汤芦艳 等 4 5 对体外正常人黑素细胞和角质形成细胞共培养模型中黑素合成功能的影响 害 在进展期白癜风患者表皮可检测到 持续 蓄积 其浓度远高于生理浓度 研究发现紫外线 2 辐射 2 2 照射可在体内产生 并促进 的增殖和有丝分裂 临床研究亦证实单独应用窄波 2 可在一定程度上治疗白癜风 提示 对

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1 复旦学报 医学版 6 对体外正常人黑素细胞和角质形成细胞共培养模型中黑素合成功能的影响 汤芦艳 李剑 傅雯雯 林晓 吴文育 袁晋 复旦大学附属华山医院皮肤科 上海 摘要 目的 探讨不同浓度 4 5 对黑素细胞 * 和角质形成细胞 = 共培养体系的细胞增殖 黑素合成及酪氨酸酶 8 表达的影响 方法 培养原代人表皮 和 建立共培养模型 采用 88 法测定细胞增殖 754 法测定细胞黑素含量 实时 / 方法观察 基因的表达 结果 和 以 B 浓度混合时 可形成稳定共培养模型 高浓度 4 5 作用下 共培养细胞增殖受到明显抑制 8 基因表达显著降低 低浓度 4 5 ** 作用下 细胞增殖受到轻度抑制 基因表达增高 结论 4 5 对 与 共培养体系的作用复杂 对黑素合成功能可呈现双向作用 关键词 黑素细胞 角质形成细胞 共培养 4 5 酪氨酸酶 黑素合成 中图分类号 6 D 文献标志码 3 6 & & 8 & (( * 8-* *9 * = * * * * * = 88* * 9* * / * - ( * *= *- 9B * ** 9 * * * - * & *= * 白癜风是人类获得性的色素缺失性疾病 发病率为 目前研究认为 其主要发病机制集中在免疫介导和细胞毒性反应引起的黑素细胞 * 的毁损 细胞间氧化应激反应的 增加可以导致 功能的受损 另有研究显示 表皮内白癜风样皮损内存在氧化应激反应导致的损 上海市科委基础处重点项目 (*9 * * *

2 汤芦艳 等 4 5 对体外正常人黑素细胞和角质形成细胞共培养模型中黑素合成功能的影响 害 在进展期白癜风患者表皮可检测到 持续 蓄积 其浓度远高于生理浓度 研究发现紫外线 2 辐射 2 2 照射可在体内产生 并促进 的增殖和有丝分裂 临床研究亦证实单独应用窄波 2 可在一定程度上治疗白癜风 提示 对表皮细胞及白癜风进程的影 响可能存在正向作用 目前关于 对 和角质形成细胞 = 共培养体系的作用未见报道 本研究尝试模拟人体内 与 作用状态 建立这两种细胞的共培养模型 用不同浓度 模拟外界氧化应激 观察对共培养模型中细胞的生长状态及酪氨酸酶 8 表达影响 材料和方法 材料 正常人 与 均来源于健康儿童 岁 包皮环切术后的包皮 由上海儿童医学中心提供 培养基为 培养液 培养基为 培养基 胰酶 ( 美国 公司 2 9 蛋白定量试剂盒 鼠抗人 上海碧云天生物科技有限公司 4 / 标记羊抗小鼠 美国 * 公司 和 共培养体系的建立 包皮用 酒精浸泡 洗 次 去除皮下组织 剪成 * * 的皮块 用 中性酶 消化 分离表皮层和真皮层 用 胰酶消化表皮 * 吹打成细胞悬液 用 培养基稀释 以 * 的细胞密度接种到 * 的培养瓶中 天后 待细胞长至 左右时传代 取 代的 用于实验 用 培养基稀释 以 * 的密度接种到 * 的培养瓶中 天后待细胞长至 左右时传代 取第 & 代的 用于实验 将 ( 溶解于 5 中制成 ** 的储存液 实验时用 4= 溶液稀释成终浓度 * 将培养至对数生长期的纯化 培养基弃去 洗 次 放入 * ( 溶液 置于 5 孵箱中 孵育 * 换 培养基继续培养 将原代培养的 和标记的 以 B 的比例混合 接种至 孔板 培养基与 培养基同样以 B 的比例混合 混合细胞加入混合培养液 置于 5 孵箱内培养 每天换液 次 显微镜下观察细胞共培养的生长 状况 & 不同浓度 6 对共培养细胞增殖的影响 将混合培养细胞接种于 孔板 培养 后 弃去培 养基 每孔加入不同浓度的 溶液 浓度分别为 和 ** 每个浓度设 个复孔 在细胞培养箱内继续孵育 后吸出上清液 88 配成 * * 每孔加入 88 终止反应 放入培养箱内继续孵育 后吸去上清液 每孔加入 5 用酶标仪在 * 处测定吸光度 - 值 细胞抑制率?& 加药后 - 空白对照 - 用以评价细胞增殖状况 不同浓度 6 对单独培养 和共培养 的黑素含量的影响 2 / 单独培养 和共培养 以 孔分别接种于 孔板 后换液 加药 培养 弃上清 每孔加入 胰酶 * 室温下消化 * 加入 * 培养液终止消化 取细胞悬液 进行细胞计数 其余以 * 离心 * 弃上清 加入 * 的 754* 震荡 * 孵育 用酶标仪在 * 处检测吸光度 - 值 不同浓度 6 对共培养 的 基因表达的影响 和共培养细胞以 孔分别接种于培养瓶 分别加入浓度为 和 ** 的 以培养液为空白对照组 作用 后终止反应 分别提取不同浓度 作用后各组细胞的总 7 定量 反转录为 7 并纯化回收 以纯化的各处理组细胞 7 为模板 用实时 / 法 2 法 检测不同浓度 作用后 的 基因表达量 反应体系 2 / / *-, 上游引物 下游引物 ( 稀释缓冲液 模板 反应体系中模板的量相当于 总 7 反转录的 7 量 单条特异引物在反应体系中的量为 * 反应条件 个循环 其中 结束时间为荧光信号检测点 每个反应均设 个复孔 采用 软件 公司 进行计算分析 以 基因作为内参 得出不同处理组基因的相对含量及其与未处理对照组的相对比值 基因 上游引物 下游引物 扩增长度为 4 基因 上游引物 下游引物 扩增长度为 统计方法 统计数据以 *E 表示 组间采用单因素方差分析 75 为差异有统计学意义 统计分析使用 / 统计软

