 (CV) 是药品生产质量管理规范 (GMP) 对原料药和药品生产的要求大多数药物的清洁验证研究通常选用配备紫外检测器的液相色谱仪, 其灵敏度水平约为 ng/ml 对于高效药物, 应用配备扩展光程流通池的紫外检测或质谱检测可实现灵敏度水平低至 ng/ml 的清洁验证方法在 Agilent 6150 系列单四极杆液质联用系统上使用安捷伦喷射流离子源的 UHPLC/MS 方法具有更高的灵敏度, 其显示出更低 ( 约 0.5 ng/ml) 的定量限 (LOQ) 此外, 采用更高的进样量可进一步降低 LOQ 本研究介绍了对范围为 0.5 ng/ml 至 1000 ng/ml 的五种模型药物的 2 分钟通用清洁验证方法该通用清洁验证检测方法通常可适用于许多不同的药物, 只需极少的方法开发认证和转换工作本应用简报还介绍了采用用户补充的 NIST 质谱库搜索程序鉴定未知化合物

2 前言必须进行清洁验证 (CV) 以证明生产链 ( 容器和加工设备 ) 的清洁度, 确认活性药物成分 (API) 已被充分去除, 达到预先确定的可接受限值开发针对高效药物 (SafeBridge 类别 3B 或 4 1 ) 或具有弱发色团的药物的高灵敏度 CV 方法极具挑战性对于高效药物而言, 可接受标准通常要求检测限低至 ng/ml 级利用长光程 UV 流通池或质谱检测器能够提高传统 LC-UV 方法的灵敏度 2 此外, 偶尔观察到未知化合物, 应当在 CV 研究中进行鉴定本研究的目的是展示一种快速灵敏通用的 UHPLC/UV/MS 方法, 用于对高效药物进行清洁验证, 并建立一种更简单的鉴定未知化合物的方法配备 UV 最大光强流通池的 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统由于光程扩展而表现出更高的信号强度在早期研究中, 使用传统 HPLC 色谱柱所进行的清洁验证研究表明,60 mm 最大光强流通池的灵敏度相比于标准 10 mm 流通池提高了约 2-5 倍 3,4 在此研究中我们证实了采用更快速的 UHPLC 方法获得了相似的结果 Agilent 6150 系列单四极杆质谱仪也同样适用于高灵敏度 CV 检测安捷伦喷射流离子源 (AJS) 通过使用热鞘气将喷雾集中防止离子源中的进一步柱外电喷雾谱带展宽, 与标准电喷雾离子源 (ESI) 相比, 灵敏度提高多达 10 倍 AJS 离子源还适用于更宽的流速范围 ( µl/min) CV 方法所用的高流速可缩短分析时间, 且不影响峰容量 AJS 离子源相比于常规 ESI 源, 还能够使不同类别的化合物实现更有效的离子化单一通用的 UHPLC/UV/MS CV 方法提高了中试规模或制造工厂的实验室工作效率 5, 对快速样品周转提出了更高的要求在 CV 样品中, 可能存在不同的残留化合物, 例如来自当前或之前批次的 API 副产物降解物赋形剂或清洁剂借助用户创建的质谱库, LC/UV/MS 检测还可鉴定色谱图中的未知峰 Agilent OpenLab ChemStation 有利于在 NIST 质谱库搜索程序中创建附加的自定义谱库本应用简报记录了使用 Agilent Poroshell C18 色谱柱 ( mm, 2.7 µm) 针对五种常见药物开发的通用高通量 UHPLC/UV/MS 方法相比于那些全多孔颗粒填料色谱柱, 这种以表面多孔颗粒填料填充的快速液相色谱柱可改善动力学性能, 并且能够在 1 ml/min 流速下运行 2 分钟使用该程序, 采用 UV 和 MS 相结合的方法能够对范围为 0.5 ng/ml 至 1000 ng/ml 的五种模型药物的混合物进行测量对此方法的方法性能 ( 例如特异性精密度准确度检测限 (LOD) 定量限 (LOQ) 和线性 ) 进行测定, 结果发现其能够满足预期用途要求还展示了自定义质谱库的创建及其搜索功能该方法可能适用于各种药物的 CV, 且所需的方法开发认证和转换工作极少 2

