TRIDENT APFO NEW PRODUCT TRAINING 2006

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1 Agilent 6410B 串联四极杆质谱仪

2 HPLC / RRLC 的市场领导地位 : 效率和性能 1200 系列液相色谱和快速高分离度液相色谱

3 Agilent 1200 系列液相色谱家族 制备液相 单元泵系统 二元及四元梯度液相系统 高分离度快速液相系统 毛细管及纳流液相系统 液相色谱芯片 / 质谱 NEW Poroshell 120 LC columns 更多的检测器选择 (UV 和 ELSD) 最低的进样残留 更快的分析方法建立工具 更多的化学工作站功能 更强大的实验室监控诊断软件 更宽的液相色谱芯片应用

4 Licorice ( 欧亚甘草 ) 的根茎提取物 - 常规液相分析 mau 450 MWD1 B, Sig=254,16 Ref=450,100 (BUD\LIC D) G 22.8 min Peak capacity (@ Rs 1.0) = GA min min Analysis of licorice root extract B using a Zorbax SB-C x 250 mm column, 5-μm. 306 Peaks in 60 mins MWD1 B, Sig=254,16 Ref=450,100 (BUD\LIC D) mau GA min

5 Licorice ( 欧亚甘草 ) 的根茎提取物 -RRLC 分析 - 分析速度, 分辨率和灵敏度都显著提高 mau 450 MWD1 B, Sig=254,16 Ref=450,100 (BUD\LIC D) G 14.6 min Peak capacity (@ Rs= 1.0) = GA 25.5 min Analysis of licorice root extract B, using a Zorbax SB-C18 Rapid-Resolution HT, 4.6 x 150 mm column. 426 Peaks in 30 mins mau MWD1 B, Sig=254,16 Ref=450,100 (BUD\LIC D) GA min min

6 Rg1 Re Rb1 RRLC vs HPLC: 20min vs 120min -speed and sensitivity mau DAD1 B, Sig=203,16 Ref=off (XIYANGSHENG\DEF_LC \XYS D) mau *DAD1 B, Sig=203,16 Ref=off (XIYANGSHENG\XIYANGSHEN \XYS D) *DAD1 B, Sig=203,16 Ref=off (XIYANGSHENG\DEF_LC \XYS D) RRLC- enlarged 仅仅 20 分钟 min RRLC HPLC min

7 Agilent Method Translator Tool 安捷伦方法转换工具软件 A simple tool to help users converting established methods to the Agilent 1200 Series Rapid Resolution LC System utilizing the full power of ZORBAX RRHT sub-2µm particle columns! (Free-P/N EN)

8 Agilent 37 年的质谱研发经验 5930A A B MSD Single Quad 2006, present LC/MSD Series Series 2006-Present 4500, 7500 Series ICP/MS 1994-Present Ion Trap Series 2000-Present ESI-TOF Series 2003-Present 6410 Triple Quad 2006, , 6520 Q-TOF 2006, 2007 销售总数超过 40,000 MS Agilent Sells More MS Systems Than Any Other Vendor

9 Agilent 6000 系列液相色谱 / 质谱平台 包括 : 单四极 系列 串联四极质谱 系列 离子阱质谱 系列 飞行时间质谱 (TOF)-6200 系列 四极杆 - 飞行时间串联质谱 (Q-TOF)-6500 系列 食品分析解决方案 最佳性能价格比的 Agilent 6410 Triple Quad LC/M

10 Agilent 6410B 三重串联四极质谱 出色的灵敏度和稳定性 高灵敏度 可靠性和易操作性 具有 fg 级的高灵敏度高分析结果重现性全自动调谐高可靠性和易操作性正负切换模式一个分析方法可以采集大于 10,000 个 MRM

11 全自动调谐及质量轴校正内置调谐校正标样 内置调谐液用于质谱的调谐和质量轴校正 调谐标样

12 QQQ-MRM 数据采集模式的优点

13 安捷伦液质联用离子源的选择范围最宽 电喷雾离子源 ( 标准配置 ) 大气压化学电离离子源组合离子源 (ESI/APCI) 大气压光电离源 (APPI) 液相色谱 - 芯片 / 质谱接口毛细管电泳 / 质谱接口

14 安捷伦 - 质谱和离子化技术的领导者先进的离子化技术可以实现 - 更高的离子化效率 ; 更高的灵敏度 ; 更高的耐污染能力安捷伦 -Innovation in Mass Spec 169 patents in ten years.

