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1 使 用 Poroshell 1 EC-C18 管 柱 快 速 分 析 Cefepime 及 相 關 雜 質 應 用 備 註 製 藥 作 者 William J. Long Agilent Technologies, Inc. 8 Centerville Road Wilmington, DE 1988 USA 緒 論 頭 孢 菌 素 (Cephalosporin) 為 最 常 使 用 的 抗 生 素 類 藥 物, 其 結 構 及 藥 理 性 質 類 似 於 青 黴 素 (penicillin) 類 抗 生 素 頭 孢 菌 素 與 青 黴 素 都 具 有 β 內 醯 胺 環 結 構, 可 干 擾 細 菌 細 胞 壁 的 合 成, 進 而 殺 死 細 菌 1948 年, 義 大 利 科 學 家 Giuseppe Brotzu, 首 先 在 頂 頭 孢 菌 (Cephalosporium acremonium) 的 培 養 基 中, 分 離 出 頭 孢 菌 素 類 化 合 物, 而 禮 來 大 藥 廠 (Eli Lily) 首 先 研 發 出 其 製 劑 Cephalothin, 並 於 1964 年 上 市 頭 孢 菌 素 為 殺 菌 劑, 作 用 機 轉 與 其 他 β 內 醯 胺 類 抗 生 素 ( 如 青 黴 素 ) 相 同 細 菌 的 細 胞 都 有 細 胞 壁 保 護, 而 頭 孢 菌 素 可 阻 斷 細 菌 細 胞 壁 肽 聚 醣 層 的 合 成, 破 壞 細 胞 壁, 造 成 細 菌 死 亡 頭 孢 菌 素 為 β 內 醯 胺 類 化 合 物, 其 β 內 醯 胺 環 融 入 6 圓 環 的 dihydrothiazine 環 中, 形 成 cephem 核 心 結 構 修 飾 此 環 支 鏈 修 飾 基 的 結 構, 可 改 善 制 菌 活 性 及 藥 物 動 力 學 活 性 頭 孢 菌 素 可 依 其 光 學 活 性, 大 致 分 成 4 代 第 一 代 的 頭 孢 菌 素, 主 要 對 革 蘭 氏 陽 性 菌 具 要 活 性, 越 新 一 代 的 頭 孢 菌 素, 則 對 革 蘭 氏 陰 性 菌 的 活 性 越 高, 而 對 革 蘭 氏 陽 性 菌 的 活 性, 通 常 會 降 低 革 蘭 氏 陰 性 菌 具 有 獨 特 的 細 胞 外 膜, 許 多 藥 物 均 無 法 穿 透, 因 此 革 蘭 氏 陰 性 菌 對 抗 生 素 的 抗 藥 性, 普 遍 高 於 革 蘭 氏 陽 性 菌 [1]

2 O OH 本 分 析 使 用 種 安 捷 倫 管 柱 : H 圖 1. Cefepime 的 結 構 Cefepime 為 第 四 代 頭 孢 菌 素 類 抗 生 素, 抗 菌 譜 廣, 對 革 蘭 氏 陰 性 菌 的 活 性 也 已 改 善, 高 於 其 他 已 上 市 的 頭 孢 菌 素 類 藥 物 Cefepime 的 結 構 如 圖 1 所 示 雖 然 相 關 藥 物 已 累 積 了 大 量 研 究, 但 其 定 量 分 析 及 純 度 試 驗, 仍 是 個 難 題 [] 歐 洲 藥 典 (EP) 及 美 國 藥 典 (USP), 刊 載 了 cefepime 及 其 相 關 化 合 物 的 測 定 方 式 [3,4], 均 以 磷 酸 鹽 / 乙 腈 為 沖 提 液, 以 1. ml/ 分 的 流 速, 沖 提 4.6 mm µm 的 管 柱 其 中 將 以 mm µm 的 安 捷 倫 Poroshell 1 EC-C18 管 柱, 快 速 分 析 Cefepime 的 相 關 化 合 物, 並 達 到 USP 及 EP 分 析 法 的 要 求 此 種 管 柱 加 快 了 管 柱 的 分 析 速 度, 也 比 較 不 需 要 經 常 製 備 沖 提 液, 可 節 省 時 間 與 溶 劑, 相 較 