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桐昆沈
5 years ago
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1 复旦学报医学版股骨头坏死 &(+ 患者滑膜组织来源的类成纤维细胞对人 #! 淋巴瘤 5' 细胞增殖的影响王翠何崇儒吴礼杨钟扬孙庆文复旦大学生命科学学院遗传学研究所上海第二军医大学附属长海医院骨科上海汕头大学医学院附属粤北人民医院骨科韶关摘要目的研究股骨头坏死 # 2#$ 2 '$0 患者滑膜组织来源的类成纤维细胞对人 ;6# 淋巴瘤 ;6#'!$';,*+ 细胞株增殖的影响方法首先分离和培养来自 0 患者滑膜组织的原代类成纤维细胞随后将其与 *+ 细胞共培养用细胞计数试剂盒 :& 检测 *+ 细胞的增殖情况用实时定量 3 *5###&#' 3 *5* &3 * 检测 *+ 细胞中及基因的表达水平结果 0 滑膜来源的细胞为贴壁的类成纤维细胞共培养组中的 *+ 细胞增殖速率显著高于单独培养组只培养 *+ 细胞相对于单独培养组共培养 $ 后及的表达量分别为及 $ 后则分别为及结论在共培养条件下 0 患者滑膜组织来源的类成纤维细胞可能通过调控 *+ 细胞中及的表达来促进 *+ 细胞的增殖关键词股骨头坏死 0 ;6# 淋巴瘤 ;, 共培养 *+ 细胞中图分类号 * 文献标志码 + &!$#$!2 # #! $#!"!!!!# #&(+! "# #!'# #! " 5 / 01 % $"& /,& " 01 " 0 "&4 # & )#"*#%&'# """ +"# "" $#" '# """ +"# 6&-7#$# "&'# "&)&" $!#! &$'!#"# #$2#22#& 6 4$ $2'#$ ' '2#$!# # 4#$# 2#$ 2 '$0 #$! 2 #2*+ 2'$';6#'!$' ;,!3' 2#& 6 2'#$ ' '2 0!# # 4## #$&# # ' 4 #$ 4#$ *+$! 2 # 2 *+ 4 # ' :& #$.! 2 '*0 *+ 4# '5###&#' 3 * 5* &3 *!"#$%&' 54 2

2 复旦学报医学版年月! $ 2'#$ ' '2 0 4$#2#& 6 $! 2 ## 2*+ &# "!4 "2 #$"$ #$#$# "!# *+ '! 4#$#$"!#$#.! '#2 '*0 2#&# 2$ &# "!4!#4!#2#&# 2 $ &###$ 2#& 6 2' ' ' 2 0!# # "2 #!'# #$! 2 #2*+ " #"#$.! 2 '*0 # # 2#$ 2 '$0 ;6#'!$';, &# *+ 股骨头坏死 # 2#$ 2 '$ 0 又称股骨头缺血性坏死 90 是临床上常见的以骨细胞和骨髓成分死亡以及股骨头结构改变为特征的疾病 0 主要可分为创伤性股骨颈骨折或髋关节脱位导致及非创伤性系统性红斑狼疮酗酒吸烟或高剂量皮质类固醇治疗史导致两类但在所有类型的 0 中股骨头供血不足或中断是引起 0 的直接原因 ;6# 淋巴瘤 ;6#'!$';, 被认为是人体中增长速度最快的恶性肿瘤之一是非霍奇金 ; 细胞淋巴瘤的亚类 ;, 通常侵犯中枢神经系统和骨髓是有着高复发率和不良预后的恶性肿瘤 *+ 细胞是 ;, 中一个具有代表性的细胞系皮质类固醇 # # 是一种高效的抗肿瘤药物目前在临床上已广泛应用于 ;, 的治疗长期接受高剂量皮质类固醇治疗的 ;, 患者可能会并发 0 # 等研究表明长期接受高剂量治疗的儿童急性淋巴细胞白血病患者患 0 的风险显著增加 0 是否对 ;, 有促进作用尚未见相关报导病理性成纤维细胞对肿瘤的增殖侵袭起着很大的促进作用将舌部鳞状细胞癌中癌相关成纤维细胞 & # 2# 及正常人成纤维细胞分别与鳞状细胞癌细胞系共培养后发现可通过调节肿瘤微环境标志物的表达来促进癌细胞的增殖和侵袭等指出在胃癌患者中来源于骨髓的纤维细胞可通过 (&* 信号通路迁移到胃癌微环境并作为促进肿瘤细胞的增殖本研究试图找出 0 患者病变部位滑膜组织来源的类成纤维细胞对 *+ 细胞增殖的影响是一个重要的抑癌基因在各物种间极为保守通过与 ( 31 ((;. & 及 / 等蛋白的相互作用参与生物多项重要生理活动如细胞周期调控细胞凋亡衰老突变修复肿瘤血管生成等是一种细胞周期素依赖性激酶抑制剂位于基因下游可依赖 3 的激活并间接参与细胞凋亡并与 3 ( #.#"#'## 等相互作用共同调节细胞周期基因转录细胞凋亡及 (0 修复等生物学功能发挥着癌基因与抑癌基因的双重功能 ( 是一个跨膜四蛋白家族 # #! 的细胞表面糖蛋白主要表达于血小板内皮细胞平滑肌细胞前体 ; 细胞上皮细胞及恶性细胞参与多种生物学功能包括细胞黏附运动细胞凋亡肿瘤转移信号转导细胞分化及精卵融合等对肿瘤的增殖也起着一定的促进作用材料和方法细胞来源本研究中 *+ 细胞系购买于, 类成纤维细胞由在粤北人民医院骨科实施全髋关节置换的 0 患者男岁汉族酗酒和使用史的滑膜组织分离而来作为对照的正常人的类成纤维细胞由股骨颈骨折 2 '62 # 0 患者分离而来对本实验的研究内容提供样品的志愿者知情同意粤北人民医院生物医学伦理委员会和复旦大学生命科学学院伦理委员会批准本项目细胞分离与培养原代细胞来自 0 患者