3 复旦学报医学版./ 年 M 月 34 5 N/N 件处理 布满培养皿底部*9 原代培养 L.? 后可见少量细 长突起.3 周后细胞相 互连 接成 网 状图 J& P 与 以 的 比例 混合培养 生长 布 *9 _9 f3 L.? _9 结 果 满培养 板 表 面*9 散 布 其 中*9 与 _9 通 过 树 突 状突起发生 联 系随 着 培 养 时 间 的 延 长*9 与 _9? 7 共 培 养 体 系 的 建 立 _9 原 代 培 养 L.? 后可 见 多 角 形 细 胞呈 团 块 状.3 周 后 细 胞 通过突起建立的联系增多图 9& X 图 F 体外培养正常人表皮? 和 7 K = 2(.2(?(.7 F 8/2(.= J G B _9,* B B Z?? W W//`?3? = P G B.5N g.// _9- *9- B B Z?? W WK/` g.//?5? = B W B f3 *9_ X 9 - B W*9_9 f3 Y9XJ W B gn/2 B gn/ 不同浓度 TH5H 对共培 养 体 系 细 胞 增 殖 的 影 响 不同浓度 R.S. 加入共 培 养 体 系 后随 着 R.S. 浓 (I 时对 细 胞 增 殖 的 R.S. 浓度在 3 BB 抑制率约为.5` 3/` (I R.S. 浓 度 BB 度增加细胞增殖 受 到 明 显 抑 制表 R.S. 浓 度 时对细胞增殖的抑制率在.5` 以下表 (I 时对细胞 增 殖 的 抑 制 率 高 达 3L` 5BB 表 F 不同浓度的 TH5H 对? 和共培养体系的细胞增殖的抑制 cn B(4FE./ 4. - TH5H. = (.?(.,, 2 8 (I R.S. BB / //5 / 3 5 L *9 / /. 3L. 5. LM. *9h_9 /. /N..N. N/. N4. KK. L4. 4@- = / /5./ /2*9 - B Z Z?R.S.W N?2 7 不同浓度 TH5H 对体外培 养? 和 共 培 养 细 胞 黑素含 量 的 影 响 选 取 (I & 3 和 5 BB R.S. 分 别 作 用 于 *9 和 *9 (IR.S. 作用后黑素含量较空白对照明显 3BB 增强 / /5表. _9 共 培 养 体 系 表 H 不同浓度 TH5H 对? 和共培养体系的黑素含量的影响 B(4HM - TH5H.2 (.... -?(.,, B i4 cn (I R.S. BB / 3 5 *9 i /N MNi /K. 2 /Mi /L. 44i /K. *9h_9 i /. MNi /. 2.5i /M. 4i /. 4@ = / /5./ /2 *9 - B Z Z?R.S.W N4?2 7