15 Agilent 离子源 --- 专利直角喷雾技术 传统设计 安捷伦设计 离子截取区 热 干燥气 : 加热氮气 锥孔设计, 离子截取区小平面设计, 具有较大离子截取面积, 加热氮气防止中性物质进入毛细管 溶剂喷雾 雾化气 零电位直角喷雾设计 喷雾针免调, 实现分析方法快速转换 离子截取面积大, 灵敏度高 ; 反吹干燥氮气, 去溶剂效果好, 耐受液相 高流速有效阻挡中性分子, 减少污染并保护真空 ; 大口径非加热石英毛细管, 离子传输效率高, 有效防止样品热降解

16 6410B 的设计特点 a L/s 8 1. 反吹干燥气 不加热毛细管设计 ---- 增强了去溶剂化效率同时减少化学噪音 2. 射频八极杆 ---- 在宽质量范围内, 保证更高的离子传输效率 3. L2 RF--- 大大增强了高质量数离子的传输效率. 安捷伦专利! 4. 四极杆 --- 控温双曲面四极杆提高了离子传输效率和质谱的分辨率 5. 后预四极杆 --- 增强了离子进入以及离开碰撞反应池的传输效率 6. 碰撞反应池 --- 线形加速高压碰撞反应池技术大大提高了 MS/MS 的解离效率, 以及降低了 记忆效应, 即使在很小的离子驻留时间下, 也未发现 记忆效应 六极杆有助于碎片离子的传输 7. 四极杆 2--- 双曲面四极杆提高了离子传输效率和质谱的分辨率 8. 双打拿极设计 --- 可以获得更高的信号增益, 实现正负极性的快速切换, 提高检测器的寿命和降低噪音, 离轴设计可防止中性物质进入电子倍增器 9. 电子倍增器具有超常的寿命

17 专利的离子光学设计 - 宽质量范围内获得更高的离子传输效率 Vacuum wall 提高灵敏度的主要单元 Capillary Rough Pump Quad Mass Filter (Q1) Octopole 1 Lens 1 and 2 Turbo Turbo 高频八极杆 提高全范围的离子传输效率 安捷伦专利技术透镜 2 RF 增强高质荷比离子的灵敏度 透镜 2 的相位与四极杆 1(Q1) 匹配, 显著提高灵敏度质荷比 (m/z) 越高的离子, 产生的效果就越明显 (m/z 609, 提高 3 倍 ) 恒温热双曲面四极杆

18 Transmission 六极杆碰撞池的优点 1.2 四极杆六极杆八极杆 Mass (m/z) 离子聚焦 : 四极杆 > 六极杆 > 八极杆 离子传输效率 : 八极杆 > 六极杆 > 四极杆 六极杆 : 将离子聚焦和全质量范围离子传输效率

19 性能出色的六极杆碰撞池设计 -- 提供更高的灵敏度和提高离子碰撞碎裂效率 Collision Cell 六极杆 线性加速 (10 V) 高压 碰撞池 ; 高速数字电路 Turbo 1. 高压六极杆碰撞池设计使离子连续加速, 快速通过碰撞池 --- 提高灵敏度分析更多样品 MRM 模式下 ( 定量 ), 减少离子驻留时间而不损失灵敏度 --- 提高分析速度 3 分析结果更准确 有效消除 记忆效应 --- 减少交叉污染

20 Arb. Units. Collision Cell Clearing Profile Collision gas = 7mTorr 0 V collision energy 5 V Applied Axial Potential Beam Turn-off Characteristics mz922 mz msec 350msec microseconds

21 双曲面加热恒温四极杆设计 双曲面四极杆 MS1 MS2

22 碰撞池 ( 六极杆 ) 独一无二的双打拿极设计 提高离子检测效率 双打拿极 Q3( 四极杆 ) 离子束整形 出口电极 检测器

23 离子检测技术优势 - 长寿高能双打拿极 (HED): 正离子模式 负离子模式 无论是正离子还是负离子检测都保证进入倍增器的是电子而不是带电的化合物, 保证灵敏度的同时提高检测器的寿命!