於 原 本 的 EP 與 USP 分 析 法, 本 分 析 法 較 不 浪 費 此 外, 使 用 較 短 的 管 柱, 可 以 更 快 速 的 評 估 方 法 調 整 的 可 行 性 而 能 在 較 短 的 時 間 內, 產 生 較 佳 的 效 能 實 驗 S O OCH 3 O H 一 個 安 捷 倫 1 系 列 快 速 分 離 LC (RRLC) 系 統, 具 有 下 列 安 捷 倫 裝 置 : G131B 二 元 幫 浦 SL, 梯 度 沖 提 時 間 視 管 柱 大 小 及 流 速 而 定, 見 表 1 G1367C 自 動 液 體 注 射 器 (ALS) SL, 注 入 量 視 特 定 分 析 法 參 數 而 定, 見 表 1 G1316B 恆 溫 管 柱 室 (TCC) SL, 溫 度 設 定 為 ºC H S G1367C 光 二 極 體 陣 列 偵 測 器, 設 為 4 nm, 如 本 分 析 法 所 述 H 3 C + Cl - HCl H O 安 捷 倫 ZORBAX Eclipse Plus C18 管 柱 4.6 mm µm,p/n 安 捷 倫 Poroshell 1 EC-C18 管 柱 mm.7 µm,p/n 此 外, 也 檢 測 種 4.6 mm µm 不 同 廠 牌 C18 管 柱, 標 記 為 C1 與 C 乙 腈 購 自 Honeywell 公 司, 已 通 過 Burdick & Jackson 試 藥 級 (ACS) HPLC 溶 劑 的 認 證 ; 磷 酸 二 氫 鉀 (Monobasic Potassium Phosphate) 使 用 USP/ACS 級, 購 自 VWR 公 司 ; 水 則 採 用 以 密 理 博 Millipore Milli-Q 系 統 現 場 製 造, 以 18 M 過 濾 至. µm 的 水 以.4 µm 的 再 生 纖 維 過 濾 材 質 ( 安 捷 倫 科 技 公 司 生 產 ), 過 濾 緩 衝 液 USP 級 的 Cefepime Hydrochloride, 及 USP 級 的 Cefepime Hydrochloride 系 統 適 合 性 分 離 標 準 品 (RS), 購 自 美 國 藥 典 編 纂 當 局 樣 品 及 移 動 相, 均 依 照 USP 及 EP 的 說 明 配 製 [3,4] 移 動 相 製 備 本 分 析 法 將 磷 酸 二 氫 鉀 緩 衝 液, 依 照 梯 度 混 合 一 定 量 的 乙 腈 後 使 用 將.68 克 的 磷 酸 二 氫 鉀 溶 於 ml 的 水 中, 製 備 緩 衝 液 緩 衝 液 以 氫 氧 化 鉀 或 磷 酸 調 整 至 ph., 並 以.4 µm 的 過 濾 材 質 ( 本 實 驗 室 使 用 再 生 纖 維 ) 過 濾, 再 經 超 音 波 除 氣 原 本 的 USP 分 析 法, 使 用 緩 衝 液 : 乙 腈 為 9:1 的 溶 液 做 為 移 動 相 A, 且 之 後 所 有 樣 品 均 使 用 此 移 動 相 製 備 調 整 分 析 法 時, 製 備 不 同 比 例 的 移 動 相 A 移 動 相 B 以 1:1 的 體 積 / 體 積 (v/v) 比 例, 混 合 磷 酸 二 氫 鉀 緩 衝 液 與 乙 腈 製 備 而 成 歐 洲 藥 典 (EP) 分 析 法 的 移 動 相 製 備 方 式 類 似, 但 調 整 ph 值 (. M) 用 的 氫 氧 化 鉀 與 磷 酸, 有 明 確 指 定 其 濃 度, 並 明 確 指 定 移 動 相 加 入 乙 腈 前 的 ph 值 試 驗 準 備 精 確 秤 取 7 mg 的 Cefepime Hydrochloride, 倒 入 ml 的 容 量 瓶, 溶 於 移 動 相 中, 並 以 移 動 相 稀 釋 至 足 量, 再 以 超 音 波 震 盪 約 3 分 鐘 測 定 系 統 適 合 性 的 樣 品, 以 7 mg/ ml 的 濃 度 溶 於 移 動 相 A 中 因 雜 質 B 為 難 溶 性 物 質, 務 必 使 用 超 音 波 震 盪 註 : 這 些 溶 液 均 應 立 即 使 用, 或 儲 存 於 冰 箱, 於 1 小 時 內 注 入 使 用