王翠等股骨头坏死 0 患者滑膜组织来源的类成纤维细胞对人 ;6# 淋巴瘤 ;,*+ 细胞增殖的影响髋关节的滑膜组织首先将滑膜组织剪成 '' 的小块加 ) 的胰蛋白酶加拿大 / # 公司在 7 下消化 $ 离心 "' 后在沉淀中加入培养基并轻轻吹打于孔板培养天后更换培养基并观察细胞贴壁情况随后进行传代为了确保细胞的稳定性和活性用第代细胞进行后续试验所有细胞均置于

3 王翠等股骨头坏死 0 患者滑膜组织来源的类成纤维细胞对人 ;6# 淋巴瘤 ;,*+ 细胞增殖的影响髋关节的滑膜组织首先将滑膜组织剪成 '' 的小块加 ) 的胰蛋白酶加拿大 / # 公司在 7 下消化 $ 离心 "' 后在沉淀中加入培养基并轻轻吹打于孔板培养天后更换培养基并观察细胞贴壁情况随后进行传代为了确保细胞的稳定性和活性用第代细胞进行后续试验所有细胞均置于 7) 及饱和湿度的细胞培养箱中培养类成纤维细胞的培养基为含有 ) 胎牛血清 2 # ' ; 青霉素 ', 和链霉素 "', 的 ( % 美国 1 公司 *+ 细胞的培养基为加有等量 ; 青霉素及链霉素的 *3 -& 美国 1 公司培养基每天更换一次细胞共培养将 0 来源的类成纤维细胞接种于孔细胞培养板中细胞密度为为世纪生物科技有限公司分别用于提取 *0 反转录以及检测基因表达水平用 3' 3 ' 软件设计引物由上海生工公司合成引物基因的引物序列扩增片段长度等信息见表基因相对表达水平计算公式为 # # # #" #"& # 2 " 以 & # 作为内参每个基因设置个重复所测 # 值取算术均值统计分析实验中所有数据均以 # 表示细胞生长和基因表达水平由 # # # # 检测为差异有统计学意义表 -)*# 实时定量 6 使用的引物序列 $-6# #)*# #! 6 1 ' 5 & '! 2 2"' #! 孔当细胞达到 ) 融合时分别加入及的 *+ 细胞共同培养同时培养相应浓度的类成纤维细胞 *+ 细胞及空白培养基 3 3 *1 11 * * 作为对照细胞增殖检测本实验中用细胞计数试剂盒 ( * :& 碧云天生物技术研究所检测 *+ 细胞的增殖情况在实验组及对照组的培养板中均加入 & # *1111 ) 的 :& 试剂于细胞培养箱孵育 $ 用酶标仪在 ' 波长下测量各孔的吸光度值每孔结果重复次在各时间点分别检测 *+ &# &# & ' ' & 0 & ' ' *+" *+"& ' ' 26 检测基因表达水平在共培养组及单独培养组中重悬 *+ 细胞分离上清液离心 " ' 收集后分别于和 $ 抽提 *0 *- 试剂美国 -#" 公司! * 反转录试剂及 ;* 荧光快速定量 3 * 试剂盒北京康细胞形态 *+ 细胞为圆形的悬浮细胞图 0 来源的类成纤维细胞为梭形旋涡状的贴壁细胞其细胞轮廓清楚多数细胞呈扁平的纺锤状图 ; 当 0 来源的类成纤维细胞与 *+ 细胞共同培养时可以清楚辨别两种细胞且两种细胞形态都未发生显著变化图图 -' 细胞和 &(+ 来源的类成纤维细胞单独培养及共培养时的细胞形态 + - # #"' $#$!2 # # &(+ "!!! #!!# *+ ;#& 6 2' 0!# # &# # ' 2*+ 2#& 6