3 实验部分开发出一种通用的 LC-UV/MS 方法并应用于五种模型药物 : 磺胺甲二唑磺胺甲恶唑心得安丙咪嗪和阿米替林尽管这些药物并不具有很高的药效, 但是选择它们足以说明方法性能和系统功能本文还展示了采用标准流通池和扩展光程 UV 流通池以及 MS-SIM/SCAN 模式对上述药物进行分析所获得的各种下的线性本研究还使用大体积进样对磺胺甲恶唑的信噪比 (S/N) 的改善程度进行了探究表 1 显示了所开发的通用方法的仪器参数详情试剂与材料使用的所有溶剂和添加剂均为 LC/MS 级, 购自 Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, USA) 纯水来自 Millipore 公司的 Millipore Milli-Q 水纯化系统 (Billerica, MA, USA) 标样的前处理在 100% 甲醇中配制为 1000 µg/ml 的磺胺甲二唑磺胺甲恶唑心得安丙咪嗪和阿米替林储备液使用 50:50 [ 甲醇 : 流动相 A (MPA)] 将储备液稀释为 10 µg/ml 的工作溶液通过连续稀释配制各种的线性溶液 (ng/ml) 分别为 : 和表 1. LC-UV/MS 通用方法中所用的实验参数和仪器安捷伦液质联用系统参数设定值 Agilent 1290 Infinity 二元泵 (G4220A) 流动相 A 10 mm 甲酸铵 + 0.1% 乙酸水溶液流动相 B 75/25 MeOH/ACN,10 mm 甲酸铵,0.1% 乙酸流动相梯度 0 min 10% B,1.5 min 90% B,1.6 min 10% B,2.0 min 10% B 流速 1 ml/min Agilent 1290 Infinity 自动进样器 (G4226A) 保持在 4 C 下进样量 5 µl( 使用 70/30 的 ACN/ 水溶液对进样针清洗 10 s) Agilent 1290 Infinity 柱温箱 (G1316C) 温度 40 C 色谱柱 Agilent Poroshell 120 EC-C18, 3 30 mm, 2.7 µm Agilent 1290 Infinity 二极管阵列检测器检测 280±4 nm,270±4 nm,260±4 nm,240±4 nm 参比 400±20 nm 配备 AJS 的 Agilent 6150 四极杆液质联用系统 (G6150BA) 正离子模式 SIM 模式 (M+H) + : 扫描模式 : 干燥气流速雾化器压力 10 L/min 45 psig 干燥气温度 300 C 鞘气温度 200 C 鞘气流速毛细管电压喷嘴电压驻留时间碎裂电压 / 峰宽 10 L/min 3000 V 1500 V 47 ms 100/0.1 min OpenLAB CDS ChemStation 版工作站 (M8301AA) 版本 C.01.05[36] NIST 质谱库搜索程序版本 2.0 g 3

4 结果与讨论 UHPLC/UV 检测在该通用 UHPLC/UV 方法中使用配备高灵敏度最大光强 60 mm 流通池或标准 10 mm 流通池的 Agilent 1290 Infinity 二极管阵列检测器 ( 表 1) 在使用 10 mm 流通池的情况下, 将五种化合物的混合物重复进样六次所获得的色谱图进行叠加 ( 图 1) 使用两种流通池进行最高为 ng/ml 的线性实验就磺胺甲二唑而言, 使用高灵敏度流通池和标准流通池分别得到 5 ng/ml 和 20 ng/ml 的 LOQ 正如预料, 采用高灵敏度流通池得到的检测限比采用 10 mm 流通池得到的检测限低 3-4 倍这些结果与早期研究相差无几 2 采用两种流通池得到的 LOD/ LOQ 范围如表 2 所示使用 UV 检测器和标准流通池可获得 ng/ml 的 LOQ 在该线性范围研究中, 处于实验水平的化合物的线性表明相关系数 R 2 > 0.99( 图 2) 图 1. UHPLC/UV 结果用标准 10 mm 流通池在 280 nm (1000 ng/ml) 下重复进样获得的六幅色谱图的重现性叠加阿米替林的峰高较小, 因为 280 nm 并非该化合物的最佳波长表 2. 使用最大光强高灵敏度流通池 (60 mm) 和标准流通池 (10 mm) 的 UHPLC/UV 方法验证结果 LOD 10 mm LOD 60 mm LOQ 10 mm LOQ 60 mm 峰面积精度 60 mm RT 精度 60 mm 相关系数 10 mm 相关系数 60 mm 化合物 (ng/ml) (ng/ml) (ng/ml) S/N (ng/ml) S/N LOQ (RSD%) LOQ (RSD%) R 2 R 2 磺胺甲二唑磺胺甲恶唑心得安丙咪嗪阿米替林

