第 卷第 期 年 月 西安交通大学学报 医学版!"#$## %&'& & 基础研究 六磷酸肌醇对人骨肉瘤细胞株 和原代培养成骨细胞增殖的影响 戴 星 郭池华 韩学哲 马 巍 西安交通大学第一附属医院骨科 陕西西安 $ 摘要 目的 研究六磷酸肌醇 %!&'%&#&'#$ 对人骨肉瘤细胞株 ($ 和原代培养成骨细胞增殖的影响 并探求其抗癌效果的最佳作用浓度 方法 原代培养人成骨细胞并鉴定 复苏并常规培养人骨肉瘤细胞株 ($)) 法检测不同浓度 $ 干预培养时两种细胞的增殖情况 确定 $ 的最佳抑癌浓度 并进一步用流式细胞仪检测 ($ 细胞周期及凋亡情况 结果 当 $ 浓度 **&+ 时开始抑制 ($ 细胞增殖 在 **&+ 时达到最大 并呈时间 ( 剂量依赖性 当 $ 浓度为,**&+ 时 对成骨细胞增殖抑制不明显 **&+ 时轻度抑制 **&+ 时导致成骨细胞凋亡 结论 $ 能够抑制人骨肉瘤细胞 ($ 的增殖并导致其凋亡 其抗癌的最佳作用浓度为 **&+ 关键词 六磷酸肌醇 $ 骨肉瘤细胞株 成骨细胞 增殖 凋亡中图分类号 - 文献标志码. $,/!"#$!$!#$%%#!&'##%'# #$%'#%&&%# 0.1%!%(". 1"#(2#. 3#% 0#4*#!&54&#%'#6%4'.5%%#&'%&5 1%7!8%&&!!%9#4'%1%7!$%! ()*(# $( #(#!)*$ " ( #" + (## #*###&,( #""""(+& - (" # "(#(#(#!)*$&,"-."# ""##$+!"((##""#"!)*$ ###"+ -#( &,$##-(((/$+ +!)*$#(*"""(&,###" ((/+ #- (((&,$ ## -&,((/((/ +-+ +"&,- ((/ - +"&0 ## ((/ #"+& $ #+ #(#!)*$""&(##((/ #*###& +, -) #(#+ 骨肉瘤是骨外科最常见的恶性肿瘤之一 好发于血运丰富的干骺端 侵袭性强 血行转移发生率高 既往骨肉瘤仅限于手术治疗和化疗 患者的预后不 佳, 年生存率不足 近年来 随着新辅助化疗的出现 尽管骨肉瘤患者的, 年生存率明显提 高 但并未完全改善总预后 给社会和家庭造成 收稿日期 $(( 修回日期 (( 基金项目 中央高校基本科研业务费专项资金资助项目 &188, 西安交通大学第一附属医院院基金资助项目 &:;/ "&4##6"!*#!-#'#46"!'5&4##!4!%9#4'%%#' &188,!#6"!'&5#6%4'.5%%# &'%&51%7!8%&&!!%9#4'%&:;/ 通信作者 马巍 (*%*#%$$&* 优先出版!'!%!# *'#%$//-$*($(!"#"!
期 戴 星 郭池华 韩学哲 等 六磷酸肌醇对人骨肉瘤细胞株 ($ 和原代培养成骨细胞增殖的影响, 极大的负担 因此 寻找能够抑制骨肉瘤恶性生物学行为的新药物显得尤为迫切 六磷酸肌醇 %!&'%& #&'# $ 是从大豆中提取的天然化合物 作为一种植物营养素 却具有独特的抗癌作用 既, 往的研究已经证实 $ 能够抑制人结肠癌 乳腺 $ 癌 胰腺癌等多种恶性肿瘤细胞的生长 通过降低肿瘤细胞进入 0. 合成期 期 的比例 从而使细胞周期停滞在 期 最终抑制肿瘤细胞增 殖 但目前有关 $ 与人骨肉瘤细胞相互作用的研究较少 本研究观察不同浓度 $ 对成骨细胞和人骨肉瘤细胞株 ($ 增殖分化的影响. 材料与方法.. 