24 三重串联质谱的数据采集方式 母离子扫描 -Parent Ion Scan 子离子扫描 -Product ion Scan 中性丢失扫描 -Constant Neutral Loss 选择离子检测 -Select Ion Recording 多反应检测 -Multiple Reaction Monitoring

25 母离子扫描 Q1 全扫描 Collision Cell 5-40 ev Q3 选择离子扫描 m/z m/z 118 m/z

26 子离子扫描 Q1 选择离子扫描 Collision Cell 5-40 ev Q3 全扫描 m/z m/z m/z m/z 74.3

27 中性丢失扫描 Q1 扫描 Collision Cell 5-40 ev Q3 扫描 m 3 m 2 m 3-x m2-x m 1 m 1-x Q1 和 Q3 均采用扫描模式,Q3 采集的 m/z 为 Q1 采集的 m/z 减去设定的中性丢失质量

28 选择离子检测 Q1 选择离子扫描 Collision Cell 5-40 ev Q3 选择离子扫描 m/z m/z m/z

29 多反应检测 (MRM) Q1 Fixed Collision Cell 5-40 ev Q3 Fixed m/z 118 m/z

30 100 fg 的氯霉素 :S/N > 50:1 -LOD < 5 fg

31 记忆效应 (Cross talk) 评价 500 pg 阿普唑仑 (Alprazolam), 20 ms 离子驻留时间 m/z 309 m/z cts Area RSD = 0.68% m/z 400 m/z cts Top scale is 225X bottom => No detectable cross-talk

32 驻留时间的影响评价 200 pg ( 阿普唑仑 )100, 20, 5 ms 的驻留时间 Dwell 100 ms 20 ms 5 ms Area % RSD ms dwell

33 Area Response Relative Response 优异的重现性和可靠性 6410B QQQ 样品 - 添加在人血浆提取物里的阿普唑仑十个小时内连续 500 次进样 5 pg injections of Alprazolam in human plasma extract Internal Standard = <2% RSD External Standard = <4% RSD Injection Number 0.0

34 Agilent 6410B 串联质谱的软件系统 Mass Hunter QQQ Quantitative Analysis Software Marc Tischler Agilent Technologies

35 安捷伦的质谱工作站 仪器控制在线监测分析方法设定自动调谐 定性分析色谱结果谱图的结果寻找化合物 定量分析可定义数据过滤器化合物的信息定量校正曲线

36 数据采集和自动化 仪器状态 在线质谱图 极性切换, 离子化模式, 扫描模式选择 方法编辑器 序列编辑器

37 数据采集和自动化 数据采集模式选择

38 目标定量离子和确认离子的比例 315 -> 193 定量离子积分 超出门槛值时, 会以深蓝色表示 Target(193) Q1(259) 318 -> 196 内标离子积分 Target(196) Q1(262)

39 积分参数 -Free Integrator SD Baseline Offset Peak List (XML) Accepted Peaks Discarded Peak All peak list level and peak level info available Visualization of baseline regression Handling of merged peaks Peak validation Quality Factor and Traffic Light Coloring 处理低响应的尖峰数据自动设置阀值 - 适合 MRM 的多个峰的积分 Info messages

40 Batch-at-a-Glance: MS-MS Integrator The new parameter-less integrator specifically designed for triple quad MRM data proved to reliably integrate peaks down to and below the LOQ level without user intervention, eliminates the timely adjustment of integration parameters or manual reintegration

41 灵活的报告编辑器 Macros in Excel Adding Add tables and graphics via tool buttons Drag and drop additional columns from XML results Formatting of Font and numbers in Excel Print Preview in Excel

42 液相 / 三重串联四极质谱用于氨氯地平的生物等效性评价的研究 氨氯地平 (Amlodipine) 内标 : 尼莫地平 (Nimodipine)