3 結 果 及 討 論 遵 循 USP 及 EP 明 載 的 層 析 條 件 兩 分 析 例 均 指 定 使 用 4.6 mm µm 的 L1 (C18) 管 柱 沖 提 梯 度 設 定 列 於 表 液 相 層 析 儀 一 開 始 以 % 的 移 動 相 A 等 位 沖 提 分 鐘, 之 後 分 鐘 內 則 逐 漸 降 低 比 例 至 % 以 % 的 移 動 相 A 等 位 沖 提 持 續 分 鐘 後, 使 溶 劑 再 平 衡 至 一 開 始 的 % 移 動 相 A 之 組 成 總 分 析 時 間 為 36 分 鐘 一 開 始 進 行 的 USP 及 EP 分 析 法, 指 定 使 用 4.6 mm µm 的 L1 管 柱 3 種 不 同 的 管 柱 列 於 圖 此 分 析 法 指 定 一 個 沖 提 梯 度, 每 項 樣 品 約 需 回 復 4 分 鐘 調 整 本 分 析 法 以 加 快 分 析 速 度, 便 能 改 善 本 分 析 法 本 分 析 法 的 層 析 及 效 能 要 求, 請 見 USP 分 析 法, 摘 要 如 下 [1]: 4.6 mm mm 的 L1 管 柱 (C18) 分 析 物 的 理 論 板 數 () 不 得 少 於 4 個 Cefepime 與 其 相 關 化 合 物 A 的 解 析 度 R, 不 得 低 於 Cefepime 與 其 相 關 化 合 物 B 的 解 析 度 R, 不 得 低 於 Cefepime 的 容 量 因 子 k, 需 高 於.6 管 柱 的 效 率 不 得 少 於 4 個 理 論 板 數 拖 尾 因 子 不 得 超 過 1. 鑑 定 的 目 標 為 :cefepime 的 滯 留 時 間 約 為 1.,cefepime 相 關 的 化 合 物 A 為.7,cefepime 相 關 的 化 合 物 B 為 4.3 USP 修 訂 後 的 第 61 章, 對 於 分 析 法 的 調 整 範 圍, 提 出 建 議 : [] 這 些 調 整 摘 要 於 表 1 先 前 的 分 析, 調 整 了 充 填 顆 粒 的 大 小 及 管 柱 尺 寸 [6,7]. 此 外, 也 有 人 提 議 針 對 相 關 概 要 分 析 法 予 以 重 新 改 變, 以 在 直 線 速 度 保 持 恆 定 的 前 提 下, 縮 小 充 填 顆 粒, 將 目 前 的 流 速 提 高 ± % [8] 這 種 情 況 下, 我 們 也 期 望 於 調 整 較 小 型 管 柱 的 移 動 相 組 成, 所 能 帶 來 的 好 處 表 1. USP 第 61 章 容 許 的 分 析 法 調 整 範 圍 管 柱 長 度 ± 7% 管 柱 內 徑 ± % 管 柱 充 填 顆 粒 大 小 至 多 縮 小 %, 不 得 增 大 流 速 ± % 注 入 量 只 要 符 合 系 統 適 合 性 測 試 (SST) 的 標 準, 便 能 改 變 注 入 量 管 柱 溫 度 ± % 移 動 相 ph 值 ±. 紫 外 光 (UV) 波 長 不 得 改 變 成 製 造 商 規 格 以 外 的 數 據 緩 衝 液 的 鹽 類 濃 度 ± % 移 動 相 的 組 成 ( 次 要 組 成 的 比 例, 可 調 整 成 ± 3% 或 ± % 的 絕 對 值, 以 較 小 者 為 準, 如 USP 所 述 ) USP EP Cefepime C1 Eclipse Plus C18 C 4 1. E. Cefepime 3. F 4. A. B ml/ µl % B 圖. 3 種 不 同 管 柱 以 原 先 方 法 分 析 的 結 果, 每 次 分 析 約 費 時 4 分 鐘 3