4 汤芦艳 等 4 5 对体外正常人黑素细胞和角质形成细胞共培养模型中黑素合成功能的影响 不同浓度 6 对共培养体系中 的 基因表达的影响 浓度为 ** ** 时 基因表达受到抑制 表 时 基因表达增强 浓度 表 不同浓度 6 对共培养体系中 的 基因表达的影响 *6 & *E 4 5 ** E E E E E E E ( - * / * 讨 论 是一种强氧化剂 广泛存在于细胞内 在正常的生物代谢和生化反应过程中极易产生 低浓度时 能调节细胞的一些生理活动 如细胞繁殖 凋亡 碳水化合物代谢和血小板活性等 高浓度时 可以与金属离子 如 D D 发生 反应 或与超氧离子 5 & 发生 4 反应 产生羟自由基 引起表皮 增多的原因尚不清楚 目前认为有以下几方面原因 正常人体细胞中的有氧代谢及黑素合成过程会产生少量 紫外线照射会引起表皮 等活性氧物质增多 白癜风患者体内的自由基防御系统不平衡 最终也导致表皮内 增多 由于 酶的基因突变 使 酶活性降低 导致 升高 研究表明 对 和 均可产生影响 本研究通过建立人表皮 与 的稳定共培养模型 研究 对共培养体系的细胞增殖及 基因表达的影响 共培养体系比单独培养 更能模拟体内黑素显色过程 研究结果表明 不同浓度的 对共培养体系中细胞增殖有抑制作用 且呈浓度依赖性 与文献报道的 抑制单独培养的 & 增殖的结论一致 8 是黑素合成的关键酶 在白癜风发病中起到重要作用 本研究将不同浓度 作用于共培养体系 进一步观察到 基因表达在干预下呈现双相作用 高浓度 ** 对 基因表达呈抑制作用 这与其对 增殖的影响相一致 低浓度 ** 表现为促进 的基因表达 这与其对 增殖的影响不一致 但是低浓度的 作用于细胞后 以及共培养体系的细胞黑素含量均增加 提示较低浓度的 虽抑制细胞的增殖 但对细胞功能有一定促进 的作用 等观察到 ** 可激活 但在 ** 的 作用下 失活 说明低浓度 ** 对 的基因表达和活性均有促进作用 等 发现 和 ** 作用 对黑素合成和 8 活性无影响 当 ** 时对两者均有抑制作用 提示不同浓度 的效应不同 在较低浓度时对细胞生物学的抑制作用不明显 此外 作用时间不同也会导致观察结果的差异 本研究发现 对共培养细胞干预作用 后 去除 再培养 可以恢复和保持培养细胞的良好状态 这与国外的研究报道一致 因此我们选择 作为观察的干预时间 国外研究发现 在 ** 浓度水平可灭活许多蛋白 如 促 激素 其在 * 浓度水平却可促进转录因子 如 / 7 2 和许多抗氧化酶的上调 因此 目前对 作用的研究仍然有较多的问题需进一步探讨 本实验结果证实 对 的 基因表达具有双相作用 在 ** 时促 基因表达作用最强 同时轻度抑制细胞增殖 此浓度区间可作为进一步研究的浓度范围 这也将为指导临床应用紫外线治疗白癜风提供了一定的理论依据 参 考 文 献 / / * = * * 4 5 * 9-84 * 9*, * - * * * & 张勇 项蕾红 李剑 等 * 准分子光对人角质形

5 复旦学报 医学版 年 月 成细胞的凋亡 细胞周期和干细胞因子表达的影响 中华皮肤科杂志 & 罗增香 项蕾红 李剑 等两味中药单体对人黑素细胞酪氨酸酶活性及黑素合成的影响 中国麻风皮肤病杂志 & 李剑 傅雯雯 张勇 等中药单体芍药甙促进黑素合成的机理研究 中国麻风皮肤病杂志 & 解士海 陈志强 马鹏程 等人表皮黑素细胞与角质形成细胞共培养体外模型中黑素小体转运的观察 临床皮肤科杂志 & 8 * = * 9 * 李伟 林有坤过氧化氢与白癜风 国际皮肤性病杂志 & 杨红 王克玉 张向红 等过氧化氢对体外培养的黑素细胞形态及功能的影响 中国麻风皮肤病杂志 & & ( * 9- & 8 - *- & & 收稿日期 & & 编辑 段佳 上接第 2. 页 /. 2/( ( 3 * * -, * * * * & & 严炜 林金明雌激素类内分泌干扰物的液相色谱 & 质谱分析样品前处理方法 分析化学 & *., * * * & 5 /= 9, 9 9 * 9 9 *, * * 99 * * & 7 4= 89 ( 5 9 *5& *9 * & / * * 9 ** * * & & 4 * * * 9 & / /= * * 9 = - * & 收稿日期 & & 编辑 王蔚 2 = 7* =

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