中国中西医结合杂志年月第卷第期!" # 黑蒜提取液对 ) 肺癌细胞株的放疗增敏作用杨桂青王东王义善王园园杨柯摘要目的探讨黑蒜提取液!(/ (!)/ (/ % 对肺癌 ) 细胞放射敏感性的影响方法采用法测定 % 作用后肺癌 *) 细胞增殖率平板集落形成实验观察 %

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卒洪
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1 黑蒜提取液对 *) 肺癌细胞株的放疗增敏作用杨桂青王东王义善王园园杨柯摘要目的探讨黑蒜提取液!(/ (!)/ (/% 对肺癌 *) 细胞放射敏感性的影响方法采用法测定 % 作用后肺癌 *) 细胞增殖率平板集落形成实验观察 % 联合放疗对细胞克隆形成率的影响 2 /- 荧光染色观察细胞形态的变化流式细胞仪检测 % 作用后细胞周期的变化 3(! )43 检测淋巴细胞瘤 /! 凋亡促进蛋白 (3# 的表达结果 % 对肺癌 *) 细胞株生长有明显的抑制作用 % 联合 $ 射线照射能够促进 *) 细胞凋亡诱导 * ) 细胞的 % 期阻滞明显降低 /! 表达促进 ( 高表达结论黑蒜提取液对肺癌 *) 细胞具有放射增敏作用其增敏机制可能与其改变细胞周期及影响 /!( 蛋白表达有关关键词黑蒜提取液 *) 肺癌细胞放射敏感性 3(5) +))6() + 77/ 7!(/ %(!)/ (/ + + (+/!! )+ *)!! 8#% %)9)+#% 0 +#% 8)-(+#% 8(+,(+(+5 8#% : #() +(! :, 0;(+ 7 (+, +() 5)/)+# +(()/ + 7 0)(+ ) (+5 ( !, '- 2 ;)(! 7-4 ;! )() +, -(+5 + $& -)+( 3 1/) ;! - (5) +))6() + 77/ 7!(/ (!)/ (/ % +!+ /(+/ /!!!)+ *) /!!" )+-))) + ( 7!+ /(+/ /!! (7 % (/) + *( 5/5, " 77/ 7 % / )+5 (5) -(;, + - /! +, 7 () + ( *( 5, /! +)+ 7 () + ((," -(+ 7 - /!! ;-!, * 5, 2 /- ()+)+" -(+ 7 - /!! /,/! * 5/5, 7! * /,," 3(! ) 43 *( 5 5/ 3# ;) + 7 /! (+5 (" 3! % /!5 -( )+)7)/(+ )+-)), (/) *- 7!+ /(+/ *) /!!" - / )+() + 7 % (+5 (5) -(;,, $ )+)7)/(+!, )+5/5 *) /!!(; ; ) )+ % ( )!, 5/(5 - ;) + 7 /! (+5 ;!(5 - ;) + 7 (" +/!) + % /!5 +))6 -!+ /(+/ *) /!! ) +)6)+ )(5)() +" -) 77/ )- ; (!, /(5, /-(+)+ - /!! /,/! (+5 (77/)+ ;) + 7 ( (+5 /!" :8130!(/ (!)/ (/*)!+ /(/)+ ( /!!(5) +))6() + 肺癌是目前严重影响人类健康的恶性肿瘤放射治疗是肺癌的重要治疗手段之一放射增敏剂可以增加放射治疗对肿瘤细胞的杀伤力随着中医学与现代医学的发展中西医结合治疗肿瘤已经逐渐被接受并广泛应用于临床中药在肿瘤防治中具有不可替代的作用中药增敏剂已成为目前肿瘤研究的热点黑蒜是将新鲜优等生蒜投入到发酵箱采用特殊技术经过一系列特殊工艺加工而成黑蒜基金项目全军科技攻关项目 # " $%& 作者单位解放军第 ' 医院国家中西医结合肿瘤治疗重点专科全军肿瘤无创诊疗中心山东烟台 $& 通讯作者王义善!