4 依 下 列 方 程 式 調 整 沖 提 梯 度 : 若 需 保 持 k* 值 恆 定, 則 上 述 方 程 式 可 精 簡 為 下 列 方 程 式, 計 算 新 的 梯 度 沖 提 時 間 : t g = (t g1 d L F 1 )/(d 1 L 1 F ) t g1 為 原 本 的 梯 度 沖 提 時 間,t g 為 新 的 梯 度 沖 提 時 間 d 1 為 原 本 的 管 柱 內 徑,d 為 新 的 管 柱 內 徑 L 1 為 原 本 的 管 柱 長 度,L 為 新 的 管 柱 長 度 F 1 為 原 本 的 流 速,F 為 新 的 流 速 本 分 析 在 容 許 範 圍 內, 進 行 多 項 調 整 首 先 將 µm 的 充 填 顆 粒 大 小, 調 整 為.7 µm, 以 提 升 效 率, 但 也 升 高 了 背 壓, 不 過 管 柱 縮 短 7%, 因 此 增 加 的 背 壓 很 小 安 捷 倫 Poroshell 1 管 柱 的 優 勢, 為 其 粒 徑 分 佈 較 窄, 因 此 需 使 用 µm 的 濾 片, 與 µm 及 3. µm 管 柱 的 濾 片 相 同, 如 此 一 來, 製 備 樣 品 時, 不 需 太 過 小 心, 而 原 本 的 分 析 方 法, 則 需 非 常 小 心 地 製 備 樣 品 以 3. 小 於 µm 顆 粒 充 填 的 管 柱, 使 用 較 小 型 的 濾 片, 將 充 填 材 料 留 在 管 柱 內, 但 卻 容 易 發 生 堵 塞 [9] 再 來 將 mm 的 管 柱 長 度, 縮 減 7%, 成 為 7 mm, 仍 在 調 整 的 容 許 範 圍 內, 且 若 管 柱 的 效 能 禁 得 起 此 變 化, 則 可 輕 易 提 高 樣 品 處 理 量 表. 沖 提 梯 度 表 4.6 mm mm mm mm µm,.7 µm,.7 µm,.7 µm, 注 入 量 1 ml/ 分 鐘, 1 ml/ 分 鐘, 1. ml/ 分 鐘, ml/ 分 鐘, % 溶 劑 B µl 6 µl 6 µl 6 µl 第 分 鐘 第. 分 鐘 第. 分 鐘 第. 分 鐘 第 分 鐘 第 3. 分 鐘 第. 分 鐘 第 1. 分 鐘 第 3 分 鐘 第. 分 鐘 第 6.67 分 鐘 第. 分 鐘 第 3 分 鐘 第. 分 鐘 第 7. 分 鐘 第. 分 鐘 第 36 分 鐘 第.8 分 鐘 第 7. 分 鐘 第.4 分 鐘 第 4 分 鐘 第 13. 分 鐘 第 分 鐘 第 6.7 分 鐘 移 動 相 的 次 要 組 成 為 % 的 乙 腈,USP 規 定 可 調 整 成 ± 3% 或 ± % 的 絕 對 值, 以 較 小 者 為 準, 即 可 降 低 為 7% 或 提 高 至 13%; 根 據 EP 的 規 定, 仍 是 改 變 成 7-13% 本 分 析 可 使 用 此 大 幅 縮 短 的 管 柱, 快 速 計 算 幾 種 乙 腈 的 濃 度 務 必 注 意, 本 層 析 使 用 多 種 溶 劑, 但 不 影 響 樣 品 製 備 執 行 本 分 析 時, 發 現 雜 質 B 的 溶 解 度 低 於 其 他 成 分, 若 未 遵 照 本 分 析 法 的 說 明, 以 超 音 波 充 分 震 盪, 此 成 分 將 不 會 溶 解 ml/ 1 圖 3. 全 多 孔 性 顆 粒 充 填 的 安 捷 倫 Eclipse Plus C18 管 柱, 及 安 捷 倫 Poroshell 1 EC-C18 管 柱. ml/ 4.6 mm 7 mm Poroshell 1 EC-C18 1. ml/ 4.6 mm 7 mm Poroshell 1 EC-C18 1. ml/ 4.6 mm 7 mm Poroshell 1 EC-C mm mm Eclipse Plus C18 µm 4