43 液相色谱和质谱条件 LC Agilent mm i.d., 3.5 µm Eclipse Plus-C18 ACN/0.3% Formic acid, gradient elution, 0.4 ml/min at 30 C Injection volume: 5 µl MS Agilent Triple-Q 6410 Vap and Dry Gas: 40 Psi, 9L/min, 350 C HV capillary inlet: 4000V, HV End Plate Offest: -500V Skimmer: 15V, Fragmentor voltage: 100V Collision energy: 3V for all MRMs Precursor and product ion: m/z = for Amlodipine m/z = for Nimodipine Dwell time: 200ms for all MRMs

44 CID 产物离子扫描 氨氯地平 Amlodipine 尼莫地平 Nimodipine

45 分析的稳定性 I - 重复性和准确度 Name Type Level Acq. Date-Time Data File Exp. Conc. RT Resp. Calc. Conc. Final Conc. Accuracy RT Resp. Sample1 Cal :02 AM calibr21.d Sample2 Cal :09 AM calibr22.d Sample3 Cal :17 AM calibr23.d Sample4 Cal :24 AM calibr24.d Sample5 Cal :32 AM calibr25.d Sample6 Cal :39 AM calibr26.d Q1-2 RSD QC :33 AM 1017-RSD-r002.d Q1-2 RSD QC :40 AM 1017-RSD-r003.d Q1-2 RSD QC :48 AM 1017-RSD-r004.d Q1-2 RSD QC :55 AM 1017-RSD-r005.d Q1-2 RSD QC :03 AM 1017-RSD-r006.d ppb 浓度血浆提取样品, 连续五次进样 :RSD=5.2% 结果平均值 ppb, 准确度 :-3.7%

46 分析的稳定性 II - 工作曲线的日间重现 Name Type Level Acq. Date-Time Data File Exp. Conc. RT Resp. Calc. Conc. Final Conc. Accuracy RT Resp. Sample1 Cal :55 PM calibr11.d Sample2 Cal :02 PM calibr12.d Sample3 Cal :10 PM calibr13.d Sample4 Cal :17 PM calibr14.d Sample5 Cal :24 PM calibr15.d Sample6 Cal :32 PM calibr16.d 血浆提取物标准加入所得工作曲线, 浓度序列 :0.5, 1, 5, 20, 100, 200ppm 采集时间 Oct

47 分析的稳定性 II - 工作曲线的日间重现 Name Type Level Acq. Date-Time Data File Exp. Conc. RT Resp. Calc. Conc. Final Conc. Accuracy RT Resp. Sample1 Cal :02 AM calibr21.d Sample2 Cal :09 AM calibr22.d Sample3 Cal :17 AM calibr23.d Sample4 Cal :24 AM calibr24.d Sample5 Cal :32 AM calibr25.d Sample6 Cal :39 AM calibr26.d 血浆提取物标准加入所得工作曲线, 浓度序列 :0.5, 1, 5, 20, 100, 200ppm 采集时间 Oct

48 分析的稳定性 III - 质谱响应的长期稳定性 IS Peak area: 6624 IS Peak area: 6770 内标 :50 ppb 尼莫地平, 采集时间 Oct

49 分析的稳定性 III - 质谱响应的长期稳定性 连续工作 7 天, 血浆提取物进样 800 个之后 : IS Peak area: 6594 IS Peak area: 6523 内标 :50 ppb 尼莫地平, 采集时间 Oct

50 LC/MS/MS 在药物分析中的应用 ( 二 ) 药物分析和药物代谢动力学

51 血浆中大黄素的 DMPK 分析 HPLC: 25 o C column temperature; Eclipse Plus 2.1mm 50mm, 1.8um C18; ACN:H2O (5mm NH4Ac) = 1:1; 6ul injection;0.2 ml/min flowing speed MS: Neg ESI; 350 o C drying gas (10L/min);35 psi nebulizer pressure; negative mode; voltage 4000V; CE 40 V; fragmentation 100V; MRM transition > 181.9

52 大黄素在血浆基质中的线性关系 (1 ppb 200 ppb)

53 不同给药时间大黄素在血浆中的浓度

54 乌头碱类生物碱 LC/MS/MS 分析 0.1 ppb level 乌头碱 MRM:646-> 586 新乌头碱 MRM:632-> 572 HPLC conditions: Eclipse plus C18 (2.1*50mm, 1.8um); 50%methanol / 50%buffer (5mM ammonium Acetate + 0.1% Acetic acid); 0.3mL/min;Temp 40 o C Injection volume: 20uL MS condition: Dry Temp: 350 C Dry gas: 10L/min Neb gas: 40 Psi Collision energy: 37V Fragmentor: 100V 次乌头碱 MRM:616-> 556