材料 人骨肉瘤细胞株 ($ 取自本科实验室冻存细胞库 常规解冻复苏 检测细胞活力满意后使用 人成骨细胞取自新鲜骨组织标本 来源于西安交通大学第一附属医院骨科收住的因外伤致腰椎骨折的成年男性 患者年龄介于, 岁之间 经术前检查排除自身免疫性疾病 内分泌代谢疾病和肿瘤 正常骨组织取自因腰椎爆裂骨折而需行椎板减压术的椎板骨质 经患者本人签字同意后 报本院医学伦理委员会批准备案 所取材的骨组织样本离体后立即放置于 0(6 培养液中备用 细胞培养所用相关试剂购自 %& 公司 $ 购自 %*(.4% 公司 将其使用双蒸水溶解 无菌过滤后放置于 保存./ 人成骨细胞的原代培养与鉴定 在无菌条件下迅速清理骨表面软组织 分离骨内膜并将其剪切为 ****** 大小的碎块 胰酶消化后置于 培养箱内孵育 *%! 中和胰酶后加入适量 0(6 培养液 吸管反复吹打成细胞悬液 接种于培养瓶中 连续培养 后 待成骨细胞铺满超过瓶底 / 面积后 用,+ 胰酶消化传代 选择以下方法鉴定细胞以明确其为成骨细胞 形态观察 成骨细胞分离培养成功后 倒置显微镜下每日观察细胞贴壁生长情况 镜下可见成骨细胞呈三角形 纺锤形和不规则形态 胞质内有黑色颗粒状物并向外伸展 形成长短不一的突起伸出 并与邻近细胞伸出的突起相互交联 碱性磷酸酶染色反应 成骨细胞胞质中丰富的碱性磷酸酶 %!#&''#.+ 是成骨细胞的特异标志酶 应用改良的 &*&4% 氏钙钴法行染色 待细胞在无菌玻片生长融合至半汇合后取出 加入预先制备的孵育液 含蒸馏水 *++( 甘油磷酸钠,*++ 巴比妥钠,*++ *+ + *+ 调整混合液的 为 / 孵育后置于 + 硝酸钴中,*%! 后冲洗 再在 + 硫化胺中 *%! 相差显微镜下观察可见深褐色细胞核即为.+ 染色阳性 矿化结节染色 培养 后的成骨细胞具有形成矿化结节的能力 将其接种入培养皿 加入预先制备的诱导培养液 含,*+ 维生素 和 **&+( 甘油磷酸 隔天换液 培养 周后 < 冲洗 /,*++ 乙醇固定 *%!*++ 茜素红 ()4%'( 下孵育 *%! 冲洗并干燥 相差显微镜下观察.0(( 法检测 1 对人成骨细胞和人骨肉瘤细胞株增殖的影响 成骨细胞常规胰酶消化并制备细胞悬液 调整细胞密度为, *+ 接种于 /$ 孔培养板中 每孔加入 + 培养液 $ 组设, **&+ 共 个浓度 另设空白对照组 加细胞及普通培养液而不加 $ 和本底调零组 不加细胞的培养液 各浓度组的处理时间均为 每组设 $ 个重复孔 则成骨细胞组及 ($ 细胞各 个样本 常规培养 后 每孔加入 **+ 的 )),+ 随后加入 0,+ 酶标仪,!* 波长测定各孔. 值 每组取平均值计算细胞抑制率 = 实验组. 值 调零组. 值 对照组. 值 调零组. 值 根据 )) 实验结果 从初始 $ 的 个浓度中选择 个既能抑制骨肉瘤细胞的增殖 又不明显影响成骨细胞增殖的浓度 进一步通过流式细胞术筛选以确定最佳抑癌浓度. 流式细胞仪检测骨肉瘤细胞周期及凋亡率 常规胰酶消化制备 ($ 细胞悬液 调整细胞密度至, *+ 接种于 $ 孔板中 每孔 *+ 常规培养 后分别加入 $ 调整培养液容积并使 $ 的终浓度为 **&+ 加入等体积的 -($ 培养液作为对照组 每组设 $ 个复孔 则 ($ 细胞共 个样本 培养 后消化离心各组细胞 制备细胞密度为, *+ 的细胞悬液 以,4*%! 离心,*%! 弃上清液后加入 *++ )4%%!(1( 液 *+ 室温静置 *%!,4*%! 离心,*%! 弃上清液后加 + -. 酶水溶液 *+ 孵育 *%!,4*%! 离心,*%! 弃上清液后加,*+ *+ 混匀 避光冷藏 *%! 后上机检测 以每秒, 个细胞的速度检测 万个细胞 得到 和 期的百分比.0"1 双标法标记细胞和流式细胞仪检测骨肉瘤细胞凋亡 将 ($ 细胞同 进行分!"#"!