5 圖 4 顯 示, 流 速 提 高 至 ml/ 分 鐘, 以 更 快 速 評 估 分 析 法 如 圖 所 示, 一 開 始 乙 腈 的 比 例 為 11% - 8%, 在 藥 典 規 定 的 調 整 範 圍 內 乙 腈 的 比 例 為 % 時,cefepime 與 雜 質 B 的 解 析 度 為, 但 將 一 開 始 的 有 機 修 飾 劑 比 例, 降 低 至 8% 時, 兩 成 分 的 波 峰 解 析 度, 升 高 至 4.9 結 果 很 明 顯, 將 一 開 始 的 濃 度 降 低 至 7% 以 上 時, 可 額 外 提 高 波 峰 的 解 析 度, 但 在 超 出 這 些 範 圍 的 調 整, 將 改 變 分 析 法, 需 再 行 確 效 = % Rs= = 9% Rs=4.7 = 8% = 11% 圖 4. 調 整 有 機 修 飾 劑 含 量, 以 改 善 解 析 度 使 用 安 捷 倫 Poroshell 1 EC-C18 管 柱, 快 速 開 發 分 析 方 法 1. E. Cefepime 3. F 1 4. A 1 ml/ 1 3. B 4 1 Bar ml/ 1 Bar ml/ 3 Bar 圖. 使 用 mm 的 安 捷 倫 USP Poroshell 1 EC-C18 管 柱, 進 行 cefepime 雜 質 分 析 法 的 最 終 改 善, 利 用 一 開 始 8% 的 乙 腈, 以 各 種 流 速 進 行 沖 提

6 表 3. 要 求 : 安 捷 倫 Poroshell 1 EC-C18 管 柱,4.6 7 mm,.7 µm 1 ml/ 分 鐘 1. ml/ 分 鐘 ml/ 分 鐘 16 bar 1 bar 3 bar 不 對 稱 因 子 (Tf) < > k > Rs C/a Rs C/b 超 出 上 述 範 圍 的 調 整, 將 改 變 分 析 法, 需 再 行 確 效 若 選 用 較 短 的 管 柱, 如 4.6 mm mm 的 管 柱, 同 樣 的 分 析 可 在 原 本 的 % 時 間 內 完 成, 溶 劑 也 只 需 使 用 原 本 的 %, 但 是 必 須 再 次 進 行 完 整 的 確 效 在 這 種 情 形 下, 執 行 此 等 試 驗 方 法 的 確 效, 可 能 較 容 易, 至 於 雜 質 的 分 析 法, 則 不 那 麼 常 執 行 表 及 表 3 顯 示, 本 分 析 可 將 36 分 鐘 的 分 析 時 間, 輕 易 縮 短 至 7. 分 鐘 ; 分 析 時 間 縮 減 8%, 卻 不 須 使 用 新 的 設 備 因 此 實 驗 室 便 能 在 點 收 原 料 後 小 時 內, 完 成 檢 驗, 不 須 等 到 4 小 時 結 論 使 用 mm 長 以 全 多 孔 性 顆 粒 充 填 的 LC 管 柱, 進 行 藥 典 分 析 法 的 實 驗 室 人 員, 可 改 用 表 面 多 孔 性 顆 粒 充 填 的 Poroshell 1 管 柱, 完 全 不 需 更 換 現 有 的 儀 器, 便 享 有 分 析 速 度 解 析 度 及 靈 敏 度 均 提 升 等 好 處 7 mm 長 的 管 柱, 仍 在 USP 及 EP 指 引 容 許 的 調 整 範 圍 內 使 用 Poroshell 1 管 柱, 加 快 了 分 析 速 度, 提 高 處 理 量 及 產 能 適 度 調 整 各 種 藥 典 分 析 法, 改 用 較 短 的 管 柱, 及 以 較 小 的.7 µm 顆 粒 充 填, 所 獲 得 的 結 果 便 有 大 幅 改 善 參 考 資 料 1. D. Yahav M. Paul A. Fraser. Sarid L. Leibovici Cefepime 的 效 與 安 全 性 : 系 統 回 顧 及 統 合 分 析 (Efficacy and Safety of Cefepime:A Systematic Review and Meta- Analysis) 刺 胳 針 感 染 性 疾 病 期 刊 (Lancet Infect Dis.) 7, 7, S. R. El-Shaboury G. A. Saleh F. A Mohamed A. H. Rageh 頭 孢 菌 素 類 抗 生 素 的 分 析 (Analysis of Cephalosporin Antibiotics) 藥 劑 暨 生 物 藥 劑 分 析 期 刊 (J. Pharm. Biomed. Anal), 第 4 卷,1 19 頁 7 年 3. 