55 乌头碱类生物碱线性关系 新乌头碱 次乌头碱 乌头碱

56 乌头药材中三种乌头生物碱成分的分析

57 Analysis 18 bile acids by Agilent 6410 QQQ Beijing COE Lab Chenchen Li Page 57

58 HPLC Parameters HPLC system Column Injection Volumn Flow rate : Agilent 1100 HPLC : Agilent Eclipse Plus C18, mm, 3.5 μm : 20 μl : 0.3 ml/min Temperature : 25 Mobile phase Gradient : A-Water + 15mM Ammonium formate; B-100% MeOH Time A% B% Flow-Rate (ml/min) Post time: 7 min Page 58

59 MS Parameters MS system : Agilent 6410 LC/MS/MS Ion source : ESI Polarity : Negative Nebulizer gas : Nitrogen Ion spray voltage : 4000V Dry gas temperature: 350 Dry gas : 10 L/min Nebulizer pressure : 35 psi Resolution : Q1 (unit) Q3 (unit) Delta EMV : 1000V Page 59

60 Extract Ion Chromatography (Conc.=20 ng/ml) Page 60

61 MRM list of 18 Bile acids with 6410 QQQ Bite acid Retention time (min) Precursor Ion Product ions Fragmentor Collision Energy (V) IS G-UDCA T-UDCA T-HDCA CA G-CA G-CDCA G-DCA *HDCA T-CA T-CDCA T-DCA *UDCA *CDCA DCA G-LCA *LCA T-LCA * 此类化合物以加合离子 [M+45] - 为母离子 Page 61

62 方法学数据 Bite acid RT (min) Linear range (ng/ml) R2 (weight) LOD * RSD% (ng/ml) IS ** ~ (1/x) G-UDCA ~ (1/x) T-UDCA ~ (1/x) T-HDCA ~ (1/x) CA ~ (1/x) G-CA ~ (1/x) G-CDCA ~ (1/x) G-DCA ~ (1/x) HDCA ~ (1/x) T-CA ~ (1/x) T-CDCA ~ (1/x) T-DCA ~ (1/x) UDCA ~ (1/x) CDCA ~ (1/x) DCA ~ (1/x) G-LCA ~ (1/x) LCA ~ (1/x) T-LCA ~ (1/x) * LOD 以 3 倍信噪比来计算 ** IS 出峰时间靠前, 建议换一极性合适的化合物作为内标 Page 62

63 The Reproducibility of Total Ion Chromatography ( Conc.= 20 ng/ml, n=5 ) Page 63

64 Extract Ion Chromatography (Conc.=5 ng/ml) Page 64

65 Extract Ion Chromatography (Conc.=1 ng/ml) Page 65

66 实际样品 由于实际样品浓度太高, 因此分别稀释了 10 倍,100 倍和 1000 倍分别测定不同组分的浓度 实际样品中 T-CA 的浓度最高, 比其他组分高出数倍 为使得测定浓度位于工作曲线线性范围之内, 使用 1000 稀释样品测定 T-CA 的含量 (TIC 见右图 ), 其他浓度组分使用 100 倍稀释样品测定 ( 左图, 不包括 T-CA 的局部放大图 ), 个别含量较低的组分使用 10 倍稀释样品测定 Page 66

67 折算出未稀释前实际样品浓度 Bile Acids Conc. (ng/ml) T-UDCA 2540 G-UDCA 442 T-HDCA CA 136 UDCA ND G-DCA 430 G-CA T-DCA T-CA DCA ND LCA ND G-LCA ND CDCA 50 T-LCA ND T-CDCA 5600 G-CDCA 265 HDCA ND Page 67

68 安捷伦的应用方案 高品质的工程设计 ( 低故障率 ) 易使用 高分离快速液相色谱 (RRLC) 与标准液相色谱 (HPLC) 实验室资源管理 智能化服务 多厂家仪器控制 法规认证服务 (Compliance CFR 21 Part 11) 整体解决方案

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