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识侯
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药物的主要代谢产物软件辅助下高通量鉴定用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱飞行时间和四极杆 - 飞行时间仪器快速采集数据, 并用安捷伦 MassHunter 代谢物鉴定软件对代谢物进行鉴定应用报告药物研究与开发中代谢产物的鉴定作者 Edgar Naegele 安捷伦科技公司 Waldbronn, Germany

1 药物的主要代谢产物软件辅助下高通量鉴定用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱飞行时间和四极杆 - 飞行时间仪器快速采集数据, 并用安捷伦 MassHunter 代谢物鉴定软件对代谢物进行鉴定应用报告药物研究与开发中代谢产物的鉴定作者 Edgar Naegele 安捷伦科技公司 Waldbronn, Germany 摘要本应用报告报导了 : 用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统对体外试验获得的代谢物进行快速分离用 Agilent 6530 精确质量四极杆飞行时间液质联用系统快速采集飞行时间质谱图用安捷伦 MassHunter 代谢物鉴定软件对体外试验的主要代谢物进行软件辅助下的快速鉴定用安捷伦 MassHunter 软件对鉴定出的代谢物生成报告

2 前言在现代药物开发中, 至关重要的是对可能的候选新药的吸收分布代谢和排泄 ( 统称为 ADME) 性质进行分析, 以便尽快确定是否继续对特定化合物的开发投入经费要找到具有合适性质的化合物, 首先要在大量化合物中进行 ADME 性质筛查, 这要求在高通量环境下工作本应用报告报导了用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统 Agilent 6530 四极杆 - 飞行时间质谱系统和 MassHunter 代谢物鉴定软件对新药候选化合物的主要代谢物进行的快速高通量鉴定实验仪器 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统, 由集成式脱气的 1290 Infinity 二元泵 1290 高效恒温自动进样器, 和 1290 Infinity 柱温箱组成 Agilent 6530 精确质量四极杆 - 飞行时间液质联用系统安捷伦 MassHunter 代谢物鉴定 (MetID) 软件色谱柱 :ZORBAX SB-C18, 2.1 x 50 mm, 1.8 µm 样品制备使用下列储备溶液 : 20 mg/ml 微粒体 S9 的制备 0.1 mg/ml 丁螺环酮水溶液 1.6 mg NADP 溶于 1.6 ml 0.1 M 磷酸盐缓冲液,pH 为 mm 异柠檬酸盐 /MgCl 2 ( 将 203 mg MgCl 2.6H 2 O mg 异柠檬酸盐溶于 20 ml 水中 ) 异柠檬酸脱氢酶 0.33 unit/µl NADPH 再生系统 :1.6 ml NADP 溶液 ml 异柠檬酸盐溶液 µl IDH 溶液保温混合物 :3.85 µl 底物 µl NADPH 再生系统 µl 磷酸盐缓冲液 + 50 µl S9 37 C 下保温 60 分钟在开始 (t=0) 和终止 (t=60 分钟 ) 时各取 100 µl 加入 6 µl 高氯酸和 100 µl 乙腈在 14,000 rpm 下离心 15 分钟后终止反应用 SpeedVac 浓缩仪蒸干上清中的溶剂, 再用含 0.1 % 甲酸的水复溶, 进行 LC/MS 分析用 0 保温时间的样品进行对照 LC 方法溶剂 A: 水 % 甲酸溶剂 B: 丙烯腈 % 甲酸流速 : 0.8 ml/min 梯度 0 分钟, 5 %B; 0.10 分钟, 5 %B; 1.10 分钟, 75 %B; 停止时间 : 分钟平衡时间 : 1 分钟进样 : 进样量 5 µl, 样品在 4 C 冷却, 用 50 % 甲醇冲洗针头 5 秒, 在 0.1 分钟时从进样环转至旁路冲洗, 冲洗因子为 16 色谱柱 : 柱温为 60 C 飞行时间质谱方法离子源 : ESI 正离子毛细管电压 :3500 V 干燥气体 : 12 L/min 雾化器 : 55 psi 气体温度 : 350 C 锥孔电压 : 65 V 碎裂电压 : 200 V 质量范围 : m/z 采集速率 : 5 图谱 / 秒参考质量数 : 和 MetID 软件中的数据分析方法分析的第一步就是将含代谢物 ( 代谢样品 ) 的数据文件和只含母体药物 ( 对照样品 ) 的数据文件进行对比, 用分子特征提取 (MFE) 算法从达到 MS 限的数据中提取所有检测到的质量信号将相关的化合物同位素质量和加合质量均归为离散的分子特征, 并去除化学噪音然后对代谢样品和对照组所列出的化合物进行比较所有新的或那些在代谢样品中增加 2 倍的化合物均被认为是潜在代谢物, 要用不同的算法再进一步进行分析这些算法可以鉴定和验证新代谢物, 或只是对其它算法找到的代谢物进行验证在这个高通量实验中, 所有算法的结果都权重相当, 结合在一起形成最后的鉴定关联分值当其最后的分值在严格定义的关联阈值之上时就确定为代谢物所有算法得到的结果列在一张结果表中, 可以随时浏览和出报告 1 2