美 國 藥 典 Cefepime 雜 質 分 析 法 美 國 藥 典 31 版, 美 國 國 家 處 方 集 6 版 (United States Pharmacopeia 31 F 6) 麻 里 蘭 州 羅 克 維 爾 (Rockville) 8 年 4. Cefepime 雜 質 分 析 法 歐 洲 藥 典 (The European Pharmacopeia) 第 七 版 歐 洲 理 事 會 11 年. 美 國 藥 典 分 析 法 確 效 指 引 美 國 藥 典 3 版 增 補 : 系 統 適 合 性 測 試 (United States Pharmacopeia 3 Supplement :System Suitability Testing) 第 61 章 麻 里 蘭 州 羅 克 維 爾 7 年 6. William Long Anne Mack 和 Yun Zou 以 µm 3. µm 及 1.8 µm 的 ZORBAX Eclipse Plus C18 管 柱, 改 善 分 析 Simvastatin 的 方 法 (Improved Simvastatin Analysis Using ZORBAX Eclipse Plus C18 µm, 3. µm, and 1.8 µm Columns) E 7. William J. Long 快 速 分 析 aproxen 錠 劑, 改 善 美 國 藥 典 的 分 析 法 (Faster analysis of aproxen Tablets, Improvements on the USP Method) LC-GC 雜 誌 安 捷 倫 科 技 出 版 年 6 月 8. Uwe D. eue Doug McCabe Vijaya Ramesh Horacio Pappa Jim DeMuthc 將 高 效 液 相 層 析 程 序, 移 轉 至 尺 寸 較 小 及 充 填 顆 粒 較 小 的 適 當 管 柱 (Transfer of HPLC Procedures to Suitable Columns of Reduced Dimensions and Particle Sizes) 藥 劑 論 壇 (Pharmacopeial Forum), 第 3 冊, 第 6 卷 9 年 11 月 至 1 月 9. Dorothy J. Phillips Mark Capparella Uwe D. eue Zoubair El Fallah 新 型 小 顆 粒 充 填 管 柱, 可 加 快 分 析 速 度, 且 解 析 度 高 (A new small particle packing for faster analysis with high resolution) 藥 劑 暨 生 物 藥 劑 分 析 期 刊 (J. Pharm. Biomed. Anal), 第 1 期, 頁 1997 年 詳 細 資 訊 有 關 本 公 司 產 品 與 服 務 的 其 他 資 訊, 請 造 訪 本 公 司 的 網 站 : 本 文 內 容 如 有 任 何 錯 誤, 或 是 因 為 提 供 實 行 或 使 用 本 資 料, 造 成 附 帶 或 衍 生 損 害, 安 捷 倫 恕 不 負 責 本 文 件 中 的 資 訊 說 明 和 規 格 可 能 隨 時 變 更, 恕 不 另 行 通 知 安 捷 倫 科 技 公 司,11 年 於 美 國 印 製 11 年 3 月 18 日 CHTW

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