, 西安交通大学学报 医学版 第 卷 组 继续培养 每组设 $ 个复孔 则 ( $ 细胞共计 $ 个样本 常规胰酶消化细胞.!!#%! > 双标法标记细胞 即经 < 液清洗 次后收集细胞并用 的 %!%!"5#4 调为, *+ 取 + 细胞悬液加入,+.!!#%! 和,+ 染液 终质量浓度,*+ 轻轻振荡混匀 冰上避光 *%! 加入 %!%!"5#4+ 轻轻振荡 *%! 内进行流式细胞仪凋亡检测. 统计学处理 实验数据均以? 表示 应用 $ 统计软件 两组组内比较采用独立样本 检验 多组间比较采用单因素方差分析 组内均数的多重比较采用 +0 法, 为差异有统计学意义 / 结 果 /. 培养人成骨细胞的鉴定 倒置显微镜下观察可 见贴壁前的成骨细胞呈现为大小均一的类球体 传代细胞在 内贴壁 贴壁生长后细胞形态不规则 呈长梭形 鳞片形或短梭形 细胞表面出现较多的突起 培养第 天 细胞数量明显增多 细胞间出现连接 胞体增大 可见 个细胞核 培养第 天 细胞突起间广泛连接 呈铺路石样排列 单核呈椭圆形 生长期细胞可见分裂相 图. 随后胶原堆积及钙盐沉积 形成不透光矿化结节.+ 染色镜下可见大多数细胞胞质内及细胞核可见均匀分布的棕褐色颗粒 说明.+ 染色阳性 图 < 矿化结节染色可见成骨细胞培养第 周 镜下可见细胞密度较大 胶原堆积及钙盐沉积形成的不透光矿化结节 经茜素红染色后即成桔红色 边缘清晰的类圆形结节 图 图. 成骨细胞培养的形态学观察和染色鉴定 6% &4&&!'%!%!&5# ""4#&'#&''. 培养第 天 倒置相差显微镜下成骨细胞的形态 <.+ 染色阳性 钙化结节染色阳性 /0/(( 法检测 1 对人成骨细胞及骨肉瘤细胞增殖的影响,**&+ $ 对骨肉瘤 ($ 生长无明显抑制作用 **&+ $ 具有抑制 ($ 细胞增殖的作用且呈现剂量依赖性. 值分别为?,?? 同阴性对照组. 值? 比较差异具有统计学意义 =$,=,/,= $,$,**&+ $ 作用骨肉瘤细胞 细胞抑制率分别为,/ **&+ $ 作用时 ($ 细胞形态异于正常 培养液中大量细胞悬浮并坏死和细胞凋亡 抑制率大于 / 图,**&+ $ 对成骨细胞生长几乎无抑制作用 **&+ $ 对成骨细胞增殖稍有抑制. 值,? 抑制率在 以内 与对照组. 值,? 比较差异无统计学意义 =, 当 $ 浓度 **&+ 时. 值 /? 成骨细胞的增殖明显被抑制 抑制率大于 差异具有统计学意义 = 图 综合 $ 不同浓度对骨肉瘤细胞及成骨细胞增殖的影响结果 选用既较小影响成骨细胞功能 又能充分发挥抑制肿瘤细胞作用的 $ 浓度为 **&+ 作为下一步流式细胞仪检测的实验浓度 图 /(( 法检测不同浓度 1 培养! 时对细胞增殖的影响 6%5#'&5%5#4#! &!#!4%&!'&5$5#4&! #4&%5#4%&!&5 #'### )) /0 流式细胞仪检测 1 对 细胞周期的影响 **&+ $ 作用 ($ 细胞 后 ($ 细!"#"!