复旦学报医学版年月 ' 细胞在共培养组及单独培养组中的增殖情况培养一定时间后在同一时间点上 *+ 细胞的数量在共培养组中要远高于单独培养组 *+ 初始密度为孔共培养组的 *+ 细胞数量高于单独培养组且在培养天后差异明显图在同一密度下共培养天时 *+ 细胞数量在两组间开始出现差异且在天时差异最大图细胞增殖检测结果显示随着时间变化 *+

4 复旦学报医学版年月 ' 细胞在共培养组及单独培养组中的增殖情况培养一定时间后在同一时间点上 *+ 细胞的数量在共培养组中要远高于单独培养组 *+ 初始密度为孔共培养组的 *+ 细胞数量高于单独培养组且在培养天后差异明显图在同一密度下共培养天时 *+ 细胞数量在两组间开始出现差异且在天时差异最大图细胞增殖检测结果显示随着时间变化 *+ 细胞在共培养组中的增殖速率高于单独培养组表为在不同时间点检测的共培养组及单独培养组的 *+ 细胞值当 *+ 初始密度为孔时培养 $ 后细胞数量在两组间开始出现差异培养 $ 后差异达到最大图 ; 当 *+ 初始密度为孔时培养 $ 后两组间的细胞数量开始出现差异培养 $ 后细胞数量差异最大此时共培养组中的 *+ 细胞数量为起始数量的倍而单独培养组中 *+ 的细胞数量为起始数量的倍图但用正常的人类成纤维细胞来源于股骨颈骨折患者滑膜组织与 *+ 细胞共培养时 *+ 细胞的增殖在两组间无明显变化图 ( 这表明在共培养条件下 0 来源的类成纤维细胞可以显著促进 ;,*+ 细胞的增殖图.' 细胞的增殖变化 +."# #! ' ;&# # '*+ 2#& 6 2' 0!# # 表. 不同时间点 2, 检测的 ' 细胞值变化 $. '!!$2,!#!! "! # # #2##'!# $ $ $ $ $ $ *+ *+ 0 $ $ $ $ $ $ *+ *+ 0 $ $ $ $ $ $ *+ *+ 0 0 #& 6 2'#$!# # 4#$# 2#$ 2 '$ 0#& 6 2'#$!# # 4#$2 '62 # $4 $.- 及 9 在 ' 细胞中的表达变化 5* &3 * 结果显示及的表达量在共培养组及单独培养组间的差异有统计学意义共培养及 $ 后相对于单独培养组的表达量分别下调倍倍图的表达量分别上调倍倍图 ; 在培养 $ 后表达上调倍培养 $ 后表达下调倍图

王翠等股骨头坏死 0 患者滑膜组织来源的类成纤维细胞对人 ;6# 淋巴瘤 ;,*+ 细胞增殖的影响图 &(+ 来源的类成纤维细胞对 ' 细胞增殖的影响 +!$#$!2 # # &(+ "!!!"# #!' -## 2*+ 4 4;-## 2*+ 4 4(-# # 2*+ 4 4 0 #& 6 2'#$!# # 4#$# 2#$ 2 '$ 0#& 6 2'#$!