3 结果和讨论在 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统上采用 1 分钟梯度洗脱就可在一根 50 mm 1.8 µm 粒度柱上实现代谢物的快速分离代谢物由测试药物丁螺环酮体外试验产生飞行时间质谱仪检测的数据采集速率为 5 Hz 时可得到满意的检测结果数据生成后即被载入 MetID 软件, 并用通用方法进行分析 MetID 软件将结果列在快速一览表中, 在该表中可以查找到每个代谢物结果的更多信息 ( 图 1) 从结果列表可以生成总结报告, 显示每个代谢物的可用信息 ( 图 2) 更详细的报告包含了每个代谢物的详细结果这里以丁螺环酮的单羟基代谢物 ( 图 3 到图 5) 和二羟基代谢物 ( 图 6 到图 8) 为例进行讨论图 1 结果列表中显示了丁螺环酮代谢物分析的一览总结, 包括全部鉴定出的代谢物提取离子色谱图 (EIC) 提取的化合物色谱图 (ECC) 同位素分布模式分析和计算分子式 Rel. BioXF 图 2 结果总结报告, 包括按保留时间 (RT) 代谢物名称和相对分值分子量及各种计算结果通过的用户权限 SC= 对照样品比较, IPM = 同位素分布匹配,EIC = 提取离子色谱图,MDF = 质量缺损过滤器, Form. = 计算分子式,BioXF = 指定的生物转化,Qual. = 根据分值认定,User = 用户认定 3

4 在 0.75 分钟后出峰质核化为的单羟基代谢物的详细报告, 显示了该代谢物本身的详细信息, 例如测定的精确质量计算分子式制定的生物转化和离子类型另外, 报告还显示了每种算法的详细信息, 这些算法包括分子特征提取 (MFE) 提取离子色谱图 (EIC) 化合物检索和质量缺损过滤器结果等 ( 图 3) 对于羟基代谢物, 可能的分子式的计算不仅基于定义的质量误差窗口, 而且还根据测量的同位素形态, 从而提高了化合物分子式的质量, 显著限制了命中的可能数量这些结果还在代谢物结果详细报告中以化学形式显示 ( 图 4) 图 3 保留时间 0.75 分钟处的丁螺环酮羟基代谢物详细代谢物报告报告的这部分给出了有关鉴定的代谢物和鉴定计算方法的详细信息还有关于计算式 ( 图 4) 色谱图和同位素分布 ( 图 5) 的其它详细信息图 4 关于包含同位素分布的分子式的详细代谢物报告, 包括同位素分布对保留时间为 0.75 分钟处丁螺环酮羟基代谢物的计算 4