期 戴 星 郭池华 韩学哲 等 六磷酸肌醇对人骨肉瘤细胞株 ($ 和原代培养成骨细胞增殖的影响,, 胞进入 期的比例?,? 增加 与对照组 $? 比较差异具有统 计学意义 =$,,=, 图 图 (( 检测不同浓度 1 对 细胞周期的影响 6%5#'&5%5#4#! &!#!4%&!'&5$&! ($ # #. 对照组 <**&+$ 组 统计学分析结果 /01 对 细胞凋亡的影响 **&+ $ 分别作用于 ($ 细胞 后.!!#%! > 双标细胞并经流式细胞术检测 细胞凋亡发生率随着浓度增大和作用时间延长而明显增高 在各观 察时间点 **&+ $ 组的细胞凋亡,? 均强于 **&+ 组? 组间差异有统计学意义 =$, 多为早期和中期细胞凋亡 图 图 不同浓度 1 对 细胞凋亡的影响 6%5#'&5%5#4#! &!#!4%&!'&5$&! ($ #&&'%'. 培养 时 对照组 ($ 细胞的凋亡情况 < 培养 时 **&+$ 组 ($ 细胞的凋亡情况 细胞进入早期 中期凋亡的比例明显高于对照组 统计学分析结果 随着 $ 浓度增大和作用时间的延长 ($ 细胞凋亡发生率明显增高 讨 论 $ 作为从植物中提取的天然有机化合物 因其强大的抗癌效果而被誉为 天然抗癌斗士 经过近 年的研究 尽管 $ 抗癌作用的详细机制仍不明朗 但 $ 已经在多个肿瘤细胞系上展示了其广谱的 /( 抗癌活性.00 等发现 $ 能够抑制人乳腺癌 肝癌 结肠癌等肿瘤细胞株的增殖 并抑制肿瘤细胞表皮生长因子的表达..-3.+ 等 证实 $ 能够抑制雄激素依赖性前列腺癌 + 细胞的增殖 $ 通过促使 + 细胞周期停止于 期 最终导致其凋亡 同时 $ 这种抑制效应呈时间 剂量依赖性 研究发现 $ 抑制培养 # 细胞的生长 并诱导其分化为恶性程度较低的表 型 但是 目前国内外尚无有关 $ 对骨肉瘤细胞的相关报道 本实验用不同浓度 $ 培养 $ 在较低浓度,**&+ 时 对骨肉瘤细胞株 ($ 的增殖没有抑制作用 随着作用浓度的增大 当 $ 浓度 **&+ 时 $ 能够明显抑制 ($ 细胞的增殖 并呈现出时间 剂量依赖性 当 $ 浓度为 **&+ 时 $ 表现出较强的细胞毒性 对 ($ 细胞的抑制亦达到最大 故 **&+ 为 $ 最强抑癌浓度 但同时也观察到 $ 对成骨细胞增殖的影响却与其浓度变化呈现非线性变化趋势 即当 $ 浓度为 **&+ 时 $ 明显干扰了成骨细胞正常的!"#"!
,$ 西安交通大学学报 医学版 第 卷 增殖并导致其凋亡 而当 $ 在较低浓度, **&+ 时 均对成骨细胞的抑制作用不明显 因此 当 $ 浓度为 **&+ 时 对成骨细胞的干扰作用最小 而对骨肉瘤 ($ 细胞的抑制效果较好 为最佳作用浓度 骨肉瘤是一种多病因参与 多阶段病变的复杂疾病 疾病的发生发展与细胞增殖凋亡异常 细胞周期紊乱 线粒体功能异常等相关 因此 针对骨肉瘤紊乱的传导通路中多信号分子同时抑制的药物将优于对单信号分子抑制的疗效 这种一个药物对多个靶点的治疗方案也将成为骨肉瘤治疗的研究及发展方 向 >; 等研究认为 $ 可能并不直接参与细胞周期的调控 肿瘤细胞的增殖 分化和促凋亡可能归因于较低的磷酸肌醇磷酸盐 如 (, 本实验中所添加的外源性 $ 进入细胞后 可能通过胞饮作用和 或 受体介导的细胞内吞作用以及去磷酸化后形成的次级磷酸化形式等途径在细胞内进行运输 因此 $ 发挥的抗癌作用可能不是只局限于其单一分子本身 而是通过其次级磷酸化形式或是 $ 及其次级磷酸化形式而共同发挥作用的 本实验已明确了 $ 对骨肉瘤细胞增殖的抑制效果和其最佳抗癌浓度 未来将在此基础上 进一步观察活体状态下 $ 对骨肉瘤组织恶性生物学行为的影响 同时探索 $ 在活体内的代谢通路和靶蛋白 明确其对骨肉瘤增殖抑制的具体机制 参考文献 10//$0' 10&" (( +(# "##&0#"0"!" $*& 011)110!$0/'!&"* #((-( (- "2#( "( #( " (#&$# /$,*& $)//!// 3!0/ 0&1##& 10*1#1,$,*/& '0,130*!$0/ /010!&##"** ####&!./../ *&, 付敏 宋扬 李馨 & 肌醇六磷酸和肌醇联合应用对结直肠癌肝转移血管生成因子的影响 & 营养学报 $$$*& $0'%3/3%1'3$0!$' 0!&* $+. ##(* &#"#"&0##,0$*$/& $!0$'0))$013$'& $0(#### &$//*& $110/0$3%0/4&# ##""" #""(####(&# */& /!03$)05$40)'$&!" (-#+ )4*++ ###&0# 1 $,*,$& 41/!&##"$+"*#( *#0 (#-&1(!"/*& %1'3$0!$' 0!&### + " $"&'1#$,,/*,& 0)0,0/10'0/03$!$$') &* +-""#)" #""*""(##* (/'1#&1#$,$$*$,/& $04 '$0 '!'' &*# ##+$*/#* ####&!$#,,*,,& %1'3$0!$' 0!&1#++ * $"4(+ ## &'$*$& 编辑 国 荣!"#"!