5 王翠等股骨头坏死 0 患者滑膜组织来源的类成纤维细胞对人 ;6# 淋巴瘤 ;,*+ 细胞增殖的影响图 &(+ 来源的类成纤维细胞对 ' 细胞增殖的影响 +!$#$!2 # # &(+ "!!!"# #!' -## 2*+ 4 4;-## 2*+ 4 4(-# # 2* #& 6 2'#$!# # 4#$# 2#$ 2 '$ 0#& 6 2'#$!# # 4#$2 '62 ## *+ 图 1$4 $.- 及 9 的 ( 相对表达水平 + 1#! (3"# $4 $.-9 '*0 ; '*0 '*0 讨论本试验在成功分离 0 患者滑膜组织来源的类成纤维细胞的基础上将 ;, 细胞系 *+ 与之进行共同培养结果发现分离的细胞为扁平纺锤状的贴壁类成纤维细胞在与 *+ 细胞共培养后其能显著地促进 *+ 细胞的增殖在此过程中 *+ 细胞中及的表达量均发生了显著变化在共培养组中下调表达而在共培养组中的表达量上调在培养 $ 后的表达量升高但培养 $ 后表达量下降研究结果提示来自 0 患者滑膜组织来源的类成纤维细胞可以通过影响和基因的表达显著促进 *+ 细胞的增殖是治疗淋巴瘤的常用药之一但长期高剂量的治疗会增加患者并发 0 的风险本研究提示 0 可能会促进肿瘤细胞的增殖因此使用高剂量治疗淋巴瘤

6 复旦学报医学版年月特别是治疗 ;, 时并发的 0 对肿瘤增殖潜在的促进作用是一个值得关注的问题大多数 0 患者都伴有严重的滑膜炎症这可能在 0 病程进展中发挥着重要作用本试验中的类成纤维细胞从 0 患者滑膜组织分离出来推测 0 患者的滑膜组织能分泌调节 *+ 细胞中和表达的炎性因子从而影响 *+ 细胞的增殖在 0 患者组织活检中发现 3&3&- 3& - 3&-,& 及 0& 在股骨头部位均有表达 0& 在 0 患者的滑膜组织也能被检测到 0& 是一种常见的炎性因子在炎性反应中起着核心作用同时具有促进和抑制肿瘤生长的双重功能 0& 可通过调控 -:: 0&; 信号通路抑制肿瘤细胞凋亡从而促进肿瘤的发生用不同浓度的 0& 处理 *+ 细胞当 0& 浓度较低时可以显著促进细胞的增殖用!0& ; 信号通路的抑制剂处理 *+ 细胞可以通过抑制 0&; 信号通路来抑制细胞增殖其分子机制是通过抑制 0& 介导的 0&&:&-::&0&; 信号轴的活性来抑制 *+ 细胞的增殖在超过 ) 的肿瘤中能够检测到基因突变 *+ 细胞中的突变相当常见特别是在它的两个等位基因上同时检测到多个点突变将野生型的转入有此基因突变的 *+ 细胞中能够通过增加细胞的凋亡速率来抑制增殖过程证明对 *+ 细胞的增殖有着重要的作用在使用甲基强的松龙 ' #$! 油酸和亚油酸及标记有放射性碘的利妥昔单抗 -&#.' 处理 *+ 细胞后可以通过上调 3 的表达来抑制细胞的增殖过程本试验中通过将 0 患者来源的类成纤维细胞与 *+ 细胞共培养发现在共培养组中的表达量低于单独培养组差异有统计学意义这表明在类成纤维细胞的刺激下可以通过抑制的表达来促进 *+ 细胞的增殖用二甲基亚砜 ' #$2. ( (: 抑制剂 13 利妥昔单抗 #.' 及姜黄色素 ' 处理 *+ 细胞的表达上调阻滞了细胞周期进展从而抑制 *+ 细胞的增殖在以上过程中发挥着抑制肿瘤生长的作用然而当使用激酶抑制剂夫拉平度 2! 及鱼藤素 " 处理 *+ 细胞后可以通过下调的表达水平来调控细胞生长周期并诱导细胞凋亡从而抑制 *+ 细胞的增殖在此过程中发挥着癌基因的作用本研究中将 0 患者来源的类成纤维细胞与 *+ 细胞共培养后发现在共培养组中的表达量显著上调这表明在类成纤维细胞的存在下的表达上调促进 *+ 细胞的增殖由此可见作为癌基因并发挥着相应的作用研究发现在急性淋巴细胞白血病细胞系中表达的细胞较不表达 ( 的细胞具有更大的致癌潜能在 *+ 细胞系中可以通过组蛋白脱乙酰酶 $# # ( 上调的表达来促进 *+ 细胞的增殖同时 ( 可与 ( ( 及 ( 形成多分子复合体组成细胞表面四分子交联体蛋白网络参与 *+ 细胞的信号转导细胞粘附和移动本试验中将 0 患者来源的类成纤维细胞与 *+ 细胞共培养培养 $ 后 ( 在共培养组中的表达量显著高于单独培养组这表明在类成纤维细胞的刺激下 ( 的表达上调促进 *+ 细胞的增殖而培养 $ 后 ( 的表达量在共培养组中低于单独培养组产生这一现象的原因可能是由于共培养 $ 后 *+ 细胞密度过大致其进入凋亡过程在 0 患者骨组织的蛋白质组学分析中基因探针富集分析 " #$' # 1 % 显示在 0 患者中高表达的蛋白质基因组与成人细胞淋巴瘤发生相关的基因组相一致提示 0 与淋巴瘤的发生可能存在着某种关联本研究成功分离 0 患者滑膜组织来源的类成纤维细胞将其与 *+ 细胞共同培养发现在类成纤维细胞的刺激下通过调节 *+ 细胞中及的表达可显著促进 *+ 细胞的增殖这表明 0 可能会进一步促进淋巴瘤细胞的增殖因此在临床上使用高剂量治疗 ;, 时需特别注意并发的 0 对肿瘤的潜在促进作用尤其对于那些易于并发 0 的患者高剂量治疗方案的安全性需要进一步评估参考文献 &($" 1! 3#$" # $# 2# /"# "& $ '!# # '#$! 2