()!*(+,)-(+. $"/ 01 '$$ 中含有硫化合物大蒜素烯丙基半胱氨酸艾乔恩氨基酸硒锌及多种维生素等现代医学研究证明黑蒜具有抑制亚硝胺合成抗氧化保护机体 # 亚硝胺氧化损伤促肿瘤细胞凋亡等作用已有研究证明黑蒜的主要成分大蒜素具有抗肿瘤和辐射保护作用 & 但黑蒜对肺癌的放射增敏研究未见报道本实验通过观察黑蒜提取液联合钴 $ $ 射线对肺癌 *) 细胞株的影响研究黑蒜提取液对肺癌的放射增敏作用并初步探讨其可能机制材料与方法细胞系试剂及仪器 *) 肺癌细胞株购自中国医学科学院药物研究所黑蒜大连华谷蒜业有

2 限公司 0 高糖培养基 ' 已灭活胎牛血清美国 2,/! + 公司 2 /- 荧光染料 %)( 染液 $ 试剂美国 )( 公司胰蛋白酶,;)+#1$$ 美国 / 公司 01$' $ 安徽安特化工有限公司细胞周期试剂盒 & 上海贝博公司 3#) 4!0 反转录试剂盒 0$ 3(! )43 试剂盒 0 大连 (:(3( 公司数控超声波清洗器 :0 旋转蒸发仪 3 上海越众仪器设备有限公司酶联免疫检测仪 : 美国 - )- 公司医用直线加速器 8<$ 美国西门子公司显微镜荧光显微镜 ' 培养箱 22& 上海东星建材实验设备有限公司流式细胞仪 (!) 美国 0 公司 3 + 3(! ) 43 扩增仪澳大利亚方法细胞培养将 *) 细胞培养于含 = 灭活胎牛血清青链霉素各 < 的 0 培养液中置于 ' = 1 饱和湿度孵箱中无菌培养细胞倍增时间为 & - 黑蒜提取液的制备称取并捣碎果脯膏状黑蒜瓣成酱常温下加 = 乙醇至搅拌均匀浸泡 & - 后数控超声波清洗器清洗 )+ 真空过滤重复过滤滤渣旋转蒸发仪中浓缩滤液至温度 &' 以比例于 = 生理盐水中溶解混匀相当于生药滤膜过滤除菌 & 储存备用法检测细胞增殖率收集对数生长期 *) 细胞轻轻反复吹打细胞悬液使之均匀后吸取细胞悬液加至台盼蓝中混匀计算四角大方格内的细胞数细胞计数完毕后以每孔个接种于 $ 孔培养板 & - 后分别加入终浓度为 &$ 的黑蒜提取液样品同时设 *) 细胞对照组 = 01 每个药物浓度设个复孔于 ' = 1 培养箱中继续培养 &&' - 后每孔加溶液继续孵育 & - 后每孔加入 01 振荡 )+ 用酶联免疫检测仪在测量波长 ' + 参考波长 $ + 处测得吸光度值实验独立重复次取平均值并计算细胞增殖率细胞增殖率 = > 实验组值对照组值 = & 平板集落形成实验检测克隆形成率取对数生长期 *) 细胞用 = 胰酶消化并吹打制成单个细胞悬浮液含 = 胎牛血清的 0 培养液倍比稀释到所需体积使细胞浓度为 $ 个培养瓶接种 $ 瓶分别加入终浓度为 & $ 的黑蒜提取液同时设 *) 细胞对照组 = 01 细胞贴壁 & - 后不同浓度黑蒜提取液组分别给予 $ 垂直照射 %, 剂量率为 / %,)+ 源皮距为 / 下同照射后即用 = 胰酶消化并吹打制成单个细胞悬浮液反复倍比稀释计数每培养皿接种个细胞每组设个平行样本置 ' = 1 培养箱中培养 & 天后取出吸取培养液洗涤固定 %)( 染液染色干燥在显微镜计数大于个细胞的克隆数计算克隆形成率克隆形成率 = > 实验组细胞克隆数对照组细胞克隆数 = 2 /- 荧光染色观察细胞形态变化取对数生长期 *) 细胞调整细胞密度为 & 个的单细胞悬液接种于 $ 孔培养板置 ' = 1 饱和湿度恒温培养箱培养 & - 