5 图 2. 使用高灵敏度 60 mm 流通池进行的 UHPLC/UV 线性研究单四极杆质谱仪 (SQMS) 检测如表 1 所述的 2 分钟通用梯度方法采用配备 AJS 离子源的 Agilent 6150 单四极杆质谱仪开发得到 30 ng/ml 的混合物的色谱图如图 3 所示采用为 0.5 ng/ml 至 100 ng/ml 的溶液进行的线性实验, 结果表明上述溶液在该范围内表现出良好的线性在该 UHPLC/MS 方法中获得 0.5 ng/ml 的 LOQ, 这与 Liu 等人所述的用于高效药物的时间较长的 LC/MS 方法的灵敏度 6 性能相当或更出色图 ng/ml 混合溶液的 UHPLC/MS (SIM) 结果 5

6 发现 LOQ 下的峰面积和保留时间的 RSD 分别小于 5% 和 0.1%( 表 3) 实验下所有化合物的线性均表现出线性相关系数或 R 2 > 0.98( 图 4) 采 2 用 1/x 的加权因子由线性方程推算出的准确度值处于 15% 以内 ( 表 4) 还将单离子监测 (SIM) 方法所获得的 LOQ 同 MS 扫描数据进行了比较, 其中 SIM 和全扫描数据在同一次运行中进行采集来自全扫描数据的化合物提取离子色谱图 (EIC) 的 LOQ 对于所有化合物均为 5 ng/ml( 数据未示出 ), 表明 SIM 模式的灵敏度比全扫描模式高大约 10 倍表 3. UHPLC/MS (SIM) 方法验证结果化合物 [M+H]+ 线性范围 (ng/ml) LOD (ng/ml) LOQ (ng/ml) S/N LOQ 下的峰面积 RSD (%) (n = 6) 磺胺甲二唑磺胺甲恶唑心得安丙咪嗪阿米替林 LOQ 下的 RT RSD (%) (n = 6) 用于 LC/MS 运行的大体积进样研究了在高灵敏度 CV 方法中使用大体积进样获得更低 LOQ 的可能性这对于需要更高灵敏度的情况十分有用大体积进样可提高峰面积和 S/N, 但是可能增加谱峰展宽这可能并非 CV 测定中主要关心的问题, 因为在实际 CV 样品溶液中很少观察到与多种 API 相关的峰使用该通用方法获得的三种不同的磺胺甲恶唑的大体积进样结果如表 5 所示结果表明, 在 30 mm 色谱柱上, 当进样量由 5 µl 增加至 12 µl 时, 峰面积峰宽和 S/N 分别提高了 57% 31% 和 41% 磺胺甲恶唑研究表明, 采用更高体积的进样 (10 µl) 能够使灵敏度再提高 2 倍在本研究所用的 3 mm 色谱柱上, 采用 12 µl 以上的大体积进样将导致谱峰分裂图 4. 药物化合物的 UHPLC/MS (SIM) 方法线性表 4. UHPLC/MS (SIM) 方法准确度 ng/ml 磺胺甲二唑磺胺甲恶唑心得安丙咪嗪阿米替林