5 x EIC ( ) A x10 5 ECC B x CIP (C21H32N5O3) ( ) (M+H) (M+H) (M+H) (M+H) [m/z] C 图 5 保留时间 0.75 分钟处丁螺环酮羟基代谢物的详细报告 : A) 质量的化合物的提取离子色谱图 (EIC) B) 保留时间 0.75 分钟丁螺环酮羟基代谢物的提取化合物色谱图 (ECC) C) 保留时间 0.75 分钟丁螺环酮羟基代谢物测量的同位素形态 ( 蓝线 ) 和计算的同位素形态 (CIP, 绿框 ) 最后, 显示了 EIC ECC 和同位素形态 ( 图 5) m/z 质核比为的 EIC 显示丁螺环酮可能的羟基代谢物有 5 个峰, 从中选择了保留时间为 0.75 分钟的一个组分 ( 图 5A ) 保留时间 0.75 分钟分子质量为的提取 MFE 化合物的 ECC, 与 TIC 相同 ( 图 5B) 该化合物测定的同位素形态与基于分子式计算的同位素形态完全符合 ( 图 5C) 在同一数据分析中, 还鉴定出了比单羟基代谢物低两个数量级的二羟基代谢物详细报告显示了二羟基代谢物的具体信息, 该组分于 0.71 分钟洗脱,m/z 为 , 图 6 中还显示了每种计算的详细信息 ( 图 6) 图 6 保留时间 0.71 分钟的丁螺环酮二羟基代谢物的详细代谢物报告报告的这部分给出了有关鉴定的代谢物和鉴定计算方法的详细信息还有关于分子式 ( 见图 7) 色谱图和同位素类型 ( 见图 8) 的其它详细信息 5

6 分子式的计算列于详细的分子式报告中 ( 图 7) m/z 的 EIC 显示丁螺环酮可能的二羟基代谢物有 5 个峰, 选择了保留时间 0.71 分钟的一个组分 ( 图 7A ) 保留时间为 0.71 分钟分子质量为的提取 MFE 化合物的 ECC 与 TIC 一致 ( 图 7B) 该化合物测定和计算的同位素类型见图 7C 图 7 关于分子式的详细代谢物报告, 包括同位素分布对保留时间 0.71 分钟处丁螺环酮羟基代谢物的计算 x10 3 EIC ( ) A x103 ECC B x CIP (C21H32N5O4) ( ) (M +H ) (M +H ) (M +H ) (M +H ) [m/z] C 图 8 保留时间 0.71 分钟处丁螺环酮二羟基代谢物的详细报告 : A) 质量为的化合物提取离子色谱图 (EIC) B) 保留时间 0.71 分钟处丁螺环酮二羟基代谢物的提取化合物色谱图 (ECC) C) 测量的保留时间 0.71 分钟处丁螺环酮羟基代谢物测量与计算的同位素分布 6

7 结论本应用报告介绍了用 Agilent 1290 Infinity 液相色谱系统和 Agilent 四极杆 - 飞行时间液质联用系统, 在高通量条件下, 对体外代谢物样品的快速分离和精确质量进行测定代谢物化合物在 1 分钟之内实现分离, 代谢物鉴定软件提取的峰宽不到 1 秒 (FWHH) 用安捷伦代谢物鉴定软件快速鉴定了主要代谢物, 并生成了总报告及每个代谢物的详细报告参考文献 1. E. Naegele, F. Wolf, U. Nassal, R. Jäger, H. Lehmann, F. Kuhlmann, K. Subramanian, An interwoven, multi-algorithm approach for computerassisted identification of drug metabolites, Agilent Technologies Application Note, publication number EN,

8 安捷伦科技公司, 年 5 月 1 日中国印刷发行号 CHCN

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CHCN_5989_5672.qxd 利用 Agilent 1290 Infinity LC / 6530 Q-TOF MS 液质联用系统和代谢物预测专家软件 Meteor 进行药物代谢物的鉴定应用简报医药, 药物发现作者 Edgar aegele, Horst Lehmann Agilent Technologies GmbH Hewlett-Packard St. 8 76337 Waldbronn Germany Sian