分别加入的黑蒜提取液分别为照射组黑蒜低剂量加照射组黑蒜高剂量加照射组以最终浓度 = 01 为 *) 细胞对照组细胞贴壁 & - 后个照射组分别给予 $ 照射 %, 弃培养基固定 )+ 洗涤加入 2 /- 染色液使其终浓度为冰上染色洗涤紫外光激发荧光显微镜下 & 观察细胞形态并拍照 $ 流式细胞仪检测细胞周期细胞以个密度接种于培养瓶中于 ' 培养箱内培养 & - 待细胞贴壁生长后分别加入的黑蒜提取液分别为照射组黑蒜低剂量加照射组黑蒜高剂量加照射组以最终浓度 = 01 为 *) 细胞对照组细胞贴壁 & - 后个照射组分别给予 $ 照射 %, & - 后胰酶消化细胞洗涤离心弃上清液固定加入等体积 4 染液 & 放置 )+ 应用流式细胞仪检测细胞周期情况 ' 3(! )43 检测淋巴细胞瘤 /! 凋亡促进蛋白 ( 3# 表达细胞以个密度接种于培养瓶中于 ' 培养箱内培养 & - 待细胞贴壁生长后分别加入的黑蒜提取液分别为照射组黑蒜低剂量加照射组黑蒜高剂量加照射组以最终浓度 = 01 为 *) 细胞对照组细胞贴壁 & - 后个照射组分别给予 $ 照射 %, & -

后收集各组细胞 3#) 4! 提取总 3# 反转录成 /0#/! 3# 上游引物序列为 % %%%%% 下游引物序列为 %% ( 3# 上游引物序列为 %%%%% % 下游引物序列为 %%%% 配制反应体系将试剂 833 4) (9 43 3 4)! 0# 模板及 ' 52 1 共液体混匀置于 3(! ) 43 扩增仪按照 3(!

3 后收集各组细胞 3#) 4! 提取总 3# 反转录成 /0#/! 3# 上游引物序列为 % %%%%% 下游引物序列为 %% ( 3# 上游引物序列为 %%%%% % 下游引物序列为 %%%% 配制反应体系将试剂 833 4) ( )! 0# 模板及 ' 52 1 共液体混匀置于 3(! ) 43 扩增仪按照 3(! ) 43 反应程序 43 反应 $ & 个循环溶解曲线分析基因改变统计学方法应用 4 ' 统计软件进行数据处理计量资料以表示多组比较采用单因素方差分析多个样本均数两两比较方差齐者采用 0 检验方差不齐者采用 (-(+ 多重分析 4? 为差异有统计学意义结果黑蒜提取液不同浓度组细胞增殖率比较图相同时间内黑蒜提取液对细胞生长抑制作用随药物浓度的增加而加强与 *) 细胞对照组比较差异均有统计学意义 4? 相同浓度的黑蒜提取液对细胞生长抑制作用随作用时间的延长而加强 4? 注与 *) 细胞对照组比较 4? 4? 与浓度组比较 4? 与 & 浓度组比较 4? 与 $ 浓度组比较 4? 与浓度组比较 4? 图黑蒜提取液不同浓度组克隆形成率比较各组细胞形态比较图荧光显微镜下观察可见 *) 细胞对照组细胞多数呈现弥散均匀的荧光线照射及黑蒜提取液联合线照射作用 & - 后细胞出现典型的凋亡形态学变化与 *) 细胞对照组比较照射组细胞核呈波纹状部分染色质出现浓缩状态黑蒜低剂量加照射组细胞核的染色质高度凝聚边缘化黑蒜高剂量加照射组细胞膜膨胀部分细胞核裂解为碎块注与本组 & - 比较 4? 与本组 & - 比较 4? 与 *) 细胞对照组比较 4? 与浓度组比较 4? 与 & 浓度组比较 4? 与 $ 浓度组比较 4? 与浓度组比较 4? 图黑蒜提取液不同浓度组细胞增殖率比较黑蒜提取液不同浓度组克隆形成率比较图与 *) 细胞对照组比较不同浓度黑蒜提取液联合照射组的克隆形成率均明显下降 4? 4? 且呈剂量依赖性注为 *) 细胞对照组为照射组为黑蒜低剂量加照射组 0 为黑蒜高剂量加照射组图 & 同图各组细胞凋亡形态比较 2 /- 荧光染色 & & 各组不同细胞周期比例比较表与 * ) 细胞对照组比较黑蒜高剂量加照射组黑蒜低剂量加照射组及照射组 %% 期期细胞比例明显减少 % 期细胞比例明显增加 4? 与照射组比较黑蒜低剂量加照射组及黑蒜高剂量加照射组 % % 期期细胞比例明显减少 % 期细胞比例