7 用户补充的 MS 单位质量谱库利用 UHPLC/MS 方法进行 CV 时, 能够在全扫描模式下对未知化合物进行检测查找未知峰有待进一步研究根据质谱图使用软件辅助化合物的鉴定有利于快速鉴定开发出由用户创建的单位质量质谱库以扩充作为 OpenLab ChemStation 附加软件的 NIST 质谱库搜索程序, 并将五种标准化合物的谱图加入到谱库中进样分析磺胺甲恶唑, 并在扫描模式下采集色谱图在用户创建的谱库中搜索扫描模式谱图结果 ( 图 5) 表明磺胺甲恶唑得到正确鉴定因此, 利用补充了参比标样中用户补充的光谱信息的 NIST 质谱库搜索程序可轻松鉴定未知峰表 5. 对磺胺甲恶唑溶液进行大体积进样得到的峰面积峰宽和 S/N (ng/ml) 进样量 (µl) 峰面积峰宽 (min) S/N B C A D 图 5. NIST 质谱库搜索程序 A) 所鉴定的化合物是磺胺甲恶唑的概率为 96.9% B) 未知化合物的谱图 C) 谱库化合物和未知化合物的比较图 D) 标样的谱库谱图 7

8 结论高效药物的 CV 需要采用高灵敏度和高通量方法本研究开发出了一种用于 CV 的 2 分钟通用方法, 并采用五种常见药物对其进行了验证, 结果展示了该方法在此应用中的性能使用 UV 和 MS (SIM) 检测分别可获得 ng/ml 和 0.5 ng/ml 的 LOQ 使用最大光强 UV 流通池和大体积进样可进一步改善该方法, 其灵敏度可分别提高 2-4 倍和 2 倍 ( 使用 10 µl 的进样量 ) Agilent 1290 Infinity UHPLC 与配备安捷伦喷射流离子源 (AJS) 的 Agilent 6150 单四极杆质谱仪在 SIM 或 SCAN 模式下运行, 为 CV 研究提供了一种通用的工具, 适用于对来自生产设备的冲洗溶液进行定量分析此外, 通过搜索用户补充的质谱库可轻松鉴定未知化合物参考文献 1. Farris, J.P., et.al. History, implementation and evolution of the pharmaceutical hazard categorization and control system. Chemistry Today 2006, 24 (2), pp Dong, M.W, et.al.a generic HPLC/UV platform method for cleaning verification. Amer. Pharm. Rev. 2012, 15 (6), pp Naegele, E., Kornetzky, K. Highly Sensitive UV Analysis with the Agilent 1290 Infinity LC System for Fast and Reliable Cleaning Validation Part 1: Measurement of calibration curves, determination of LOD and LOQ and method validation using a DAD equipped with standard or high sensitivity flow cell( 利用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统进行高灵敏度紫外分析, 可实现快速可靠的清洁验证第 1 部分 : 使用配有标准或高灵敏度流通池的 DAD 测量校准曲线测定 LOD 和 LOQ 以及进行方法验证 ) 安捷伦应用简报 2010, 出版号 EN 4. Naegele, E., Kornetzky, K. Highly Sensitive UV Analysis with the Agilent 1290 Infinity LC for Fast and Reliable Cleaning Validation Part 2: Monitoring a cleaning validation procedure using a DAD equipped with standard or high sensitivity flow cell ( 利用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统进行高灵敏度紫外分析, 可实现快速可靠的清洁验证第 2 部分 : 使用配有标准或高灵敏度流通池的 DAD 监控清洁验证程序 ) 安捷伦应用简报 2010, 出版号 EN 5. Dong, M.W., A Three-Pronged Template Approach for Rapid HPLC Method Development. LCGC North America 2013, 31 (8), pp Liu, L, Pack, B.W. Cleaning verification assays for highly potent compounds by high performance liquid chromatography mass spectrometry: Strategy, validation, and long-term performance. J. Pharm Biomed. Anal. 2007, 43, pp 查找当地的安捷伦客户中心 : 免费专线 : , ( 手机用户 ) 联系我们 : LSCA-China_800@agilent.com 在线询价 : 本文中的信息说明和指标如有变更, 恕不另行通知安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司, 年 6 月 1 日, 中国出版 CHCN

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