7 王翠等股骨头坏死 0 患者滑膜组织来源的类成纤维细胞对人 ;6# 淋巴瘤 ;,*+ 细胞增殖的影响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林琛莅钟雪云秦艳芳 -:: 在炎症与肿瘤中的作用中国病理生理杂志 9;" 1:+ 9%2#2 0&!$*+ #2# #'# ' #$ /$,",!!! "4#$2;6#'!$' #$"$# 2# 0&6!!; # $ $+03 # 0&!$!!#$'!## 6" 0&6!!; " "!#$4* + ;#"#3$64 6 # %2# 2 4 &#!! "#2!&'## '!$' ) " &; # 3'! *'!# #. # 2 *+.& :' 3 ;0 ' 1 ## '$' 2##. # 2 -&#.' *+(0" + 6#-3!! ;6#3 # #' # 4#$#.'$ ## 2& "6 '!$'(# ( ( #31#- #2!!# $' 6 ' #$(:$ # 13 李新刚陈燕吴青等姜黄素对人淋巴瘤 *+ 细胞组蛋白乙酰化作用的影响癌症 *#**'#,$ &!#6 $ #2!!# ' # # &!/-3.! '## 4$!!# ##"!!# $'6 ' " ( *$' 1# 3# ' $ #!# ##6 '!!# #$&!#6 $ #2! #$"$3: 0:& 0&6!!;&!#! + "*,, * " # 2# 2 "! 2 #2*+ ( $&2" ' " 0$' 6' ( # 4#$ # '!# # $' ;& # '!$#6 ' " "# # &,"$#;6 ; #! ( ' # $' '!$'! 2 # $# # ## " "# # & * # %, 0,"&1# (( ( ('! # 2 2 # #! #46 # #, &(* 9, # " 0&( & $"$",/" 3# ' 2 # 2!# # 4#$# 2#$ 2 ' $ + 收稿日期编辑段佳

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽

复旦学报 医学版 年 月! $ 2'#$ ' '2 0 4$#2#& 6 $! 2 ## 2*+ &# "!4 "2 #$"$ #$#$# "!# *+ '! 4#$#$"!#$#.! '#2 '*0 2#&# 2$ &# "!4!#4!#2#&# 2 $ &###$ 2#& 6 2' ' ' 2

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