4 明显增加 4? 与黑蒜低剂量加照射组比较黑蒜高剂量加照射组作用更明显 4? 表各组不同细胞周期比例比较 = 组别 + % % 期期 % 期 *) 细胞对照 $ ' & $ ' & 照射 $$ $ $ ' & 黑蒜低剂量加照射 & ' 黑蒜高剂量加照射 & '& ' 注与 *) 细胞对照组比较 4? 与照射组比较 4? 与黑蒜低剂量加照射组比较 4? 图 & 同各组 /! ( 3# 表达比较图 & *) 细胞对照组照射组黑蒜低剂量加照射组及黑蒜高剂量加照射组 /! 3# 相对表达量分别为 ' ( 3# 相对表达量分别为与 *) 细胞对照组比较照射组黑蒜低剂量加照射组及黑蒜高剂量加照射组 /! 3# 表达均明显降低 4?( 3# 表达均明显升高 4? 与照射组比较黑蒜低剂量加照射组及黑蒜高剂量加照射组 /! 3# 表达均明显降低 4?( 3# 表达均明显升高 4? 与黑蒜低剂量加照射组比较黑蒜高剂量加照射组作用更明显 4? 图 & 各组 /!( 3# 表达比较讨论目前肺癌已经成为严重危害人类生命和健康的主要疾病之一 &= 的肺癌患者诊断时已是晚期年生存率不到 = 年全世界万人被诊断为肺癌万死于肺癌肺癌生存率自 $ 年至今没有发生改变 $ 放射治疗在肺癌的治疗中具有重要作用但放射性肺炎放射性食管炎以及晚期的肺纤维化食管狭窄神经病变等放疗副反应严重影响患者的生活质量精确的诊断及正确的放射治疗方案可有效提高放射治疗效果但放疗增敏剂的应用是我们更应该寻求的新路径至今人们在肿瘤放射增敏方面做了大量研究工作中医药具有广阔的开发前景目前已有研究证实复方苦参注射液蝎毒及含三氧化二砷 ' 的中药制剂可增加辐射敏感性大蒜为多年生草本植物百合科葱属性温味辛平入脾胃经可杀虫消肿止痛止泻止痢近年来国内文献在其抗恶性肿瘤的药理实验研究方面报道较多主要针对其主要成分大蒜素研究证实大蒜素对肿瘤细胞的抑制活性很强抗瘤谱广副反应小而且有抗病毒增强人体免疫力等作用黑蒜是将大蒜在一定温湿度条件下运用独特工艺在长达个月的时间内慢慢发酵而成不仅利于保存而且提高了其抗氧化性等通过实验发现黑蒜提取液不仅能够提高小鼠血清超氧化物歧化酶谷胱甘肽及脾脏胸腺指数而且能够促进 %' 胃癌细胞的凋亡本实验及集落形成实验结果表明黑蒜提取液对 *) 细胞具有生长抑制及辐射增敏作用大量研究表明细胞放射敏感性与细胞凋亡密切相关 & 通过荧光显微镜下观察可见黑蒜提取液联合放疗作用 & - 后细胞出现典型凋亡形态学变化表明黑蒜提取液联合放疗对 *) 细胞具有促凋亡作用能增强 *) 细胞株放射敏感性射线对增殖期细胞杀伤力远大于静止期细胞对 % 期更为敏感调动期或 % 期进入对放疗相对敏感的 % 期是放疗敏感性研究的一个重要方向本研究显示黑蒜提取液能诱导 *) 细胞的 % 期阻滞提高 *) 细胞放射敏感性 /! 能够增加细胞对凋亡刺激因素的抵抗力而阻止细胞正常生理凋亡 / 蛋白可抑制细胞死亡和延长细胞寿命是目前公认的抗凋亡基因 ( 作为一种促细胞凋亡基因与 /! 两者可形成同异源二聚体共同调控细胞凋亡当外界的刺激使 /! 表达增强时 /! 与 ( 结合成异源二聚体抑制 ( 的促凋亡作用减少肿瘤细胞的程序性死亡当 ( 蛋白大量表达并与 /! 形成异源二聚体或 ( 蛋白自身形成同源二聚体时则加速细胞凋亡 $ 本实验结果表明黑蒜提取液可以明显降低 /! 表达促进 ( 高表达从而发挥对 /! 的拮抗作用促进肿瘤细胞的凋亡发挥对 *) 细胞辐射增敏作用综上所述黑蒜提取液对肺癌 *) 细胞具有放射增敏作用其增敏机制可能与其改变细胞周期及影响 /!( 基因表达有关这将为临床提高肺癌放射敏感性提供新的治疗选择和实验依据进一步的验证仍待深入研究

5 参考文献杨桂青王园园王义善 " 黑蒜的成分及抗肿瘤机制研究进展中国医师杂志 & & $ :) 2+ 8:(+ 02 (!" 4-,)/(! ()!), (+) )5() ; ;) (+5 ;- ; /) 77/ 7 ( 7+/) +(!)65 7!() + / +()+)+!(/ (!)/ (/ 4- /- 4- )! )! ' & 4 < " +5))5(! 5)77+/ + )+ )!(, (/)), 7 (* (+5!(/ (!)/ (/ )+ -(+ ;)(, )+ /!! + ;-((/! + )/! & & $ $$ & 范婷蔺新英赵妍等 " 大蒜素对小鼠辐射损坏的辅助保护作用环境与健康杂志 ' & ' ' :() (; /),(+ *)- % (!" ; ;!)/() )5!+ /(+/ ()+, ()+ 4 / ( /(+/ /+ ; ;!() + - (/ (5) (/ & & $-)() :#(((*( (!" < 7 0% 4 )+ (5)() + (+ ;!(++)+ 7 - (/)/ /(+/ +! ()+ ' 任庆兰吴永忠陈晓品等 " 三氧化二砷对肺癌移植瘤的放疗增敏效应癌变畸变突变陈芳黄小陆梁林等 " 复方苦参注射液对人宫颈癌细胞株 2!( 的体外放射增敏作用广东医学 ' & && 纪宁朱蕙霞季斌 " 艾迪注射液对肺癌细胞 & 放射增敏作用的实验研究实用肿瘤杂志 $ $ ) (!" ;)+(! 5, + )+-)), 77/ 7 5)(!!,!!7)5 + *- (+5 )+() + 7 -(+ (/ ( %$ /!! 2(6- + <+) /) /-+! 5 /) & (/)! :8)!(6 ()!) (!" +)( ) + 7 )+ ) (5) ; /) (+5 )+ ) (+) ) 5(+ (+5 (+))/ )(! (/)), 7 (!)/!! () ((/! /) $;;! &' ' 王鑫杨柯 " 黑蒜对肿瘤防治作用的研究进展实用医药杂志 '$ ' (+ (!" 5!(/ (!)/ (/ )+5/ )+-))) + 7 ()/ /(+/ /!! *- )+ ) (+5 )+ )! 5 3; $$ ' &2((5( 2((5( : <,(( 8" - +-(+/ + 7 (5) ; +, / )+5 ( + *)- /;-((+-)+ ) (// ;(+)5, - )+-))) + 7 0# 5(( ;() (+5 - )+5/) + 7 (; ; ) )+ (! 9( /!! /(/)+ ( + 1+/! & $ ' 0++ -)!! 3 + (!" 3(5) + ))6() + 7 /! + /(+/ /!!!)+, 5 /(! /-(+) 7 (/) + 1+/! 3 & & &&' && $, 5( " - /! 7()!,!( 7 - /!!!(!)7 5(- *)/- #( 3 (+/ $&' $$ 收稿 $ 修回本刊网站改版升级中国中西医结合杂志社网站自年月日起改版升级升级后的网站包含新闻会议征文论坛专家博客常用资料下载等功能同时新增全文下载功能读者可免费注册并登陆后进行免费下载欢迎广大读者点击查看欢迎各位作者读者访问我社网站 -;A***"/)"/+ 希望能够为中医中西医结合医学领域专业人员提供一个展示交流学习的平台本刊讯